日本落叶松杂种及亲本 4CL基因的克隆和SNP多态性分析

以日本落叶松(Larix kaempferi)不同杂交组合为材料,依据转录组测序信息,成功获得了11种日本落叶松材料的4 CL基因的编码区序列,该序列长1 537 bp,包含完整ORF片段1 368 bp,编码455个氨基酸。qRT-PCR结果分析表明,除日本落叶松Larix16×Larix61组合外,Larix82×Larix13、Larix40×Larix10和Larix82×Larix61子代的表达均高于双亲,推测4 CL基因差异表达与落叶松杂种的木质素生物合成有关。进一步采用SNP标记方法和DNAMAN软件对不同日本落叶松杂种和亲本组合的单核苷酸多态性进行分析。共检测到66个SNP多态性位点,表明日本落叶松4CL 具有丰富的遗传多样性。66个SNP变异中,属于三突变1个;转换类型45个,占总变异的68.18%;20个属于颠换类型,占总变异的30.30%,转换:颠换=9:4。在转换类型中,A/G和C/T转换分别占28.79%和39.39%;颠换类型中A/C、A/T、G/C、G/T分别占4.55%、9.09%、9.09%和7.58%。采用NJ 聚类法对克隆片段的氨基酸序列进行了遗传多样性分析。     

辽东山区日本落叶松生长差异的研究

利用森林资源二类调查的数据成果,对丹东、本溪、抚顺、铁岭4个地区日本落叶松生长状况进行分析,提出了日本落叶松在上述4个地区的生长规律,以指导营林生产活动.     

日本落叶松林分和基因资源保存林研究

笔者通过了1989~2004年间对日本落叶松林分和基因资源保存林研究,试验结果表明林分间生长差异大,从日本落叶松112个林分中选肓出最优良林分11个,14a生材积比对照提高22.5%。现保存有111个林分,共有4689株林木。     

日本落叶松同工酶变异的基因分析及无性系鉴别

同工酸可作为遗传图谱构建和无性系鉴别的重要遗传标记．以92个日本落叶松无性系种子为实验材料，采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳法，取其胚乳进行了同工酶分析，结果表明：11种酶系统至少由24个基因座所控制，多数座位存在2个或2个以上的等位基因；多数座位等位基因的基因频率差异很大；各无性系之间至少在一个以上的基因座上存在差异．并确定了92个无性系的同工酶基因型．     

日本落叶松小RNA文库构建及其microRNA鉴定

以2年生日本落叶松实生苗为材料构建其小RNA文库,对283个克隆进行PCR验证后测序,通过生物信息学分析鉴定文库中的microRNA并进行qRT-PCR验证。结果表明:(1)小RNA文库的体积为50 mL,总库容量为5.25×106cfu,重组率为92.6%,插入片段长度约65 bp,与小RNA连接片段长度吻合。(2)去除rRNA(86个)、tRNA(14个)等非目的序列后,获得日本落叶松28个保守miRNAs,属于17个miRNA家族;其中,15个miRNAs(miR159c、miR160a、miR162a、miR164b、miR165a、miR166a、miR166a*、miR166b*、miR169a、miR169b、miR171a、miR171b、miR172a、miR319b、miR396a)的序列与其它植物完全一致,其余13个miRNAs(miR156a、miR159a、miR159b、miR164a、miR166b、miR168a、miR169b*、miR319a、miR396b、miR408、miR482a、miR2111、miR3701)则高度相似。(3)测序结果与本室落叶松转录组数据进行序列比对,新发现4个miRNAs(lle-miR1、lle-miR2、lle-miR3、lle-miR4)及其前体。(4)qRT-PCR验证表明,miR159a、miR159b等16个保守的和lle-miR1 lle-miR4等共20个miRNAs存在于日本落叶松中。(5)通过靶基因预测及UniProt数据库分析发现,32个miRNAs中有24个对应69个靶基因,其功能主要为转录因子、信号转导、胁迫抗性和代谢相关酶及未知功能蛋白。     

