北京油鸡胚胎肝脏间充质干细胞的生物学特性

从7日龄北京油鸡胚胎肝脏中分离间充质干细胞,原代培养并传代至15代,免疫荧光法检测造血祖细胞/肝卵圆细胞的表面标志物CD34、CK19呈阴性表达; RT-PCR检测CD29、CD44、CD71、CD73呈阳性表达。尝试不同培养条件对细胞生长曲线的影响,选取最佳培养方案,同时对细胞进行细胞周期测定。肝脏间充质干细胞通过不同诱导液被成功诱导分化成脂肪细胞、心肌细胞,结果表明,从鸡胎肝中分离获得的间充质干细胞具有和人类间充质干细胞相似的生物学特性及分化潜能,其所具有多向分化的潜能,为今后临床广泛应用提供了可能。     

山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及向神经细胞诱导分化的研究

采用体外细胞培养技术将山羊胎儿骨髓中的干细胞从骨髓血中分离并培养扩增;分别用含β-巯基乙醇或当归的培养液诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞,免疫组织化学鉴定神经丝蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达.结果表明,通过贴壁培养法,可使低丰度的山羊骨髓间充质干细胞在体外实现分离扩增;诱导后的细胞强表达神经丝蛋白和神经元特异性烯醇化酶.还建立了一种简单易行的体外分离与培养山羊骨髓间充质干细胞的方法,同时表明山羊骨髓间充质干细胞同样具有分化为神经细胞的潜能,为今后对某些疾病的治疗提供了理想的动物模型.     

鸡脂肪源间充质干细胞的分离与鉴定

【目的】建立鸡脂肪源间充质干细胞的分离与鉴定方法.【方法】用I型胶原酶消化法分离天露黄鸡脂肪间充质干细胞(AMSCs),CCK-8检测细胞生长活力,RT-PCR鉴定其特异性标记物,化学法对其进行成脂和成骨分化诱导.【结果和结论】原代及传代的细胞呈成纤维细胞样形态,并能传代至10代,其活力无明显变化;细胞生长曲线呈S型;RT-PCR检测显示AMSCs的特异性标志物CD71、CD44和CD29表达呈阳性,而属于造血干细胞的特异性标志物CD34和CD45呈阴性;AMSCs通过不同诱导液被成功诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,在成脂分化过程中有脂滴形成,油红O染色呈阳性,过氧化物酶体增殖物激活受体基因γ(PPARγ)和脂肪酸基因(FAS)的mRNA表达量升高;在成骨分化过程中有钙结节形成,茜素红染色呈阳性,碱性磷酸酶(ALP)活性检测对照组与诱导组比较差异显著(P﹤0.05),ALP基因和骨形态发生蛋白基因(BMP2)的mRNA表达量升高.研究表明,鸡AMSCs具有分化为多种细胞的潜能.     

人骨髓间充质干细胞培养、鉴定及成骨细胞诱导分化

目的建立成人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)体外分离、培养、鉴定及向成骨细胞诱导分化的方法。方法骨髓标本取自医院股骨颈骨折手术患者,结合密度梯度离心法和贴壁筛选法分离纯化hBMSCs,倒置显微镜及流式细胞仪对细胞形态及表型进行鉴定。扩增到第三代的细胞应用成骨细胞诱导分化培养基培养,碱性磷酸酶及茜素红染色鉴定。结果细胞原代培养96h后,镜下观察细胞呈长梭型、多角型贴壁生长;接种8d后细胞呈漩涡状排列。经流式细胞术鉴定细胞表面标志物CD44、CD73阳性,CD34、CD45阴性。第三代细胞成骨诱导14d后,经碱性磷酸酶染色细胞胞质中可见浅蓝色至棕黑色细小颗粒;成骨诱导21d后,经茜素红染色可见红色钙结节。结论通过密度梯度离心及贴壁筛选相结合的方法能够分离培养出较高纯度的hBMSCs,在体外具有向成骨细胞分化的潜能,可能作为骨组织工程理想的种子细胞来源。     

