曼地亚红豆杉愈伤组织诱导试验

以5年生曼地亚红豆杉当年生枝条的茎段、芽苞、叶片和幼嫩根为外植体,以MS添加不同质量浓度的2,4-D,NAA,KT为培养基进行愈伤组织诱导试验。结果表明:曼地亚红豆杉愈伤组织诱导培养基中生长素与细胞分裂素的比例应在10∶1左右;2,4-D与NAA的比例应在2∶1左右。当年生茎段是进行曼地亚红豆杉愈伤组织诱导的较好外植体,诱导率高,愈伤组织生长也较好。暗培养条件更有利于愈伤组织的诱导,诱导率高,且诱导出的愈伤组织质量好。35℃温水浸泡30 min的处理对抑制褐化有理想的效果,外植体褐化现象得到了极大抑制。     

农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化体系

【目的】优化杜仲叶片愈伤组织的再生体系,研究愈伤组织对抗生素和抑菌剂的敏感性,探索影响农杆菌介导杜仲愈伤组织遗传转化的最适转化因子水平,构建农杆菌介导的杜仲愈伤组织瞬时转化体系,使杜仲成年植株外植体为受体的遗传转化成为可能,为杜仲基因功能的研究与定向改良奠定基础。【方法】以杜仲成年植株叶片为材料诱导愈伤组织,通过添加不同浓度植物生长调节剂与大量元素的MS培养基进行不定芽的诱导与增殖,确定最适培养基。在此基础上,在培养基中添加不同浓度抗生素及抑菌剂,研究愈伤组织对其敏感性。以获得的叶片愈伤组织受体系统为基础,通过L_(16)(4~5)的正交试验,探索不同转化因子对农杆菌介导叶片愈伤组织遗传转化的瞬时转化效率的影响,建立最适瞬时转化体系。使用获得的瞬时转化体系对愈伤组织进行遗传转化操作,筛选抗性芽,对抗性芽进行GUS组织化学染色与PCR检验。【结果】再生体系优化的结果表明,3/4大量元素浓度的MS培养基能够促进杜仲愈伤组织不定芽的诱导及生长;愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS+0. 27μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,诱导率为83%±10. 0%;不定芽复壮的最适培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,平均伸长长度为(2. 47±1. 33) cm。抗生素与抑菌剂敏感性试验表明,遗传转化的选择培养基中,抑菌剂头孢霉素的最适浓度为200 mg·L~(-1),筛选用的抗生素卡那霉素最适浓度为70 mg·L~(-1)。转化因子的正交试验表明,最适的农杆菌介导杜仲叶片愈伤组织遗传转化的转化因子组合为:预培养5天、侵染10 min和共培养3天。使用最适瞬时转化体系对约200个愈伤组织进行遗传转化操作,共筛选获得3个抗卡那霉素的抗性芽; GUS组织化学染色显示GUS基因在抗性芽中得到了表达,PCR检测证明这些抗性芽中存在NPTⅡ基因。【结论】杜仲叶片愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS+0. 27μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,不定芽复壮的最适培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA。农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织瞬时转化体系为:预培养5天、侵染10 min和共培养3天,筛选培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA+200 mg·L~(-1)Cef+70 mg·L~(-1)Km。利用此体系共获得3个抗性芽,PCR分析和GUS组织化学染色都表明T-DNA已整合到抗性芽基因组中。     

新型扦插生根剂——高效催根剂

<正> 我们从1985年开始研究毛白杨的扦插生根问题,采用系列浓度的各种生长素类化合物处理长度为8—10厘米的硬枝插穗,在恒温培养箱中观察愈伤组织形成和生根情况。试验发现毛白杨愈伤组织生根比较困难,单纯增加生长素浓度虽能诱导出发达的愈伤组织,但对加速不定根的产生并没有多大帮助。前人在调节生长素与细胞分裂素比例控制烟草髓组织培养的器官分化的经典试验早已证明,虽然生长素比例较大时有利于生根,但在细胞分裂素水平过低或完金缺乏时,只增加生长素所形成的愈伤     

