真核启动子研究进展

启动子是基因表达的重要顺式元件,也是基因工程表达载体的一个重要元件,决定着特定基因的定时、定位、定量表达,对其进行研究分析有重要的理论意义和广泛的应用前景。从启动子的基本构成、分类、生物信息学的预测与分析、克隆以及活性功能验证几个方面进行综述,介绍了多种启动子顺式作用元件的生物预测方法、启动子克隆和功能验证的各项技术,以期为克隆启动子和研究基因的表达调控提供参考。     

真核启动子研究进展

启动子是基因表达的重要顺式元件,也是基因工程表达载体的一个重要元件,决定着特定基因的定时、定位、定量表达,对其进行研究分析有重要的理论意义和广泛的应用前景。从启动子的基本构成、分类、生物信息学的预测与分析、克隆以及活性功能验证几个方面进行综述,介绍了多种启动子顺式作用元件的生物预测方法、启动子克隆和功能验证的各项技术,以期为克隆启动子和研究基因的表达调控提供参考。     

银杏叶绿素a/b结合蛋白基因(GbLhcb4)及其启动子克隆

为了探究银杏中叶绿素a/b结合蛋白基因(Gb Lhcb4)的结构及其相关的转录调控元件,基于Roche454高通量测序获得的Gb Lhcb4基因片段,采用RACE技术分离得到该基因的c DNA序列,并通过染色体步移技术获得该基因启动子序列,结合生物信息学技术分析基因序列的特征、系统进化地位及启动子区域的转录调控元件。序列分析表明,Gb Lhcb4基因全长1 200 bp,含有一个834 bp开放阅读框,编码277个氨基酸,相对分子量为30.65 k D,等电点为5.17。同源分析表明,该基因编码蛋白与北美云杉Ps Lhcb4蛋白(Gen Bank登录号:ABK21281.1)相似性最高,为74.7%。启动子顺式作用元件预测表明,启动子区域包含多个光响应元件及逆境响应元件,同时还存在激素响应、组织特异性表达、细胞周期等相关调控元件。此研究分离得到银杏Gb Lhcb4基因及启动子序列,并进行了相关的生物信息学分析,为探究银杏Gb Lhcb4基因应答环境信号的转录调控机制提供了分子基础。     

杨树基因启动子的克隆及功能研究进展

启动子是基因调控的重要元件，研究启动子的功能对于基因的表达调控有重要意义。本文从杨树启动子的克隆方法入手，着重介绍了杨树启动子的功能研究进展，并展望了今后的研究前景。     

杨树维管组织特异启动子的克隆与启动活性分析

启动子在基因表达调控中起关键性作用,它在很大程度上决定所控基因表达的时间、空间和强度。依据拟南芥ATH1芯片分析杨树维管形成时期特异表达基因的结果,选取了差异表达基因NST3,通过BLAST比对在杨树EST数据库(PopulusDB)中找到同源性较高的基因NAC068。以毛白杨为材料,在其基因组中克隆得到该基因5'侧翼区901 bp长的片段,命名为pProNAC068,将该片段置换pBI121载体中的CaMV35S启动子,并在84K杨中检测报告基因GUS的表达情况。经过GUS活性检测分析发现:该启动子可以控制外源基因在次生维管组织中特异表达,从而为基因工程中有目的的控制外源基因在维管组织中的表达奠定基础。     