犬脂肪间充质干细胞的分离、分化与鉴定

[目的]本试验旨在分离、多向诱导分化并鉴定犬脂肪间充质干细胞。[方法]无菌条件下采取经过健康筛查的犬腹部脂肪,机械剪碎,采用1 g·L~(-1)胶原酶Ⅰ型消化,用DMEM+10%FBS培养,观察细胞形态特征,流式细胞术分析细胞表面抗原标志的表达,并检测其体外成脂、成骨、成软骨分化能力。[结果]运用酶消化法可以从犬新鲜脂肪组织中分离到脂肪间充质干细胞,流式分析结果显示其高表达CD29(99.9%),低表达CD34(0.5%)和CD45(0.3%)。这些细胞在体外经诱导可以分化成为骨、软骨和脂肪。[结论]犬腹部脂肪组织中分离得到脂肪间充质干细胞,这些细胞具有多向分化能力。     

犬骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

为了体外高效快捷地分离培养犬(canine)骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),实验分别用全骨髓差速贴壁法和密度梯度离心法对犬BMSCs进行分离培养,利用免疫组化和流式细胞术检测获得细胞的表面标志抗体,并用成骨和成脂方向的诱导分化等方法对其进行鉴定。结果表明,全骨髓差速贴壁法和密度梯度离心法都能成功培养出犬BMSCs,但后者相对前者获得的细胞经培养后其原代细胞分布更均匀,原代培养达到传代所需的时间更短,成活率更高;两种方法获得的P3和P8细胞的生长曲线基本保持一致;免疫组化和流式细胞术检测犬BMSCs表达CD105、CD90和CD29,但是不表达CD34和CD31;且能成功诱导为成骨细胞和脂肪细胞。证明采用全骨髓差速贴壁法和密度梯度离心法均能够成功分离和培养犬的BMSCs,而密度梯度离心法是一种较全骨髓差速贴壁法更适合犬BMSCs的分离方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养方法的研究

[摘要〕目的研究在体外培养和纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法〔方法采用改良全骨髓贴壁 方法,分离和纯化3-4周的大鼠BMSCs,镜卜连续观察细胞的形态变化、流式细胞仪鉴定其表面抗原CD45和CD29 均表达情况〔结果原代培养的细胞呈圆形和梭形等,24 h后大部分细胞均贴壁〔8-10 d可达800Ic-90%融合,纯化 青传代周期为6-8 d〔流式细胞术鉴定表明C D45阴性,CD29阳性〔结论改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠 }''J骨髓间充质干细胞,是一种比较理想的分离培养方法、     

梅山猪骨髓间充质干细胞的分离培养及生物学特性分析

为建立梅山猪骨髓间充质干细胞(BMSC)体外分离培养方法及对梅山猪BMSC的生物学特性进行分析,本研究采用全骨髓法分离培养并传代梅山猪BMSC,倒置相差显微镜下观察细胞形态,以计数法检测细胞增殖状况,流式细胞术检测细胞周期,细胞压片进行染色体分析,免疫细胞化学和RT-PCR法检测细胞表面标志和转录因子的表达情况,并检测成骨和成脂分化能力.结果显示:梅山猪BMSC体外生长良好,细胞形态呈成纤维细胞样,具有稳定分裂增殖能力;CD29、CD44、CD90等表面标志基因及Fou5F1、Sox2、Nanog等转录因子基因表达呈阳性,CD45、Lin28表达呈阴性;在特定诱导液作用下,BMSC可分化为成骨样细胞及成脂肪样细胞.采用全骨髓法成功分离培养出大量纯度较高的梅山猪BMSC,其生长状态良好,可作为后续BMSC相关研究的种子细胞.     

鸭胚脐带间充质干细胞的分离培养及其生物学特性

为了给脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)的临床应用提供依据,以鸭胚UCMSCs为研究对象,采用胶原酶Ⅳ消化法分离脐带间充质干细胞,用表面标记分子CD29,CD44,CD71,CD73对纯化细胞进行鉴定,建立了鸭胚UCMSCs的体外培养体系。结果表明,UCMSCs能够诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞,证明了鸭胚UCMSCs的多能性。     

