青杄花粉保存方法试验研究

通过对不同保存方式下保存2~4年的同株青杄花粉生活力测定,结果表明:室温保存的青杄花粉效果较差,2年后花粉活力只有11.5%;低温保存条件下,随着保存时间的延长,花粉的生活力虽有下降,但不太明显,在4℃下和-20℃下保存青杄2年后,其生活力仍然在78%和80%左右,-20℃下保存的青杄花粉生活力较4℃稍强。因此,在-20℃条件下较长时间保存云杉花粉效果更为理想。     

蜡梅转录因子CpTAF10基因的克隆及功能分析

【目的】 TATA框结合蛋白相关因子TAF10作为基本转录因子之一,在生长发育和胁迫响应过程中发挥着广泛的、重要的生物学作用。对蜡梅中TAF10同源基因 CpTAF10的克隆与功能分析,有利于丰富对植物TAFs基因功能的认识,并为解析蜡梅抗逆形成的转录调节机理提供新的理论依据。【方法】以转录组数据库中获得的蜡梅TAFs家族基因序列,克隆得到 CpTAF10基因的cDNA序列,并对其编码蛋白进行序列特征和进化树分析。采用实时荧光定量PCR 技术分析 CpTAF10基因在蜡梅不同组织及花期中的表达特性,以及高温、低温、盐胁迫及ABA处理后的表达变化。同时,构建 CpTAF10基因的过表达载体,采用花序侵染法进行拟南芥遗传转化,对拟南芥转基因纯合株系进行表型观察和胁迫耐性分析。【结果】获得的 CpTAF10基因 cDNA序列为712 bp,包含405 bp的开放阅读框(ORF),编码134个氨基酸,蛋白理论分子量为15.21 kDa,预测的等电点pI值为5.19。CpTAF10蛋白序列与其他植物同源序列具有较高的同源性,蛋白多序列比对显示CpTAF10蛋白属于TAF10同源蛋白,并含有组蛋白折叠结构域。表达特性分析结果发现,CpTAF10基因在蜡梅的根、茎、子叶、幼叶、成熟叶和花6个不同组织中均有不同程度的表达,其中,在成熟叶中的表达量最高。 CpTAF10在蜡梅花朵的不同花期中,呈现出波动的表达模式,在衰老期表达量最高。在低温、盐胁迫和ABA处理的蜡梅叶片中均能被诱导表达,但其表达变化各不相同。在拟南芥中过表达 CpTAF10基因可提高盐胁迫下拟南芥种子的萌发率,相对于野生型植株,转基因植株的主根和侧根在盐胁迫下均表现出一定的生长优势。【结论】 CpTAF10基因能在低温、盐胁迫和ABA处理后诱导表达,可能参与蜡梅逆境胁迫耐性的分子调控。在拟南芥中过表达 CpTAF10基因显著提高了转基因拟南芥的萌芽率及主根和侧根的生长优势,在一定程度上可增强植物的盐胁迫耐性。     

青杄云杉不同植株种子发芽性状的观测与分析

以青杄云杉为材料,观测种子发芽性状,结果表明:不同植株种子发芽率变动在86%~94%之间,均值为90%;发芽势变动在57%~73%之间,均值为65%,发芽率的差异由株间遗传性不同所致。种子具有发芽启动快、整齐的特点,发芽观测时间以14 d为宜。     