日本落叶松LaSPL2和LaSPL3在体细胞胚发育中的表达分析

[目的 ]通过研究LaSPL2和LaSPL3的分子特征和表达模式,揭示其在落叶松体细胞胚发育中的功能。[方法 ]利用同源克隆及RACE技术,获得LaSPL2和LaSPL3的全长cDNA序列,通过生物信息学分析其编码蛋白保守结构域、进化关系等,利用烟草瞬时表达体系进行亚细胞定位研究,采用qRT-PCR检测2个基因在落叶松体细胞胚发育过程的表达模式。[结果 ]本研究获得了2个落叶松SPL同源基因LaSPL2和LaSPL3,分别编码532个氨基酸和191个氨基酸,其c DNA序列均存在miR156识别位点。多序列比对分析发现:它们均具有保守的SBP结构域。亚细胞定位结果显示:LaSPL2和LaSPL3定位于细胞核中。qRT-PCR结果表明:在落叶松体细胞胚发育早期,ABA下调LaSPL2和LaSPL3表达;随着体细胞胚的进一步发育,LaSPL2和LaSPL3的表达水平分别在10 d和14 d达到峰值;之后随着体细胞胚发育成熟,它们的转录水平逐渐下降,并在42 d达到最低值。[结论 ]通过分析ABA缺失对LaSPL2和LaSPL3表达的影响,表明ABA可能是落叶松体细胞胚发育早期LaSPL2和LaSPL3下调表达的主要因子;LaSPL2和LaSPL3的表达量在体细胞胚发育的早期阶段均达到最高峰,表明它们可能是早期胚胎形成的一个重要调控因子;LaSPL2和LaSPL3序列分析及表达模式,表明它们在体细胞胚发育中可能受miR156调控,并在体细胞胚的成熟过程中具有重要意义。     

日本落叶松 UDPGDH基因的cDNA克隆和表达分析

以日本落叶松杂交Solexa转录组测序获得的数据为依据,经拼接后获得尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(UDPGDH)原序列,以该序列两端设计引物,在落叶松亲代和子代幼嫩针叶中成功克隆了UDPGDH基因cDNA序列,序列长1 443 bp,编码480个氨基酸。qRT-PCR结果分析表明:UDPGDH基因的表达量在落叶松杂交子代中远远高于亲本,正交子代的表达比反交子代高,说明UDPGDH在形成细胞壁半纤维素前体物过程中起着非常重要的作用,暗示UDPGDH在子代的高表达有利于杂种优势的形成。     

日本落叶松纤维素合酶基因片段的克隆及单核苷酸多态性分析

[目的]纤维素合酶(cellulose synthase,CesA)在植物纤维素合成途径中发挥主要调节作用,是控制木材纤维品质和产量的重要基因.从日本落叶松中分离克隆与纤维素合成相关的LkCesA基因,并对其进行核苷酸多样性以及连锁不平衡分析,为在日本落叶松中开展基于LkCesA基因的连锁不平衡作图及其辅助日本落叶松木材纤维性状的分子育种提供理论依据.[方法]依据日本落叶松转录组数据库检测到的纤维素合酶(CesA)基因ESTs序列设计引物,从日本落叶松中分离获得LkCesA基因片段.在此基础上,利用DnaSP5.0软件对日本落叶松40株基因型个体的LkCesA序列进行核苷酸多样性和连锁不平衡分析.[结果]从日本落叶松中成功克隆了CesA基因片段:该片段长1 209 bp,包含部分开放阅读框,长度为1 053 bp,可编码350个氨基酸,所推导的蛋白质氨基酸序列与火炬松Pt-CesA2的蛋白质氨基酸序列同源性为95.4％.在日本落叶松40株基因型个体的LkCesA序列中共检测到83个SNP位点,SNP发生频率为1/21 bp,多样性指数πT为0.006 05.在这些SNPs中,69个属于转换,14个属于颠换,其中19个为常见SNPs,64个为罕见SNPs.在外显子区域,共检测到54个SNP位点,其中34个为错义突变,20个为同义突变.进一步的连锁不平衡分析显示,随着核苷酸序列长度的增加,SNP连锁不平衡程度逐渐减弱.[结论]克隆到的LkCesA为植物CesA基因家族中的一员.LkCesA基因的连锁不平衡在基因内部就已衰退,说明选择该基因作为候选基因,在日本落叶松中开展连锁不平衡作图用于指导日本落叶松的定向培育及木材品质改良是可行的.此外,在LkCesA基因中检测到多个常见SNP位点,为进一步开展该基因的连锁不平衡作图提供了材料.     