奶牛脐带间充质干细胞的体外培养与鉴定

[目的]在无菌环境下截取新生牛脐带20 cm,在体外进行原代奶牛脐带间充质干细胞分离培养,建立原代奶牛脐带间充质干细胞分离、培养、传代的方法,并进行形态学观察和多向分化能力检测.[方法]采用多重酶混合消化法,分离出原代奶牛脐带间充质干细胞,通过倒置显微镜下观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,向成脂、成骨诱导分化.[结果]培养出了奶牛脐带间充质干细胞.倒置显微镜下观察,细胞形态呈相对均一的梭形,平行排列生长或呈旋涡状生长.能够诱导分化为成脂、成骨细胞.细胞增殖能力强,可多次传代.[结论]胰酶消化法能够快速分离出原代奶牛脐带间充质干细胞,所获得的细胞纯度较高,具有一般间充质干细胞的生物学特性,具有多向分化潜能.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

为了确定大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)体外分离和培养的方法,建立了稳定的MSCs体外培养扩增体系,通过密度梯度离心和贴壁筛选法分离培养大鼠MSCs,观察了细胞的形态,研究了其增殖及生长特征,并应用流式细胞术测定了细胞周期及CD29,CD44,CD45和HLA-DR的表达。结果表明,在体外培养条件下大鼠MSCs贴壁生长,为成纤维细胞样;CD45和HLA-DR的表达呈阴性,CD29和CD44的表达呈阳性;细胞周期的G0/G1期约占95%,具有原始细胞的特征。说明建立的体外培养扩增体系可获得形态单一、生长稳定、增殖性较强、较均一的大鼠MSCs。     

牛胎肺间充质干细胞体外培养及生物学特性研究

[目的]建立牛胎肺间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）体外培养体系并对其进行生物学特性研究。[方法]取3～5月龄牛胎儿肺脏,得到MSCs。通过控制胰酶消化时间,去除难消化的上皮样贴壁细胞,获得纯化的牛肺MSCs,研究其形态、增殖情况及体外诱导分化潜能。[结果]牛胎肺MSCs可在体外扩增培养,传至24代以上,表达CD29、CIM4和CDl66,不表达CDM、CIM5和BOL-DR,并具有向成骨细胞诱导分化的潜能。[结论]从牛胎肺中可以分离出MSCs,可以在体外培养,并可诱导分化为成骨细胞。     

马脐带间充质干细胞的分离培养与生物学特性研究

【目的】建立马脐带间充质干细胞（UC-MSCs）体外分离培养体系,研究其增殖能力、分化能力和生物学特性,为推广UC-MSCs在赛马运动损伤治疗方面的应用提供理论依据。【方法】采用I型胶原酶消化法从脐带组织分离马UC-MSCs,通过绘制生长曲线及计算群体倍增时间检测其体外增殖能力,结合流式细胞仪检测和RT-PCR扩增鉴定表面标志物（CD29、CD44、CD45、CD73、CD90和CD105）,并通过体外成脂成骨诱导分化检测其分化潜能。【结果】分离获得的原代马UC-MSCs为折光性强的圆形悬浮细胞,培养10 d后细胞融合达90%,且传代后细胞增殖速度明显提高,传代至P3代,细胞呈旋涡状生长,形态为均一的长梭形,生长趋势符合Logistic生长曲线规律,呈典型的S形。流式细胞仪检测结果显示,马UC-MSCs高表达CD29、CD44和CD90,表达率分别为98.45%、97.08%和96.56%,呈强阳性,但不表达CD45;RT-PCR扩增结果表明,马UC-MSCs表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105等MSCs表面标志物基因,但不表达CD45基因。以胰岛素、IBMX、罗格列酮和地塞米松为主要试剂进行马UC-MSCs体外成脂诱导,诱导第10 d发现细胞内有小脂滴形成,至诱导第18 d有大量脂滴形成;选用抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松为主要试剂进行体外成骨诱导,至诱导第7 d可观察到钙结节形成。【结论】采用I型胶原酶消化法分离获得的马UC-MSCs纯度高,且具有良好的体外增殖能力和多向分化潜能;掌握好马UC-MSCs的有效冻存方式,可为治疗赛马运动损伤提供优质的种子细胞。     

Characterization and Differentiation into Adipocytes and Myocytes of Porcine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

Bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） could differentiate into various cell types including adipocytes and myocytes, which had important scientific significance not only in the field of tissue regeneration, but also in the field of agricultural science. In an attempt to exhibit the characterization and differentiation into adipocytes and myocytes of porcine BMSCs, we isolated and purified porcine BMSCs by red blood cell lysis method and percoll gradient centrifugation. The purified cells presented a stretched fibroblast-like phenotype when adhered to the culture plate. The results of flow cytometry analysis and immunofluorescence staining demonstrated that the isolated cells were positive for mesenchymal surface markers CD29, CD44 and negative for hematopoietic markers CD45 and the adhesion molecules CD31. Cells were induced to differentiate into adipocytes with adipogenic medium containing insulin, dexamethasone, oleate and octanoate. Oil Red O staining demonstrated that the porcine BMSCs successfully differentiated to adipocytes. Moreover, the findings of real-time PCR and Western blotting indicated that the induced cells expressed adipogenic marker genes （PPAR-y, C/EBP-c~, perilipin, aP2） mRNA or proteins （PPAR-3,, perilipin, aP2）. On the other hand, porcine BMSCs were induced into myoctyes with myogenic medium supplemented with 5-azacytidine, basic fibroblast growth factor, chick embryo extract and horse serum. Morphological observation by hochest 33342 staining showed that the induced cells presented as multi-nucleus muscular tube structure. And myogenic marker genes （Myf5, desmin） mRNA or proteins （MyfS, MyoD, myogenin, desmin） were found in the induced cells. In addition, the results of immunofluorescence staining revealed that myogenic marker （Myf5, MyoD, myogenin, desmin, S-MyHC） proteins was positive in the induced cells. Above all, these results suggested that the isolated porcine BMSCs were not only consistent with the characterization of mesenchymal stem cells, but also exhibited the multipotential capacity to form adipocytes and myocytes, which provided the basis to investigate the regulation mechanism involved in the selective differentiation of porcine BMSCs.     

红细胞裂解法及不同培养条件对兔骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

研究采用红细胞裂解液法从兔骨髓中分离BMSCs,相差显微镜观察其形态,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)筛选基础培养液和血清浓度,绘制生长曲线,用流式细胞仪检测细胞周期,免疫细胞化学鉴定表面抗原。分离的细胞在形态学观察与生长动力学上均符合BMSCs特征;在实验范围内DMEM/F12+20%FBS是体外培养兔BMSCs的最佳体系;细胞周期结果显示,BMSCs平均82%处于G0/G1期,18%处于S+G2期;免疫细胞化学结果显示所分离的BMSCsCD90、CD44阳性表达,CD34阴性表达。本研究结果表明,通过红细胞裂解液法分离的兔BMSCs,其具有体外增殖和多向分化的潜能,可以作为组织工程的种子细胞。     

固始鸡脐带间充质干细胞原代培养及其诱导分化潜能研究

为了研究固始鸡脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs）的生物学特性和诱导分化,对其进行原代培养及定向诱导分化研究。选取14日龄固始鸡鸡胚的脐带组织,剥离脐带动、静脉,将华通胶部分剪成1 mm³大小,采用胶原酶消化法分离细胞并进行原代培养,观察细胞形态,绘制P3、P9、P15代生长曲线并测定群体倍增时间及克隆形成能力。结果表明,固始鸡UCMSCs形态为长梭形,生长趋势符合Logistic生长曲线规律,呈典型的S形;免疫荧光和RT-PCR结果显示,固始鸡UCMSCs表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD166等间充质干细胞表面标记物基因,但不表达原始造血祖细胞标志物CD34和泛白细胞标志物CD45;经特异性染色和RT-PCR表明,体外诱导固始鸡UCMSCs可分化为脂肪、成骨和成软骨细胞。从固始鸡脐带华通胶中分离所获得的UCMSCs具有良好的体外增殖能力和分化潜能,与从其他物种体内分离的UCMSCs具有相似的生物学特征,它们的多项分化能力预示着细胞移植的应用前景,可为再生医学和组织工程学提供新的潜在种子细胞。     