青杄转录因子PwERF8及其启动子序列的克隆与分析

【目的】AP2/ERF是植物的转录因子家族之一,广泛参与生物胁迫和非生物胁迫过程。从青杄中克隆ERF类转录因子PwERF8及其启动子序列,研究PwERF8基因的表达特性、启动子序列功能,并进一步分析其对非生物胁迫的响应模式,为深入了解青杄的耐逆调控机制提供理论基础。【方法】通过RACE-PCR技术获得青杄PwERF8编码区全长序列。通过染色体步移技术克隆PwERF8启动子序列。通过PlantCARE在线软件和BDGP在线软件预测启动子序列上的顺式作用元件、基础启动子和转录起始位点,构建pBI121-PwERF8 promoter∷GUS启动子表达载体,采用农杆菌注射法瞬时转化烟草叶片来验证启动子的功能。构建PGBKT7-PwERF8载体,转化AH109酵母菌株验证其转录激活活性。构建35S∷PwERF8-GFP融合表达载体,通过PEG介导瞬时转化拟南芥原生质体进行基因表达的亚细胞定位分析,应用RT-qPCR技术分析该基因的组织特异性和在非生物胁迫下的时空表达特征。【结果】PwERF8基因的编码区全长序列共1 191 bp,开放阅读框共765 bp,开放阅读框翻译成255个氨基酸。在肽链的N端具有1个保守的由58个氨基酸组成的AP2结构域,在C端含有1个EAR转录抑制基序(DLNLPP)。组织特异性表达分析表明,PwERF8在茎、根、针叶、花粉、种子中均有表达,但在花粉中,PwERF8的表达量最高,其次为种子,在茎中的表达量最少。酵母单杂交试验表明,PwERF8蛋白不具有转录激活活性。亚细胞定位分析发现PwERF8蛋白主要定位于细胞核。将启动子序列进行在线分析显示PwERF8含有GA、ABA、JA和SA等激素的顺式作用元件。进一步在烟草中瞬时过表达PwERF8启动子并用GUS染色显示,PwERF8启动子能响应GA、ABA、MeJA和SA等外源激素的处理。GA、ABA、MeJA和SA分别处理青杄幼苗3、6、12 h后,PwERF8的表达量均显著高于对照,干旱、4℃和42℃处理均能诱导PwERF8表达,但盐胁迫不能诱导其表达。【结论】青杄转录因子PwERF8参与了GA、ABA、JA和SA激素的信号通路,广泛响应干旱、温度逆境等非生物胁迫,且可能作为一个转录抑制子在细胞核中发挥功能。     

蜡梅转录因子CpBBX24基因的克隆及功能分析

【目的】BBX (B-box)是锌指结构蛋白转录因子家族中一个重要的亚家族,在植物生长发育、植物信号转导及逆境胁迫响应中具有重要的调控作用。对蜡梅BBX24基因的克隆与分析,有利于丰富植物中对BBX基因家族的认识,为蜡梅抗逆调节机制提供新的理论依据。【方法】以蜡梅转录组数据库中获得的蜡梅CpBBX24基因cDNA序列为基础克隆基因全长,使用DNAStar和MEGA进行序列分析和进化树构建。采用qRT-PCR进行蜡梅不同组织及不同花期表达特性分析,以及ABA、 MeJA、干旱、高盐、高温和低温等处理后表达分析。同时,使用Gateway技术构建植物表达载体,花絮侵染法转化拟南芥,对T3代纯合系进行表型观察及非生物胁迫耐性分析。【结果】获得CpBBX24的cDNA序列长为1 374 bp,包含729 bp的开放阅读框(ORF),编码242个氨基酸,分子量为26.54 kD,等电点为4.93。序列分析表明CpBBX24蛋白在N端有两个串联的B-box结构域,其C端不包含CCT结构域。表达特性分析表明,CpBBX24在蜡梅根、茎、子叶、幼叶、成熟叶各器官,外瓣、内瓣、雌蕊、雄蕊等组织中均有表达,...     