不同长度ThVHAc1基因启动子片段分离及活性分析

[目的]VHAc基因(V-ATPase c亚基)是V-ATPase的重要亚基,能响应盐、重金属等胁迫,过表达刚毛柽柳ThVHAc1基因的酵母能提高抗CdCl_2耐NaCl能力。本研究拟通过分离ThVHAc1基因不同长度启动子片段并对其胁迫后活性进行分析,以进一步探讨ThVHAc1基因响应CdCl_2和NaCl胁迫的机制。[方法]根据ThVHAc1基因启动子中含有的Dof顺式作用元件的分布,将ThVHAc1基因上游启动子分为205 bp(-1—-205),504 bp(-1—-504)和781 bp(-1—-781)3个不同长度片段。将这些不同长度启动子片段分别替换p CAMBIA1301载体上的CaMV35S启动子,以驱动GUS基因表达,构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥。对4周龄的T4代转基因拟南芥分别进行H_2O(非胁迫处理,对照)、100 mmol·L~(-1)NaCl和150μmol·L~(-1)CdCl_2胁迫处理,比较不同转基因株系的GUS染色和GUS酶活性。[结果]正常生长条件下,CaMV35S株系在根、茎、叶中均有GUS染色;3个启动子片段转基因株系均能在不同组织观察到GUS染色,且在根、茎、叶中有一定差异,但整体上GUS酶活性表现为781504205。NaCl胁迫下,CaMV35S株系的GUS染色及酶活性与正常生长条件相比无明显变化,但3个启动子片段转基因株系的GUS染色及酶活性均显著降低,且781株系的GUS酶活性分别为205和504株系的2.73和2.07倍;同时,3个启动子片段转基因株系的组织表达特性发生了一些改变,如,504株系在老叶中表达明显增强,嫩叶中减弱,根中无明显变化。CdCl_2胁迫下各转基因株系的GUS染色和酶活性变化趋势与NaCl胁迫相似。CdCl_2胁迫下,205,504,781株系的GUS酶活性分别为非胁迫时的52.4%,57.9%和80.9%;胁迫后的组织表达活性也发生了一些改变,205株系的GUS染色在老叶较深、嫩叶较浅,504株系则在各部分的表达较均匀,781株系大多叶片的GUS表达减弱;但781株系的GUS酶活性仍然最高,分别为205和504株系的2.67和2.07倍。[结论]ThVHAc1基因启动子片段的驱动活性与长度呈正相关;各不同片段启动子在根、茎、叶中的GUS染色及活性具有一定差异,体现在不同启动子片段的表达活性具有一定的组织特异性。NaCl和CdCl_2胁迫对ThVHAc1基因启动子的驱动能力具有一定影响,胁迫后各启动子片段转基因株系GUS酶活性均显著降低,但长片段受胁迫的影响程度低于短片段。Dof元件的数量在3个启动子片段中依次减少,表明Dof元件可能对NaCl和CdCl_2胁迫有一定的调节作用。同时,NaCl和CdCl_2胁迫对ThVHAc1基因启动子的组织表达特性具有一定的影响。     

猕猴桃Ac-miR160d启动子区的克隆及表达分析

[目的]为深入研究猕猴桃miR160d转录调控机制提供线索,也为猕猴桃分子育种及品种改良提供参考.[方法]根据'红阳'猕猴桃基因组信息,设计引物克隆miR160d(Ac-miR160d)前体基因及其启动子序列,并对其前体序列进行二级结构验证,对启动子序列进行保守结构域和顺式作用元件分析.同时,对猕猴桃果实进行非生物(N...     

APETALA1基因启动子的克隆与功能分析

为了分析AP1的表达调控模式,本研究克隆了拟南芥花异常株系AFDL的AP1启动子,启动子元件预测结果表明:AP1启动子中含有3个结合MADS调控因子的CArG box(从5'依次编号为CArG1、CArG2、CArG3),通过删减AP1启动子长度以及改变CArGbox数量构建了5个GUS表达载体并转化野生型拟南芥.测序结果显示:AFDL的AP1启动子在核苷酸序列上与野生型拟南芥完全一致,这表明AP1在AFDL中的表达显著降低并不是启动子序列突变引起的;转基因植株的GUS表达模式说明了CArG1在花发育早期及后期激活基因的表达,CArG2在整个后期都对基因的表达有抑制作用,而CArG3在花发育初期就能抑制基因的表达,并且在中后期仍然保持了对下游基因的抑制作用,CArG box1、2、3对AP1的表达有显著但非决定性的影响.此外,还推测在AP1启动子0～-3 579 bp范围之外存在影响AP1在第4轮花器官表达的调控元件,-3 579 bp至-1 752 bp区域可促进AP1的表达,而AP1启动子-1759 bp至-1359 bp区域除CArG2外的其它元件对调节其表达无明显作用.     