农杆菌介导的楸树遗传转化体系

【目的】以楸树胚性愈伤组织为受体,建立有效的楸树遗传转化体系,为今后楸树性状的遗传改良奠定基础。【方法】通过农杆菌EHA105介导以胚性愈伤组织作为外植体进行遗传转化,通过正交试验获得最优的遗传转化条件,进而将外源基因转入到楸树基因组中。【结果】在1/2 MS培养基中添加不同梯度浓度的卡那霉素(Kana)进行选择压力筛选,在添加了60 mg·L~(-1)Kana的1/2 MS培养基中,楸树胚性愈伤组织的分化率为0.00%,存活率仅为5.71%,因此确定60 mg·L~(-1)为遗传转化的选择压。采用正交设计L18(37)进行农杆菌介导的楸树遗传转化试验,通过GUS化学组织染色统计瞬时表达率,正交试验直观分析和单因素方差分析结果表明:在预培养时间为2天,采用农杆菌菌株EHA105、菌液浓度OD600值为0.7、添加乙酰丁香酮(AS)浓度为300μmol·L~(-1)、侵染时间为10 min,共培养时间为5天的条件下,农杆菌介导的转化效率最高,且对转化效率影响最大的2个因素是乙酰丁香酮浓度和预培养时间。对浸染后的胚性愈伤组织进行8个月的筛选培养,共获得32个抗性组织团,对其中15个增殖较多的抗性愈伤组织进行PCR检测,表明86.67%的抗性组织团中有外源基因整合到楸树基因组中。内源激素水平会对植物体细胞胚分化产生影响,细胞分裂素(CTK)和脱落酸(ABA)促进体胚发生,生长素(IAA)和赤霉素(GA)对体胚发生有抑制作用。通过测定内源激素可知,转基因的抗性组织中内源CTK和ABA水平显著低于野生型的楸树胚性愈伤组织,而内源IAA和GA则显著高于野生型胚性愈伤组织,推测内源激素水平可能是转基因抗性组织体胚分化能力比较差的原因。【结论】建立了农杆菌介导的楸树胚性愈伤组织的遗传转化体系,对筛选获得的15个抗性愈伤组织进行PCR检测,其中13个抗性愈伤组织中有外源基因的整合。内源激素水平的变化可能是导致楸树转基因抗性愈伤组织难以分化的原因。     

红叶石楠愈伤组织的诱导

研究了外植体类型、植物生长调节剂组合、光暗处理对红叶石楠品种"红罗宾"愈伤组织诱导的影响,结果表明:在NAA和BA不同配比的MS培养基上,均能从叶柄、叶片和节间诱导出愈伤组织;综合愈伤组织诱导率和愈伤组织松脆性,以叶柄和叶片在添加NAA 0.1 mg/L和BA 0.5 mg/L的MS培养基上诱导产生的愈伤组织最佳.叶柄和叶片诱导的愈伤组织能维持松脆状;节间发生的愈伤组织易转变为水渍状.暗培养可以抑制色素的产生从而有利于获得松脆的愈伤组织;春季愈伤组织的诱导率明显高于秋季.     

濒危植物峨眉拟单性木兰茎段腋芽及愈伤组织诱导

以峨眉拟单性木兰带芽茎段为外植体,MS、WPM、B5为基本培养基,添加不同浓度的细胞分裂素(6-BA)和生长素(IBA、NAA、2,4-D),以不同浓度组合进行腋芽和愈伤组织的诱导.结果表明,基本培养基的类型是腋芽诱导的主要影响因素,以高盐浓度的培养基B5效果较好,MS次之,细胞分裂素的浓度与生长素的比值为15∶1时较适合腋芽的诱导,比值调整为5∶1时有利于茎的伸长生长;愈伤组织的诱导中6-BA起主导作用,其次是2,4-D,再者是基本培养基和NAA,其中2,4-D浓度过高不利于愈伤组织的诱导.     

优系欧李茎叶愈伤组织诱导与植株再生

以欧李春季萌发的幼茎、叶片为外植体诱导愈伤组织的产生,结果表明:叶片愈伤组织培养以改良MS为基本培养基,附加NAA 1.0 mg/L IBA 0.5 mg/L BA 0.2 mg/L效果较好;茎段愈伤组织培养以改良MS附加2,4-D0.5 mg/L NAA 0.3 mg/L BA 0.15 mg/L诱导愈伤组织效果好;愈伤组织再诱导不定芽以1/3 MS附加BA2.0 mg/L IBA 0.01 mg/L培养基效果佳。     

中国水仙花器官愈伤组织诱导、分化及组织学观察

为了建立中国水仙遗传转化体系,为转基因分子育种提供良好受体,以中国水仙‘金盏银台’品种的不同花器官为实验材料,以MS为基本培养基,研究了花药、花梗、子房、花柄愈伤组织诱导情况.对愈伤组织诱导效果较好的花梗和花药培养基中添加不同浓度6-苄基腺嘌呤(6-BA)、硫酸腺嘌呤(Ad)、萘乙酸(NAA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D),筛选出愈伤组织诱导及鳞茎芽再生的最适培养基配方.结果表明:花梗愈伤组织诱导及鳞茎芽分化的最佳培养基为MS+1 g·L-1NaH2P04+0.003 g· L-16-BA+0.001 g· L-1NAA+0.2 g·L-1 Ad+30g· L-1蔗糖,花药愈伤组织诱导及鳞茎芽分化的最佳培养基为MS +0.002 g·L-16-BA +0.001 g·L-1 NAA +30 g·L-1蔗糖;花梗愈伤组织诱导到鳞茎芽分化的时间需要30～35 d,而花药这一过程为80～90 d.对花梗愈伤组织诱导及鳞茎芽分化过程进行组织学观察表明:本研究中产生的小鳞茎是由愈伤组织再分化得来的,表明花梗更有利于作为转基因受体,从而解决了转基因研究过程的一个瓶颈问题.     