青杄MYB转录因子基因PwMYB20的克隆及表达分析

【目的】MYB转录因子家族是植物中最大的一类转录因子,在植物生长发育及抗逆调控网络中发挥重要作用。对青杄中MYB同源基因Pw MYB20的克隆与分析,有利于进一步探究Pw MYB20在植物生长发育及逆境响应中的功能,挖掘与利用青杄中的优质基因。【方法】采用RACE-PCR技术,从青杄c DNA文库中克隆得到Pw MYB20基因,并通过PCR技术克隆验证。利用Prot Param、Prot Scale、Fold Index等生物信息学软件对Pw MYB20理化性质进行分析预测。通过BLAST在线工具得到植物同源蛋白,并对其进行比对分析和进化树分析。采用实时荧光定量PCR技术分析Pw MYB20基因在不同组织中的表达性,以及干旱、低温、盐、ABA等非生物逆境胁迫处理后的表达变化。通过亚细胞定位及转录激活活性验证试验,揭示其生物学特性。【结果】通过RACE-PCR克隆得到Pw MYB20 c DNA全长966 bp,含675 bp的完整开放阅读框,编码225个氨基酸。Prot Param工具计算蛋白分子式为C1104H1740N340O330S8,分子质量为25.3 k Da,等电点为9.11;Protscale工具疏水性分析发现,Pw MYB20的疏水位点与亲水位点均匀分布,推测该蛋白为亲水蛋白;Signal P工具预测发现该蛋白没有信号肽结构域;利用Fold Index工具对蛋白质固有无序化进行分析,结果表明该蛋白固有无序化序列较多,推测在生理环境下蛋白的动态活性较大;TMHMM工具预测发现该蛋白没有跨膜结构域。通过对比分析发现Pw MYB20属于MYB家族基因,编码1个R2R3-MYB蛋白。进化树分析结果显示,青杄Pw MYB20与白云杉Pg MYB20聚为一簇。实时荧光定量PCR结果表明,Pw MYB20在种子中的表达量最高,其次是在针叶中,在花粉中的表达相对较少。Pw MYB20对干旱、4℃和ABA处理均有响应,而对Na Cl处理响应相对较弱。在干旱处理下,Pw MYB20表达量先上升后下降;4℃低温处理3 h和12 h时Pw MYB20的表达量上升,在4℃处理6 h时存在波动,呈现上升—下降—上升的趋势;Pw MYB20的表达受ABA处理持续诱导。亚细胞定位分析表明,Pw MYB20是一个主要定位于细胞核中的蛋白质。转录激活活性分析结果显示,Pw MYB20的C端存在转录激活活性,而Pw MYB20全长及其N端没有转录激活活性。【结论】青杄Pw MYB20,作为一个转录因子发挥作用,其转录激活活性位于C端;受干旱、低温和ABA诱导,普遍参与了植物应对逆境胁迫的响应过程。     

我国特有植物大果青杄濒危机制的探讨

对我国特有植物大果青杄(Picea neoveitchii Mast.)在甘肃省舟曲县境内的地理分布、自然境况及种群大小等种群特性进行研究,并掌握其种子形态特征、发芽能力和物候期等生物学特性。结果表明:大果青杄在甘肃南部主要分布于舟曲县插岗乡角绕村至鬼门关之间,拱坝河两岸,种群分布狭窄,种质资源少,估算出大果青杄群落原始分布面积为81.48hm~2,大果青杄3 000余株。现有大果青杄自然集群为小种群,年龄结构不合理,种群处于衰退阶段。结实量小,病虫害严重,自然生境的破坏,土壤种子库中空种子极高是造成大果青杄种群濒危的主要原因。     

植物抗逆性相关转录因子的研究进展

植物在自身的生活周期中往往面临着各种胁迫,在胁迫环境下,植物中特定的转录因子与抗逆基因上游的顺式作用元件结合,从而特异性地调控该基因在植物体内的表达,提高植物对环境胁迫的适应能力。因此,转录因子已成为近年来植物抗逆基因工程的研究热点。本文主要综述了植物抗逆相关转录因子的结构、调控机制、功能特性以及在植物抗病基因工程方面的研究成果,并展望了其应用前景。     