‘84K’杨组氨酸激酶基因PaHK3b的克隆及功能分析

[目的]本研究克隆了银腺杨‘84K’(Populus alba×P. glandulosa ‘84K’)组氨酸激酶基因PaHK3b启动子及编码区,并对其表达进行检测及功能鉴定,为深入研究PaHK3b基因在杨树生长发育的调控作用提供线索,为杨树分子育种及品种改良奠定基础。[方法]根据毛果杨(P. trichocarpa Torr.Gray)基因组信息,设计引物克隆‘84K’杨组氨酸激酶基因PaHK3b启动子及CDS序列,并对其保守结构域和启动子顺式作用元件进行分析;同时,对‘84K’杨进行植物激素处理(10μmol·L~(-1)ABA、10μmol·L~(-1)6-BA、10μmol·L~(-1) IBA、10μmol·L~(-1)GA3及10μmol·L~(-1)水杨酸(SA))及非生物胁迫处理(42℃高温、0℃低温、200 mmol·L~(-1) NaCl和5%PEG6000),利用实时定量PCR(qRT-PCR)方法检测PaHK3b基因表达情况与表达响应差异,并采用原核表达方法初步确定PaHK3b基因的生物学功能。[结果]PaHK3b基因编码框区长度为3 060 bp,编码1 019个氨基酸,PaHK3b蛋白具有CHASE、HisKA和REC等典型的细胞分裂素受体结构域。PaHK3b基因启动子序列中不仅含有大量TATA框和CAAT框常见核心元件,还包含低温响应元件LTR、防御与胁迫响应元件TC-rich repeats、赤霉素响应元件GARE-motif、水杨酸响应元件TCA-element等顺式作用元件,这些元件与杨树的激素响应和逆境胁迫响应密切相关。qRT-PCR分析表明:PaHK3b基因在叶片中表达最高,根部中等,茎中最少;另外,与正常条件下相比,在高温、低温、NaCl及PEG处理时,PaHK3b基因表达量与对照明显增高,分别为对照的2.67、2.61、2.28、1.87倍;用IBA诱导处理时,基因表达量与对照相比差异不大,而在6-BA、ABA、GA3及SA处理时,基因表达量与对照相比均呈下调表达;在添加5%PEG6000的LB液体培养基中,转入PaHK3b基因原核表达载体的大肠杆菌菌株生长速度显著高于对照,在添加50～150 mmol·L~(-1)NaCl的LB固体培养基上,转入PaHK3b基因原核表达载体的大肠杆菌菌株单克隆生长均好于对照。[结论]‘84K’杨PaHK3b基因启动子含有逆境和激素响应元件,表明PaHK3b基因与杨树植物激素信号及非生物胁迫信号响应密切相关。经非生物胁迫处理、激素处理及原核表达证实,杨树PaHK3b基因参与杨树植物激素信号响应,并在其抗逆境胁迫过程中发挥重要调控作用。     

毛果杨PLD基因家族全基因组水平鉴定及其盐胁迫下的表达分析

[目的]对木本模式植物毛果杨PLD基因家族的进化中的选择压力、启动子中顺式作用元件、组织表达特性以及盐胁迫下表达模式进行分析,为挖掘PtrPLD在非生物胁迫中作用提供参考.[方法]利用拟南芥PLD基因家族蛋白序列比对得到毛果杨基因组同源基因,再经过保守结构域鉴定后确定PtrPLD基因;利用软件ClustalW和MEGA...     

蜡梅CpEXP1基因启动子的克隆及活性分析

【目的】细胞扩展蛋白(EXP)作为植物细胞壁的重要组成部分,参与种子萌发、营养器官发育、果实成熟、器官脱落、植物抗逆等植物生长发育过程中的多个环节。通过研究蜡梅细胞扩展蛋白基因CpEXP1启动子活性功能,为研究CpEXP1基因在蜡梅生长发育过程中的功能提供理论依据。【方法】以蜡梅‘磬口素心’为材料,通过hi-TAIL PCR法从蜡梅基因组DNA中克隆CpEXP1基因上游调控序列,利用生物信息学软件,分析CpEXP1基因启动子序列中潜在的顺式调控元件。构建该基因与GUS报告基因融合的植物表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法在烟草叶片中进行启动子活性的瞬时表达研究,并进一步利用花序侵染法在拟南芥中进行稳定表达,利用GUS组织化学染色和GUS报告基因的实时荧光定量PCR检测,分析CpEXP1基因启动子的活性。【结果】获得了长度为2 485 bp的蜡梅细胞扩展蛋白基因CpEXP1上游调控序列(GenBank Accession:MG452931),序列分析表明该启动子中除含有核心元件TATA-box和CAAT-box外,还包含多个与植物非生物胁迫及组织特异表达相关的顺式作用元件。在烟草中的瞬时表达分析表明该启动子具备驱动报告基因GUS表达的功能。进一步对转基因拟南芥植株的GUS组织化学染色和GUS基因表达分析结果显示,CpEXP1基因启动子在转基因拟南芥种子萌发初期活性较强,在子叶以及幼苗真叶中未检测到GUS活性;在花和根中活性较弱;在成熟叶片中可以检测到GUS活性,特别是在衰老叶片叶柄脱落区表达强烈。此外,该启动子在幼果中具有较强活性,随后启动活性逐渐下降,成熟果荚中仅在果柄脱落处能够检测到GUS活性。同时,转基因拟南芥植株中的CpEXP1基因启动子活性受高温(42℃)、低温(4℃)和水杨酸(SA)诱导,特别是对低温胁迫响应强烈,在4℃低温处理后,转基因拟南芥叶片中GUS基因的表达量是处理前的的8.7倍。【结论】CpEXP1基因启动子在转基因拟南芥不同发育阶段、不同器官中的活性具有明显差异,推测该启动子可能在种子发芽、叶片脱落以及果实脱落中发挥作用,同时CpEXP1基因启动子活性可被不同非生物胁迫诱导,可能参与植物抵御非生物胁迫的调控途径。     