辽宁岫岩地区日本落叶松优良家系种子品质筛选研究

以辽宁岫岩地区日本落叶松(Larix kaempferi)种子园的优良家系的种子为研究对象,测定种子净度、千粒质量、优良度及活力指标,以筛选日本落叶松优良家系。结果表明:种子净度间差异不显著,以358号最高;种子千粒质量间差异显著,以358号最高;种子优良度间差异显著,以167号最高;种子生活力间差异显著,以167号最好;种子品质分析中,18、182、120、74、89、358、188、233、12的种子品质属于优良水平。     

日本落叶松扦插生根过程中SSH文库构建及主要表达基因分析

为研究日本落叶松在扦插生根过程中基因的表达情况,以日本落叶松扦插生根率存在显著差异的2个优良全同胞无性系为材料,构建差异表达cDNA文库,获得正、反2个消减文库。随机挑取正库和反库各500个克隆进行测序,将测序结果整理后,正库得到272个UniEST,反库得到249个UniEST。这些UniEST分别属于新陈代谢、信号途径、物质运输、抗性相关、生长发育等类别基因,可能在扦插生根过程中具有重要作用。其中,获得10个与激素相关的基因,表明激素在日本落叶松扦插生根过程中发挥重要作用。除激素类基因外,还获得小G蛋白、ABC转运蛋白类、因伤诱导物质等相关基因。上述结果表明,日本落叶松扦插形成不定根是一个非常复杂的过程,在这个过程中激素相关基因起到关键作用,同时其它类别基因也发挥重要作用。     

日本落叶松体细胞胚胎发生相关基因LaSERK1的克隆与表达分析

本研究克隆了日本落叶松体细胞胚胎发生相关受体类蛋白激酶基因 LaSERK1,并检测了在不同培养条件下LaSERK1的表达情况,发现LaSERK1与已发现的其他物种SERK1 基因有高度相似性,qRT-PCR结果显示： LaSERK1在体胚发生早期高表达。结果表明：LaSERK1可能在落叶松体胚发育早期起重要作用,LaSERK1 也可能成为早期胚性细胞的标记基因。     

多基因共表达载体构建的研究进展

多基因共表达载体在研究多外源基因的表达及蛋白互作实验中有着广泛的应用,可以简化相关实验流程,提高基因表达效率。本文就载体构建技术、多启动子共表达载体的构建、多顺反子共表达载体的构建等现状作了综述,并对多基因共表达载体未来的发展趋势进行了展望,以期为构建多基因共表达载体提供参考。     

落叶松LaIAA2基因的克隆及表达分析

以落叶松扦插生根率存在显著差异的2个优良全同胞无性系茎和根为材料,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建正、反2个落叶松扦插生根过程差别表达cDNA文库。序列分析获得1个AUX/IAA基因片段。运用Race技术,成功获得这个Aux/IAA基因的全长。同时,运用实时定量PCR和半定量PCR技术分析这个基因的表达谱,结果表明:LaIAA2基因在茎中高表达,叶中低表达。在生长素处理后,LaIAA2基因表达明显增加,表明这个基因受生长素调控。     

落叶松体胚发育中12个针叶树特异microRNAs表达分析

以落叶松体细胞胚胎发育8个阶段的材料构建小RNA文库,进行了Solexa测序、miRNA鉴定、靶基因预测、qRT-PCR定量分析等研究。结果表明:发现的87个miRNAs中,29个为针叶树特异的,来自12个家族,分别为miR946、miR947、miR950、miR951、miR1311、miR1312、miR1313、miR1314、miR1316、miR3701、miR3702和miR3704,其中25个长度为22nt,且在小RNA文库中的最低拷贝数为18(miR1311),最高拷贝数为33 009(miR950)。发现12个miRNA家族的34个靶基因可能参与生长发育、抗病、AGO反馈调节等多方面遗传调控;qRT-PCR分析表明:72%miRNAs表达次高峰在后期单胚或早期子叶胚,在中期子叶胚最低,最高峰在后期子叶胚,分别与子叶形成、胚胎后熟、胚胎休眠的生理活动相吻合,而miRNA前体的表达模式不同于miRNA,前体变化幅度小于成熟体。     