茶树2个MYB转录因子基因的克隆及表达分析

MYB类转录因子是一类包含一段保守的DNA结合结构域的基因家族,广泛地参与植物发育和植物次生代谢的调节。根据前期芯片杂交和文库筛选得到的2个MYB转录因子的部分序列,采用RT-PCR和RACE技术分离得到它们的全长基因:CsMYB1和CsMYB2,在GenBank的登录号分别为HQ660373和HQ660374。序列分析表明:CsMYB1基因全长1132bp,开放阅读框长879bp,编码292个氨基酸,推测的蛋白分子量约为32.9ku,理论等电点为8.13;CsMYB2基因全长1020bp,其中开放阅读框长675bp,编码224个氨基酸,推测的蛋白分子量约为25.4ku,理论等电点为9.05。2个基因编码的蛋白均具有明显的R2R3MYB结构域,且在R3结构域的下游都含有1个相对保守的C1(LIXXGIDPXTHR)基序。同源性分析表明:茶树CsMYB1和CsMYB2编码的氨基酸序列与其他植物的MYB类转录因子具有较高的相似性,其中CsMYB1编码的氨基酸序列与陆地棉MYB1的相似性为57%,CsMYB2编码的氨基酸序列与葡萄MYBC2的相似性为75%。利用荧光定量PCR技术检测2个转录因子基因在遮荫处理条件下的表达规律,及其在茶树不同组织中的表达特性,结果表明:CsMYB1和CsMYB2在不同组织中均有表达,但表达量具有明显区别,其中CsMYB2在叶片中的相对表达量是根中的100多倍;而遮荫处理能明显降低叶片中的花青素含量,并提高CsMYB1的表达,但对转录因子CsMYB2的影响不大。     

毛竹PheMYB2R-4的克隆与功能分析

[目的 ]研究MYB转录因子家族在毛竹干旱胁迫反应中的重要作用,为毛竹的抗逆改良和分子育种提供基因资源。[方法 ]从毛竹的基因组数据库中获得PheMYB2R-4的基因序列,利用亚细胞定位和转录活性实验分析基因的分子特性、通过实时荧光定量PCR技术、转基因拟南芥表型分析和逆境相关生理生化指标的测定来确定PheMYB2R-4基因的功能。[结果]毛竹中PheMYB2R-4编码1个305个氨基酸的蛋白PheMYB2R-4,其N端区域有一个保守的R2R3区域,属于R2R3-MYB亚家族。PheMYB2R-4基因的表达受到干旱和盐的显著诱导。PheMYB2R-4是一个核定位蛋白,具转录自激活活性。PheMYB2R-4的过表达提高了干旱胁迫下拟南芥的叶片相对含水量,降低了相对电导率并减少了丙二醛的积累,说明过表达PheMYB2R-4通过提高拟南芥的保水能力和减少氧化损伤来增强转基因拟南芥的耐旱性;同时干旱胁迫下,AtRD22、AtRD29A、AtDREB2A和AtLEA基因的表达量均上调。[结论 ]MYB转录因子家族中PheMYB2R-4在干旱胁迫应答反应中具有正调控作用,可以提高植物的耐旱性,增强...     

毛白杨转录因子PtCBF5的表达模式分析

利用RT-PCR手段克隆得到1个毛白杨CBF基因cDNA,命名为PtCBF5(GenBank注册:DQ354395)。PtCBF5全长837bp,该序列包括起始密码子ATG和42bp的5′末端非编码区,终止密码子TGA和98bp的3′末端非编码区,开放阅读框编码231个氨基酸。RT-PCR半定量研究表明:PtCBF5在叶片组织中的表达量高,茎、根中的表达量低。组培苗在低温、干旱、NaCl、ABA条件下处理诱导24h,在低温和干旱的条件下PtCBF5表达量在诱导30min后开始增加,分别在2h和6h达到峰值,24h后又恢复到初始水平;而高盐和ABA存在的条件下未有显著变化。PtCBF5在植物体适应寒冷和干旱的过程中可能有着重要作用,尤其在逆境初期。     

刚毛柽柳Thb HLH1转录因子识别的顺式作用元件的鉴定

[目的]本研究拟对Thb HLH1所识别的顺式作用元件进行鉴定,进一步揭示Thb HLH1调控抗逆基因表达的机理。[方法]利用以转录因子为中心的酵母单杂交系统鉴定Thb HLH1所识别的顺式作用元件;将元件与报告基因融合构建报告载体(p CAM-Cis),通过基因枪法将报告载体与效应载体35S∶Thb HLH1共转化烟草叶片,在盐、干旱胁迫下比较GUS酶活。[结果]鉴定出2段能够与Thb HLH1转录因子结合的DNA序列:分别为CCGAAA(LTRE1)和TGAC(WRKY710S)。[结论]在盐或干旱胁迫下,Thb HLH1通过与LTRE1或WRKY710S元件作用来激活基因表达。     

