农杆菌介导的山苍子遗传转化体系的构建

目的 筛选适合山苍子愈伤组织分化的激素比例,研究其对抗生素的耐受性,构建山苍子遗传转化体系。 方法 以山苍子无菌苗茎段诱导的愈伤组织为试验材料,研究不同激素浓度配比对山苍子愈伤组织诱导不定芽及不定芽生根的影响,探讨愈伤组织对潮霉素和头孢霉素的临界筛选浓度,并通过农杆菌介导法将外源基因导入山苍子愈伤组织中。 结果 筛选出诱导愈伤组织不定芽分化培养基为：MS + 2.0 mg·L−1 6-BA + 0.01 mg·L−1 IBA + 0.05 mg·L−1 TDZ,分化率为16.67%～36.67%;不定芽生根培养基为1/2MS + 0.5 mg·L−1 IAA,生根率为97.33%。遗传转化初期筛选抗性愈伤组织的潮霉素浓度为5 mg·L−1（约7～10 d）,通过逐步增加潮霉素浓度至30 mg·L−1进行筛选培养,头孢霉素最适浓度为300 mg·L−1。采用农杆菌介导法将外源基因转入愈伤组织中,并设计PCR引物进行鉴定,共检测16株抗性苗均含有目的条带,表明目的基因已插入山苍子基因组中,转化率为0.67%。通过Southern检测表明,目的片段已插入山苍子愈伤组织中。 结论 初步建立山苍子再生及遗传转化体系,且已获得多个基因的抗性愈伤组织,为进一步开展基因功能研究及遗传改良提供技术支持。     

农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化体系

【目的】优化杜仲叶片愈伤组织的再生体系,研究愈伤组织对抗生素和抑菌剂的敏感性,探索影响农杆菌介导杜仲愈伤组织遗传转化的最适转化因子水平,构建农杆菌介导的杜仲愈伤组织瞬时转化体系,使杜仲成年植株外植体为受体的遗传转化成为可能,为杜仲基因功能的研究与定向改良奠定基础。【方法】以杜仲成年植株叶片为材料诱导愈伤组织,通过添加不同浓度植物生长调节剂与大量元素的MS培养基进行不定芽的诱导与增殖,确定最适培养基。在此基础上,在培养基中添加不同浓度抗生素及抑菌剂,研究愈伤组织对其敏感性。以获得的叶片愈伤组织受体系统为基础,通过L_(16)(4~5)的正交试验,探索不同转化因子对农杆菌介导叶片愈伤组织遗传转化的瞬时转化效率的影响,建立最适瞬时转化体系。使用获得的瞬时转化体系对愈伤组织进行遗传转化操作,筛选抗性芽,对抗性芽进行GUS组织化学染色与PCR检验。【结果】再生体系优化的结果表明,3/4大量元素浓度的MS培养基能够促进杜仲愈伤组织不定芽的诱导及生长;愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS+0. 27μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,诱导率为83%±10. 0%;不定芽复壮的最适培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,平均伸长长度为(2. 47±1. 33) cm。抗生素与抑菌剂敏感性试验表明,遗传转化的选择培养基中,抑菌剂头孢霉素的最适浓度为200 mg·L~(-1),筛选用的抗生素卡那霉素最适浓度为70 mg·L~(-1)。转化因子的正交试验表明,最适的农杆菌介导杜仲叶片愈伤组织遗传转化的转化因子组合为:预培养5天、侵染10 min和共培养3天。使用最适瞬时转化体系对约200个愈伤组织进行遗传转化操作,共筛选获得3个抗卡那霉素的抗性芽; GUS组织化学染色显示GUS基因在抗性芽中得到了表达,PCR检测证明这些抗性芽中存在NPTⅡ基因。【结论】杜仲叶片愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS+0. 27μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,不定芽复壮的最适培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA。农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织瞬时转化体系为:预培养5天、侵染10 min和共培养3天,筛选培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA+200 mg·L~(-1)Cef+70 mg·L~(-1)Km。利用此体系共获得3个抗性芽,PCR分析和GUS组织化学染色都表明T-DNA已整合到抗性芽基因组中。     

农杆菌介导的喜树遗传转化(英文)

利用农杆菌介导法将与植物纤维素合成有关的纤维素合成酶基因导入喜树体内,并对影响遗传转化效率的几个因子进行了研究,建立了有效的喜树遗传转化体系。采用预培养的外植体在OD600(0.5)的农杆菌菌液中侵染10分钟,外植体与农杆菌侵染后在再生培养基上与农杆菌共培养三天,然后转入筛选培养基,获得了最佳的转化效率。Southern杂交结果证明UGPase基因已经整合到喜树的基因组中。在最佳的转化条件下获得了 6%的转化效率。这个转化系统对于利用遗传转化对喜树进行遗传改良是非常有意义的。     