暴马桑黄gpd启动子的克隆与序列分析

暴马桑黄药用价值很高,但是其含有的一些药用成分含量很低,运用基因工程技术对暴马桑黄进行改造,是培育优质暴马桑黄的有效手段.本试验对暴马桑黄三磷酸甘油醛脱氢酶(gpd)启动子进行基因克隆,从暴马桑黄中克隆得到一段1380 bp的gpd启动子序列.核心启动子区是转录因子和RNA聚合酶的结合区域,对启动子活性有较大影响,序列...     

柳树AP2/ERF基因家族全基因组鉴定和表达分析

APETALA2/ethylene-responsive factor(AP2/ERF)转录因子在调控植物的生长和发育、应生物胁迫和非生物胁迫等方面扮演着至关重要的角色.该文对簸箕柳基因组中AP2/ERF基因进行查找,分析了该基因家族的保守结构域、基因结构、启动子区域顺式作用元件、基因在染色体上的分布及其在干旱胁迫下的差异表达.分析结果发现,簸箕柳中共含有208个AP2/ERF基因.根据系统发育树聚类分析的结果,这些基因可分为AP2,RAV,ERF和Soloist 4个亚类;基因结构分析表明,AP2和Soloist基因内含子较多,而多数ERF和所有RAV基因都无内含子;对启动子区域顺式作用元件分析,发现簸箕柳AP2/ERF家族基因启动子区域富含响应非生物胁迫的相关元件;对基因在染色体上分布分析表明,簸箕柳AP2/ERF基因在不同染色体上分布不均匀,其中42个基因的扩张与串联复制有关.利用蒿柳杂交子代的干旱胁迫和对照样品的转录组序列进行了差异表达分析,发现了5个AP2/ERF基因在干旱胁迫下显著上调表达.分析结果为深入研究柳树AP2/ERF基因家族的功能提供了重要参考.     

辣椒miR169家族在非生物胁迫下的表达及启动子顺式作用元件分析

miRNA169(miR169)是植物中保守且规模较大的一类miRNA基因家族,其在非生物胁迫下的功能被广泛报道。为深入研究辣椒miR169基因家族(Can-miR169)在非生物胁迫下的表达及上游转录调控机制,以‘遵辣一号’(Zunla-1)为研究对象,利用生物信息学手段分析辣椒与其他植物miR169成熟体和前体保守性和进化关系。采用real-time PCR技术对干旱、低温、高盐、高温胁迫下辣椒miR169基因家族前体进行应答检测。克隆辣椒Can-miR169基因家族12个成员启动子,进行顺式作用元件预测及元件功能验证。结果显示：(1)miR169成熟体在植物中保守性强。(2)4种非生物胁迫下,辣椒miR169家族成员前体表达量相对于对照组差异显著。(3)成功克隆了Can-miR169基因家族12个启动子,顺式作用元件预测其家族启动子中含有大量与非生物胁迫相关的元件,如MYB、MYC、MBS、ABRE、LTR、DRE等。(4)经验证明,这些元件为干旱、低温、高盐等胁迫应答元件。本研究结果为进一步挖掘非生物胁迫下调控Can-miR169的转录因子,明确其上游调控机制提供新信息,为辣椒...     