光皮桦BlSPL1转录因子基因的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

Squamosa promoter binding protein like genes(SPLs)对植物开花具有重要的调控作用.基于转录组序列并利用RACE技术从光皮桦中分离获得BlSPL1基因,其cDNA序列全长1 825 bp,包含开放阅读框长1 170 bp,编码389个氨基酸,与桃PpSPL1(EMJ10405)的同源性最高(67％),属于陆地植物SPLs基因家族的group VⅧ分支.表达分析显示BlSPL1在光皮桦芽、雌花、雄花、幼苗中均有表达,在雄花和幼苗中表达量较低,但在芽发育成雌花过程中明显上调,推测其可能对早期的雌花形成起调控作用.同时,从57个不同的光皮桦无性系中克隆BlSPL1的基因组序列,进行单核苷酸多态性(SNP)分析,共检测到98个SNP位点,SNP频率为1/26 bp,多样性指数π为0.007 12.在外显子区域,共检测到28个SNP位点,其中11个为同义突变,17个为错义突变.进一步的连锁不平衡分析显示,随着序列长度的增加,不同光皮桦群体BlSPL1内的SNPs连锁不平衡在基因内部迅速衰退.     

毛竹NLP转录因子鉴定及其响应氮素的表达模式

目的 鉴定毛竹中NLP家族成员,为深入研究毛竹NLP分子调控机制奠定基础。 方法 采用生物信息学方法鉴定并系统分析毛竹NLP成员的分子特征,用实时荧光定量PCR (qPCR)技术检测毛竹NLP响应氮素的表达模式。 结果 毛竹中鉴定出10个NLP成员(PeNLP1～PeNLP10),其蛋白长度为714～963 aa,分子量为77.41～105.08 kDa,理论等电点介于5.36～6.25之间;亚细胞定位预测结果表明,除PeNLP9定位于叶绿体外,其余成员均定位于细胞核内。系统进化分析表明：PeNLPs分成3个组,各组成员分别为4、2、4个。PeNLPs均包含4个内含子,不同成员内含子的大小和位置存在一定的差异;PeNLPs内有共线性基因对6个,PeNLPs和OsNLPs之间有共线性基因对9个,且它们的Ka / Ks均小于1,说明其在进化上经历了纯化选择。组织特异性分析表明,有的PeNLPs呈组织特异性表达,有的则呈组成型表达。PeNLPs受到氮饥饿诱导表达,在1 h内PeNLP1的表达量显著上调,其它5个PeNLPs则显著下调(p < 0.01);对氮饥饿72 h后的毛竹进行复氮处理,在24 h内所有PeNLPs的表达量均显著或极显著上调(p < 0.05或p < 0.01)。 结论 毛竹中NLP家族有10个成员,各成员的分子特征和组织表达特异性存在一定的差异,PeNLPs的表达能够对氮饥饿作出快速响应,且在氮饥饿后复氮过程中显著上调表达,响应氮素的诱导。     