根癌农杆菌介导的淡紫拟青霉遗传转化体系的建立

基于根癌农杆菌介导的遗传转化方法,选择植物线虫生防真菌淡紫拟青霉的分生孢子为受体,建立以G418为筛选标记遗传转化体系.通过优化遗传转化条件,达到较高的转化效率:1000～2400个转化子·10-6分生孢子.对转化子进行PCR验证,表明T-DNA已整合到淡紫拟青霉的基因组中,表型测定发现转化子的遗传表现稳定.农杆菌介导淡紫拟青霉突变体库的建立,为进一步筛选对植物线虫致病性高的突变体、了解淡紫拟青霉的侵染过程和侵染机制提供基础,对培育更优良的植物线虫生防菌株,开发高效生防制剂等具有重要的意义.     

农杆菌介导高羊茅基因转化体系的建立

以高羊茅(FestucaarundinaceaSchrebb)品系宾哥(Bingo)为材料,建立了农杆菌介导的基因转化方法。高羊茅种子在9mgL-12,4-D作用下,获得胚性愈伤组织。愈伤组织经农杆菌侵染,在30和50mgL-1的潮霉素浓度梯度下筛选,得抗性愈伤组织。组织化学染色法证实,uidA基因在抗性愈伤组织中表达:抗性愈伤组织在分化培养基中分化得到转基因植株。PCR、Southern杂交法证实外源基因已导入到高羊茅植株中。图5参37。     

农杆菌介导慈竹4CL基因遗传转化梁山慈竹

以梁山慈竹2种类型成熟胚的愈伤组织为材料,采用农杆菌遗传介导的方法,将已构建好的具有降低木质素含量的PBI121-4CL-RNAi表达载体导入愈伤组织,探讨愈伤组织预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间和温度对遗传转化的影响。研究结果表明,淡黄色、颗粒状、疏松易碎的胚性愈伤组织是较好的遗传转化材料。以在愈伤组织培养基上预培养8天的淡黄色、颗粒状、疏松易碎的胚性愈伤组织为转化受体,在菌液浓度为OD600=0.05的EHA105中侵染20min后,在25℃、黑暗条件下共培养2天(共培养基表面加一层无菌滤纸),在含有卡那霉素为55mg.L-1的抗性筛选培养基上筛选30天,抗性愈伤组织率为90%,经PCR检测,慈竹4CL基因已导入梁山慈竹愈伤组织中。抗性愈伤组织在芽诱导培养基上诱导30天,可获得丛生芽,待丛生芽长至3～5cm后,在生根培养基上经过20～30天的诱导,可产生1～8条根,获得再生植株。经PCR检测,慈竹4CL基因已导入梁山慈竹再生植株中,获得了转基因植株,转化效率为9%。RT-PCR检测结果表明,转4CL基因的梁山慈竹愈伤组织和植株的内源4CL基因的表达受到抑制,且表达量比对照明显降低。     

提高根癌农杆菌介导的香石竹遗传转化效率的研究

以无菌苗叶片为外植体,在根癌农杆菌介导下建立并优化了香石竹5个品种的遗传转化体系。预培养2d可明显提高转化率;香石竹品种间在转化上存在差异;培养基中添加20μmol的AgNO3抑制不定芽的分化。转化植株在含25mg·L-1卡那霉素的生根培养基上培养,生根率为72 1%,GUS检测结果55%的转化植株呈蓝色,PCR扩增表明阳性率为32 2%,Southern杂交证实外源基因已整合到植物基因组中。     

多胺物质对农杆菌介导欧美杨107遗传转化影响的研究

利用多胺对携带植物表达载体pBI121的农杆菌EHA105进行活化,之后侵染欧美杨107的叶环.GUS瞬时表达分析表明多胺活化使农杆菌的侵染效率增强,腐胺和亚精胺处理分别为对照的2.4倍和1.8倍.可见使用多胺活化农杆菌有助于提高杨树的转化率.     

农杆菌介导的甜橙基因转化系统建立研究

以3个不同品种甜橙上胚轴为对象，进行了农杆菌介导的基因转化影响因素研究。研究结果表明：红心橙、柳橙、新会橙卡那选择浓度分别为140、100、80μg／mL；不同品种外植体达最高Gus瞬时表达阳性率所需的AS浓度不同，红心橙、柳橙、新会橙分别为150、150、100μmol／L；红心橙、柳橙、新会橙的最适预培养时间分别为2、2、3天，预培养基成分为不定芽分化培养基有利于外植体Gus阳性率的提高；实生苗苗龄以20～25天为宜。     

农杆菌介导BADH基因转化美丽胡枝子的研究

以子叶节为外植体,草丁膦为选择剂,对根癌农杆菌LBA4404介导的美丽胡枝子遗传转化进行研究,建立美丽胡枝子遗传转化体系,获得转BADH基因植株,最高转化率可达28%.抗性植株经分子检测表明,目的基因已整合进美丽胡枝子基因组中.NaCI胁迫下,转基因植株能积累更多的甜菜碱,证明BADH基因在转化植株中得到正常表达.     