种子胚特异性启动子的克隆及其功能验证

以水稻品种日本晴DNA为模板,用PCR的方法从水稻胚特异性表达基因OsESG上游序列扩增出特异性条带,克隆出种子胚特异性启动子,长度为1.1kb,且已知的功能部位序列没有发生改变。用它构建了带动报告基因GUS表达的双元载体,并用农杆菌介导法转化水稻得到了转基因植株。对GUS基因的表达检测表明,由该启动子序列引导的GUS基因仅在胚中特异性表达,而其它组织中都未表达,证实该启动子具有胚特异性表达的功能。     

大青杨纤维素合酶PuCesA6全长基因的获得及分析

为给大青杨纤维素方面的基因改良提供基础,以大青杨叶片总DNA为模板,根据已登录的欧洲颤杨PtrCesA6序列保守区段设计2对引物进行PCR扩增,将得到的2个片段克隆到pMD18-T载体中.测序后拼接2片段,结果显示,该基因全长5 760 bp,与欧洲颤杨的PtrCesA6全长cDNA的相似性为99%,证明克隆的序列为纤...     

杨树皮储藏蛋白基因启动子的克隆和功能研究

杨树树皮储藏蛋白BSP是类似种子储藏蛋白的氮素储藏物 ,冬季在韧皮部薄壁细胞中大量积累 ,是落叶树氮代谢中的重要成分。为了研究BSP基因启动子在转基因植物中的表达特性 ,探索其在植物基因工程研究中潜在的应用价值 ,我们用PCR方法从美洲黑杨基因组中DNA扩增得到了BSA启动子片段。与GUS基因融合构建中间载体后 ,转化烟草 ,获得了一批PCR检测为阳性的转化再生植株。经GUS组织化学检测 ,发现若干转基因烟草的茎和叶柄韧皮部以及叶脉都呈GUS染色阳性 ,初步证明杨树BSP基因启动子确有韧皮部表达特性 ,可介导GUS基因在转基因烟草韧皮部特异表达。     

植物非生物逆境胁迫DREB/CBF转录因子的研究进展

综述近十几年来,特别是近5年来国内外DREB/CBF转录因子的研究进展,主要包括DREB/CBF转录因子的结构特点,DREB/CBF基因的克隆、表达调控及其在植物抗逆基因工程中的作用,以及DREB/CBF转录因子研究中的问题与展望,旨在为植物抗逆育种提供理论依据.DREB/CBF类转录因子即干旱应答元件结合蛋白质/C-重复序列结合子,是AP2/EREBP转录因子家族的一个亚家族,拥有保守的AP2结构域,能够特异性地与抗逆基因启动子区域的DRE/CRT顺式作用元件相结合,在干旱、低温和高盐等条件下调节一系列下游逆境应答基因的表达,是植物逆境适应中的关键性调节因子.目前,已从拟南芥、欧洲油菜、水稻、玉米、小麦、陆地棉、大豆和番茄等几十种植物中分离并鉴定出调控干旱、高盐及低温耐性的DREB/CBF基因,并利用这些基因得到抗逆性增强的拟南芥、欧洲油菜、番茄、小麦以及杨树等转基因植株.转基因结果表明,DREB/CBF转录因子家族在植物抗逆品种改良中具有重要的应用价值.     

利用CODEHOP设计简并引物并克隆玫瑰LAZY1基因片段

为克隆玫瑰LAZY1基因,介绍使用CODEHOP设计简并引物的方法。本文使用CODEHOP设计出10条简并引物,以玫瑰幼茎提取的RNA反转录所得到的cDNA为模板,经RT-PCR扩增得到长度为410bp的基因片段,将该产物连接到pMD-18T载体中,转化至Trans1-T1大肠杆菌中进行测序,测序片段在Genbank中通过Blastx检索与其他物种LAZY1基因的同源性,发现产物片段与其他植物中的LAZY1基因具有较高的相似性和同源性。研究结果表明CODEHOP在线设计简并引物方法简单实用,且具有较高阳性率。     

美洲黑杨木质素合成关键基因的克隆及反义表达载体的构建

以美洲黑杨Populus deltoides新萌叶片为材料,通过自行设计引物,用RT—PCR的方法克隆了美洲黑杨木质素合成关键基因4CL和CAD基因部分序列。测序结果表明:这两个基因片段长度分别为859 bp和493 bp。此外,人工合成了4CL基因木质部特异表达启动子4CLp,长度为1 180 bp。分别用限制性内切酶Hind III/BamH I、BamHI/Sma I和Sma I/Sac I对4CLp、4CL和CAD基因序列进行双酶切,同时用Hind III/Sac I对pBI121表达载体进行双酶切,回收了目的片段。酶切回收后用T4DNA连接酶克隆到植物表达载体pBI121中,并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α。经质粒PCR和双酶切分析,确定获得了pBI—4CLp—a4CL—aCAD反义植物表达载体。