日本落叶松咖啡酸-O-甲基转移酶基因 LkCOMT的克隆及单核苷酸多态性分析

依据日本落叶松转录组数据库检测到的咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)基因ESTs序列设计引物,分离得到一个编码该酶的新基因。其cDNA克隆全长为1 350 bp,包含长度为1 092 bp的开放阅读框,可编码364个氨基酸残基。序列分析显示,所推导的蛋白质氨基酸序列包含COMT基因5个所特有的保守元件,与海岸松PpCOMT的蛋白质氨基酸序列同源性达94%。在此基础上,利用DnaSP5.0软件对日本落叶松40株基因型个体的LkCOMT序列进行了单核苷酸多样性SNPs分析,共检测到92个SNP位点,SNP发生频率为1/17 bp,多样性指数π_T为0.007 80。在这些SNPs中,65个属于转换,27个属于颠换。在外显子区域,共检测到58个SNP位点,其中37个为错义突变,21个为同义突变。研究结果为日本落叶松基因标记辅助育种提供了理论基础。     

小陇山林区引种日本落叶松及其速生丰产林营造管理技术

本文从技术、经济和管理等因素论述了甘肃省小陇山林区引种日本落叶松的可行性 ,并对引种 11年生幼树的生长表现进行了对比分析。结果表明 ,该地引种日本落叶松已初步获得成功 ,可进一步推广应用。同时介绍了日本落叶松速生丰产林的营造及管理技术     

日本落叶松谷胱苷肽还原酶的生化特性研究

本研究从日本落叶松中克隆到一个谷胱苷肽还原酶(GR)基因,命名为LaGR。该基因编码563个氨基酸组成的蛋白质,预测分子量为61.06 kDa。表达模式分析发现LaGR基因在芽、成熟针叶、茎韧皮部和根韧皮部均表达,是组成型表达基因。蛋白质亚细胞定位研究发现LaGR蛋白定位在叶绿体。在大肠杆菌中表达并纯化了LaGR重组蛋白。酶学性质分析发现,LaGR蛋白对底物GSSG和NADPH具有较高的催化活性和亲和力,是热稳定蛋白,而且最适pH值范围在7.0 9.0之间。Cd²⁺、Pb²⁺和Cu²⁺等重金属离子对LaGR蛋白的催化活性具有明显的抑制作用。将LaGR蛋白的第528位His突变为Gln后,其突变蛋白的催化活性显著降低,而且与野生型LaGR蛋白相比,突变蛋白的动力学常数、最适pH值范围和热稳定性均发生了显著变化,预示着第528位的His在LaGR的催化特性和蛋白结构稳定性方面发挥着重要作用。     

日本落叶松种子园花粉散发及其空间分布特征

对湖北省建始县长岭岗林场日本落叶松种子园内花粉散发和空间分布特征进行2年的研究.结果表明:日本落叶松花粉散发受气候因子的影响很大;整个散粉期间日本落叶松花粉散发量呈现低-高-低的节律,每天花粉散发量呈极显著差异;散粉期间出现一个散粉高峰期,一般持续3~5 d,散粉高峰期间每天不同时间段的散粉量也呈现低-高-低的节律,散粉高峰时间段出现在8∶00~16:00,具体时间段受当日天气的影响,每天不同时间段内花粉散发量呈极显著差异;种子园内不同样点花粉散发量中,八方位花粉散发量及树冠内、中、外部花粉散发量均未达到显著性差异,花粉分布都呈均匀分布型;种子园内不同垂直高度花粉散发量呈极显著差异,花粉分布呈集群分布型.     

日本落叶松新鲜松针的化学成分及其抗氧化活性研究

研究了日本落叶松新鲜松针的化学成分及其抗氧化活性.采用Sephadex LH-20柱色谱及薄层色谱等方法进行分离,从其95%乙醇提取物乙酸乙酯溶性部分中分到7种化合物,经波谱分析及理化性质化合物分别鉴定为:儿茶素(1)、表儿茶素(2)、没食子儿茶素(3)、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷(4)、紫云英苷(5)、2"-O-鼠李糖牡荆黄苷(6)和cedrusin (7).7种化合物均首次从该植物中分得.经DPPH试验,测定了核酸溶性部分、二氯甲烷溶性部分、乙酸乙酯溶性部分、水溶性部分、粗提物及分得化合物的抗氧化活性.其中乙酸乙酯溶性部分及化合物1～3具有很强的抗氧化活性.     

辽宁省日本落叶松冠幅与胸径树高和林分密度相关模型及合理经营密度的研究

本文在研究树冠冠幅与胸径、树高和林分密度之间的相关模型基础上，利用林木生长发育所需要的营养面积约等于林木树冠面积，胸径生长与树冠营养面积紧密相关的理论，编制了日本落叶松合理经营密度表，为准确地决定间伐抚育的强度、起始期。重复期，以及间伐抚育方法等技术指标提供了依据。