根癌农杆菌介导Caz基因转化烟草条件研究

利用根癌农杆菌介导Caz基因转化烟草,将外源基因导入烟草愈伤组织,建成可诱导表达细胞质和细胞核CaM/CaM结合多肽的转基因烟草．研究结果表明:植物材料的选择和培养、农杆菌的培养和稀释、植物材料与农杆菌共培养的程度及转基因植株的筛选条件是影响农杆菌转化效率的重要因素．     

不同因素对农杆菌介导的杉木转化效率的影响

以杉木试管苗靠近茎尖的茎段为受体材料,研究6个影响杉木遗传转化效果的因素,初步确定杉木茎段较为合适的转化体系为:预培养1～3 d,OD600 nm为0.1～0.4的菌液浸染10～15 min,共培养3～5 d,共培养基附加乙酰丁香酮(AS)80 μmol·L-1,共培养后延迟3 d筛选.在初次筛选培养基上共得到186个卡那霉素(Km)抗性芽,在二次筛选培养基上获得39个Km抗性芽.PCR检测有2个Km抗性芽呈稳定阳性,初步证明外源天麻抗真菌蛋白(GAFP)基因已整合到这2个Km抗性芽的基因组DNA中.     

农杆菌介导CBF3基因转化扶芳藤的研究

进行扶芳藤下胚轴抗生素敏感性试验,筛选出适合其抗性芽筛选的抗生素为G418(40mg·L-1)。建立农杆菌介导的扶芳藤遗传转化体系,确定适宜农杆菌转化的菌液浓度(OD600)、浸染时间(min)和共培养时间(hr)分别为:0.5、30和48。     

影响农杆菌介导的柑桔基因转化早期主要因素的研究

以柑桔中的枳壳，金桔，柠檬，红江橙为对象，农杆菌为载体，研究了转化早期影响效率的主要因素。结果表明：（１）抑菌用抗生素种类与浓度对不同品种柑桔上胚轴出芽率有一定影响，外植体形态学下端垂直放入培养基的放置方式比水平放置所需卡那浓度高；（２）外植体与农杆菌共培养时间３天为宜，共培养３天时各品种Ｇｕｓ阳性外植体所占比例大小依次为枳壳，金柠檬，红江橙；（３）酚类化合物的添加对Ｇｕｓ阳性率有促进作用，红江橙     

农杆菌介导的菊花转基因研究

为了在地被菊中建立外源基因的转化体系和获得转基因地被菊美矮黄植株,利用农杆菌介导法在地被菊美矮黄中建立了转化体系,并获得了转入外源基因CHS的转基因植株,PCR-Southern杂交和Southern杂交都已经证实了外源基因的转入.研究中发现潮霉素对转化植株分化具有一定的抑制作用.     

农杆菌介导转化石斛兰—蝴蝶兰杂交种类原球茎体的研究

以类原球茎体为受体材料,利用农杆菌EHA101(pIG121 Hm)介导转移GUS基因到石斛兰-蝴蝶兰的2个杂交品种。以一种β-内酰胺类新型抗生素美罗培南(Meropenem)作为抑菌抗生素和以潮霉素为筛选元件进行选择,获得了潮霉素抗性体,并通过X-gluc组织化学染色法,检测到较强的GUS的表达,表达率达80%以上。经过80 d的选择培养后在81个潮霉素抗性组织中获得了22株再生兰花。对其中的9株PCR阳性的再生植株进行Northern分析,检测到较强的GUS基因表达。     

微弹介导的火炬松遗传转化

本文建立了一个微弹介导的火炬松遗传转化系统。这个系统解决了火炬松遗传转化过程中存在的许多困难。运载抗虫基因的质粒载体经微弹转化法进入火炬松成熟合子胚,然后在添加了卡那霉素的培养基上从转化的成熟胚上诱导出有器官发生潜力的愈伤组织,再从转化的愈伤组织上产生转基因植株。利用这一系统生产的转基因植株已经被随机扩增技术、Southern杂交技术和虫试验所证实,并且转化的植株已在土壤中成活。图3表2参28。     

抗生素在农杆菌介导植物转基因中的应用

农杆菌介导植物转基因中常用抗生素包括抑茵剂和选择剂两大类。两类抗生素的作用机理不同。抗生素通常抑制植株的再生，也有较多的研究结果证明抗生素促进外植体的生长与分化。除用于筛选转化体或筛选转基因成株外，选择剂还用于鉴定转基因植物种子纯度、对转基因植物后代进行遗传分析。重点综述了农杆菌介导植物转基因中常用抗生素的作用机理及选择剂应用范围与方法的新进展，并讨论了抗生素在植物转基因中的安全性问题及应用前景。