刚毛柽柳NAC24基因的表达及抗逆功能分析

【目的】NAC类转录因子是植物特有的最大的转录因子家族之一,广泛参与植物的生长发育过程,并在植物响应盐、干旱等多种非生物胁迫的过程中发挥至关重要的调控作用。本研究拟从盐生木本植物刚毛柽柳中克隆获得一个NAC转录因子基因,研究该基因的耐盐、抗旱功能,以期为研究木本植物NAC转录因子的抗逆分子机制奠定理论基础。【方法】在刚毛柽柳NaHCO_3胁迫转录组数据库中筛选获得一个NAC转录因子基因,将其命名为ThNAC24(GenBank登陆号:KF031949)。利用生物信息学工具将其与其他9个物种的NAC蛋白进行多序列比对,与拟南芥105个NAC蛋白进行进化树分析。分别用300 mmol·L^-1 NaCl和400 mmol·L^-1甘露醇对刚毛柽柳进行胁迫,在胁迫6、12、24和48 h后分别取刚毛柽柳根及叶组织。通过实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)技术分析盐、干旱胁迫下ThNAC24基因在不同胁迫时间点及不同组织的表达情况,初步鉴定其是否响应盐、干旱胁迫。为进一步研究ThNAC24基因的抗逆功能,分别构建植物过表达(pROKⅡ-ThNAC24)及抑制表达(pFGC5941-ThNAC24)载体。利用农杆菌介导的高效瞬时遗传转化体系获得ThNAC24基因瞬时过表达(OE)、抑制表达(IE)及对照(Control)刚毛柽柳植株。在盐、干旱胁迫下分析比较了ThNAC24基因瞬时过表达、抑制表达及对照刚毛柽柳植株的二氨基联苯胺(DAB)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色情况,过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,及电解质渗透率、失水率及丙二醛(MDA)含量,鉴定ThNAC24基因的耐盐、抗旱功能。【结果】ThNAC24基因的开放阅读框为1 023 bp,编码340个氨基酸。多序列比对结果显示ThNAC24在N端的氨基酸序列相似度比较高,具有NAC家族的序列特征;系统进化树分析结果显示ThNAC24与ANAC103和ANAC082的亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示:盐胁迫下,ThNAC24基因上调表达,在根组织中胁迫12 h表达量最高,而叶组织中胁迫24 h的表达量最高;干旱胁迫下,ThNAC24基因上调表达,在根组织中胁迫6 h表达量最高,在叶组织中胁迫12 h的表达量最高。ThNAC24基因在刚毛柽柳根和叶组织中均有表达且响应盐和干旱胁迫。过表达ThNAC24基因显著降低了刚毛柽柳H_2O_2和超氧阴离子含量,增强了POD和SOD酶的活性,从而减少活性氧(ROS)的积累。过表达ThNAC24基因能够降低刚毛柽柳在逆境胁迫下的电解质渗透率、失水率及MDA的积累,从而保护细胞膜结构的完整性。【结论】刚毛柽柳ThNAC24基因能够响应盐、干旱胁迫,过表达ThNAC24基因植株通过增强POD和SOD活性,进而提高ROS清除能力,减少细胞受损或死亡,从而提高刚毛柽柳的耐盐及抗旱能力。     

秋茄低温胁迫转录组分析及脱落酸信号途径基因挖掘

目的 深入了解秋茄响应低温胁迫的分子机制以及培育秋茄的抗寒新品种。 方法 以耐寒红树植物‘龙港’秋茄1年生容器苗为实验材料,15 ℃处理12 h为对照组（CK）,−5 ℃处理12 h为低温组（LT）,采用 Illumina HiSeq测序平台进行转录组测序,挖掘脱落酸信号途径相关基因。 结果 转录组测序共鉴定到148个转录因子,分属于25个转录因子家族,其中,ERF、NAC、WRKY、bHLH、MYB、bZIP、HB-other和MYB-related等家族所包含的基因数量较多,分别为17、14、12、12、10、9、6和6;差异组共筛选到1 330个差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）,其中,698（52.48%）个上调表达,632（47.52%）个下调表达; KEGG通路富集分析发现,DEGs显著富集在植物激素信号转导、苯丙素生物合成、半乳糖代谢、光合作用-天线蛋白和α-亚麻酸代谢等通路中; 脱落酸信号途径相关基因 KoPYL1、KoABF1和KoABF2上调表达,KoPP2C1和 KoABF3下调表达,且这些基因表达情况与qRT-PCR验证结果一致。 结论 ERF、NAC、WRKY、bHLH、MYB、bZIP、HB-other和MYB-related等家族转录因子对秋茄响应低温胁迫起重要调控作用。植物激素信号转导、苯丙素生物合成、半乳糖代谢、光合作用-天线蛋白和α-亚麻酸代谢等是秋茄响应低温胁迫的重要KEGG通路。脱落酸信号途径中的KoPYL1、KoPP2C1、KoABF1、KoABF2和KoABF3基因可作为后期研究秋茄响应低温胁迫的重要候选基因。     