h1-calponin基因对五指山小型猪骨髓间充质干细胞体外成骨分化的影响

【目的】通过碱性调宁蛋白（h1-calponin）基因与五指山小型猪骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BM MSCs）成骨分化关系的研究,探讨成骨分化机制。【方法】添加成骨分化液对BM MSCs进行成骨分化诱导,采用茜素红染色的方法鉴定细胞成骨分化的程度;通过定量PCR分析h1-calponin基因及成骨相关基因骨桥蛋白（osteopotin,OPN）、骨钙蛋白（osteocalcin,OCN）、核心结合因子α1（core binding factor a1,Cbfα1）及核心结合因子β（core binding factor beta,Cbfβ）表达谱。【结果】①随着诱导时间的延长,茜素红染色矿化结节逐渐增多;②成骨标志基因OPN和OCN表达趋势一致：诱导0至14 d,基因表达量呈增长趋势,诱导14 d表达量最高,而后下降;成骨相关基因Cbfα1和Cbfβ表达量于第7天达到最高峰,之后逐渐下降,但仍高于诱导前;③h1-calponin基因表达量随着诱导的延续逐渐下降;诱导14—21 d时,该基因基本不表达。【结论】h1-calponin基因的表达与五指山小型猪骨髓间充质干细胞体外成骨分化存在着负相关,可能是成骨分化的负调控基因。     

小鼠MSCs体外定向诱导分化神经及脂肪细胞的研究

 【目的】建立昆明小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养体系,并鉴定其定向诱导分化为神经及脂肪细胞的能力。【方法】采用贴壁培养法分离培养昆明小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,通过相差倒置显微镜对其进行形态学特征观察;通过碱性磷酸酶（AKP）染色、Hoechst 33258染色、瑞士-姬姆萨复合染色检测MSCs的表型特征;通过β-ME诱导MSCs定向分化为神经样细胞,诱导后的细胞进行H.E染色,观察其形态学特性;通过NF-200、NSE免疫荧光细胞化学方法对已分化的神经样细胞进行鉴定和分化率分析;通过马血清诱导MSCs定向分化为脂肪细胞,观察其体外生长过程,并对诱导后的脂肪细胞进行油红O染色鉴定和分化率分析。【结果】分离得到的MSCs为成纤维样细胞,可见多个核仁,AKP染色阳性率为93.2%±1.5%;β-ME诱导后,MSCs分化为多种表型的神经细胞与原代培养的小鼠全脑细胞的外形相似,诱导后的神经细胞NF-200、NSE免疫荧光细胞化学染色均呈阳性,NF-200阳性率为85.4%±1.8%,NSE阳性率为82.7%±2.1 %;马血清诱导后,MSCs可100%分化为脂肪细胞,油红O染色为阳性。【结论】 采用贴壁培养法能够成功分离和培养昆明小鼠的MSCs,分离得到的MSCs具有定向分化成多种神经细胞和脂肪细胞的能力。     

八肽胆囊收缩素对骨髓间充质干细胞诱导分化后神经元样细胞生长状态的影响

为探讨八肽胆囊收缩素(CCK8)对骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导分化后神经元样细胞生长状态的影响,在β-巯基乙醇诱导MSCs分化的基础上加入CCK8,观察诱导期间细胞形态变化及分化细胞的存活时间,免疫细胞化学法鉴定神经元特异性巢蛋白(Nestin)的表达,唑盐比色实验(MTT)法检测细胞活性。结果表明,加入CCK8的部分实验组与基础诱导组相比,可延长神经元样细胞的生存时间;诱导后5 h,Nestin阳性表达率变化不明显(P>0.05),诱导后10 h,神经元样细胞的活性可明显增强(P<0.05)。该结果说明,CCK8在β-巯基乙醇体外诱导大鼠MSCs分化为神经元样细胞后的过程中,可一定程度延长细胞的存活时间,具有抗细胞凋亡作用。     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养

为探讨体外分离及培养扩增兔骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法,无菌采取兔股骨,用含20%FBS的DMEM培养液冲骨髓腔,采用全骨髓细胞贴壁培养法对MSCs进行纯化扩增,倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况、绘制细胞生长曲线。结果显示,MSCs为贴壁生长细胞,形态均匀呈纤维样,增殖能力强,多次传代仍能保持其生物学特性。采用全骨髓贴壁培养法能够较好地纯化和扩增MSCs。