山新杨钾离子通道基因PdbSKOR的克隆与功能分析

【目的】植物SKOR是典型的外向整流型Shaker类钾离子(K+)通道蛋白,介导根部K+向地上部的长距离运输。本研究克隆并鉴定杨树K+通道基因Pdb SKOR,在转录水平探讨其组织特异性表达特征及对缺钾、高钾、干旱和低温胁迫的响应情况,并明确其电生理学功能。【方法】通过同源克隆法,在山新杨中鉴定并克隆1个K+通道基因Pdb SKOR;运用MEGA 7.0软件构建山新杨等14种不同科属木本植物SKOR通道成员的系统进化树;利用实时荧光定量PCR分析Pdb SKOR的组织特异性表达特征及在转录水平根部Pdb SKOR对缺钾、高钾(60 mmol·L-1KCl)、干旱(15%PEG6000)和低温(4℃)处理的响应情况;借助膜片钳系统研究Pdb SKOR的电生理功能。【结果】在山新杨中克隆1个K+通道基因Pdb SKOR(Gen Bank No. MT335814),其编码蛋白含有6个离子通道跨膜域(S1—S6)、环核苷酸结合域、Ankyrin锚蛋白域和KHA二聚体功能结构域,属于典型的Shaker类K+通道; 14种木本植物SKOR蛋白的氨基酸一致性高达81.09%,S6跨膜区的氨基酸一致性最高(96%);不同科属植物的SKOR同源蛋白在遗传进化关系上差异较大,而同一科属植物的遗传距离较近,山新杨PbdSKOR与同属杨柳科的红皮柳的同源蛋白Spu SKOR的遗传距离最近;在Pdb SKOR启动子区域预测到18种顺式作用元件,主要包括发育调控、激素响应和胁迫响应等相关的调控元件;实时荧光定量PCR表明Pdb SKOR在3年生山新杨根部的相对表达量最高,其次是盛开期花和花序,在茎部、叶片和果絮中的表达量相对较低; Pdb SKOR在组培幼苗根部的表达水平也是最高的,且在转录水平对高钾处理没有响应,但对缺钾、干旱和低温胁迫处理较为敏感,其中,Pdb SKOR在幼苗根部的表达水平受缺钾或干旱处理的抑制均显著降低,受低温胁迫诱导而显著增强;膜片钳研究表明当细胞膜电位为+20 m V时,PdbSKOR离子通道即被激活,并记录到典型的外向整流电流,并随胞外K+浓度的降低而增大,且正向电压越大,内向整流的电流越强,表明PdbSKOR是一个电压依赖的外向整流型K+通道。【结论】从山新杨中克隆并鉴定了1个K+通道基因Pdb SKOR;山新杨PdbSKOR与红皮柳Spu SKOR在系统进化关系上最近; Pdb SKOR主要在山新杨根部(成年树和幼苗)表达,幼苗根部Pdb SKOR在转录水平受缺钾、干旱和低温胁迫的调控; PdbSKOR是山新杨根部主导K+外排的通道。     

杨树抗逆转录因子基因内SSR标记的开发

利用直接测序法开发小叶杨抗逆转录因子基因内一套新的核基因组SSR标记。通过对3个抗逆转录因子共21个成员在36个小叶杨基因型个体中的序列比较分析后共检测到31个SSR多态性位点,SSR出现的频率为1/1916bp。在小叶杨自然群体中,SSR多态性位点的碱基重复呈现出2～5碱基形式,基元重复次数变异范围为3～20次,其中以二碱基重复的位点较多,占总数的51.6%。在此基础上,依据SSR位点两侧的保守序列,设计31对SSR位点PCR扩增引物对。利用设计的引物检测所开发的SSR位点在杨属内22个基因型个体中PCR扩增的有效性及SSR位点的保守性。PCR扩增结果显示,93.5%的SSR位点能够在杨属内至少4个派内有效扩增,每对引物组合可检测到SSR多样性位点数3～12个,平均6个。基于抗逆转录因子基因内开发的SSR标记位点为分子标记辅助小叶杨抗逆性状育种提供工具。