不同激素配比对库拉索芦荟愈伤组织诱导的影响

以MS为基本培养基，添加不同浓度的2，4-D、NAA、KT或其组合，研究库拉索芦荟愈伤组织的诱导及生长情况。结果表明，两种生长素均可诱导出愈伤组织，但较高浓度的2，4-D易导致褐化，而高浓度的NAA诱导出的愈伤组织含水量较高，以两种生长素配合使用再辅以低浓度的KT效果较好，其中15mg/L的KT 4mg/L的2，4-D 0．1mg/L的KT的组合，愈伤组织诱导率达到90％，且愈伤组织生长较旺盛。     

香樟胚性愈伤组织遗传转化体系建立

通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,建立香樟胚性愈伤组织遗传转化体系.结果表明:以胚性愈伤组织为受体,能取得比较理想的转化效果;50 mg·L-1的潮霉素对胚性愈伤组织有很好的筛选效果;根癌农杆菌OD600为0.6时,能获得较高的转化率;侵染时间提高为40min时,对提高转化效率有显著的效果;共培养3 d能够得到较好的转化效率.对转基因香樟愈伤组织进行PER检测,结果表明GUS基因已整合到香樟胚性愈伤组织的基因组中.     

微弹介导的火炬松遗传转化

本文建立了一个微弹介导的火炬松遗传转化系统。这个系统解决了火炬松遗传转化过程中存在的许多困难。运载抗虫基因的质粒载体经微弹转化法进入火炬松成熟合子胚,然后在添加了卡那霉素的培养基上从转化的成熟胚上诱导出有器官发生潜力的愈伤组织,再从转化的愈伤组织上产生转基因植株。利用这一系统生产的转基因植株已经被随机扩增技术、Southern杂交技术和虫试验所证实,并且转化的植株已在土壤中成活。图3表2参28。     

绿竹花期生物学特性与愈伤组织诱导

为了建立绿竹高效愈伤组织诱导体系,研究了小穗的生物学特性,以及不同激素种类及浓度组合、单独添加2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)浓度、有机添加物、甘露醇预处理等对小穗愈伤组织诱导的影响。结果表明:0.8～1 cm的小穗是诱导愈伤组织的最适宜材料;2,4-D与NAA组合小穗的愈伤组织诱导率最高,愈伤组织的质量也较好;小穗愈伤组织诱导以MS基本培养基添加3 mg·L-12,4-D、1 mg·L-1NAA和500 mg·L-1Proline、500 mg·L-1Glutamine、300 mg·L-1Casein Hydrolysate较好,愈伤组织诱导率最高,质量也相对较好;甘露醇预处理小穗愈伤组织出现时间推迟,愈伤组织质量与未处理的没有显著差异。     

影响非洲菊叶柄离体培养再生的因素

以3个非洲菊品种的叶柄为材料,研究了不同激素及其浓度对非洲菊离体培养再生的影响。结果表明:3个品种的叶柄在含单一细胞分裂素6-BA的培养基上培养时都不能被诱导出愈伤组织;而在仅含生长素NAA的培养基上培养时均可被诱导出愈伤组织,并且在其愈伤组织发生部位都有不定根发生,但只有品种6267能从不定根发生部位直接分化出不定芽;当在含NAA的培养基上再附加6-BA时也可被诱导出愈伤组织,但无不定根发生。所产生的愈伤组织在分化培养基上培养时只有由品种Ⅱ叶柄在同时含有NAA和6-BA的诱导培养基上产生的愈伤组织才可以分化出不定芽。表明愈伤组织的诱导与分化、不定芽和不定根的发生与品种及培养基中的激素种类有关。     

直立冬青愈伤组织诱导及其分化研究

冬青属植物种子由于坚硬的种皮和未成熟合子胚的双重休眠,具有隔年发芽的特性,为了克服远缘杂交不亲和性,获得远缘杂交品种,打破种子休眠,缩短其育种周期,采用组织培养技术进行直立冬青种苗的快速繁殖。为了建立直立冬青愈伤组织诱导及分化体系,以直立冬青幼胚为外植体材料,采用单因素试验,通过对愈伤组织诱导培养基、不同植物生长调节剂种类及质量浓度、不同采种时间,研究影响直立冬青愈伤组织诱导和分化的条件因素。结果表明:1)基本培养基并不影响直立冬青未成熟合子胚的愈伤组织诱导,而果实的采种时间以及植物生长调节剂对直立冬青未成熟合子胚愈伤组织的诱导起着重要作用;2)当在基本诱导培养基1/4 MS+3%蔗糖+0.65%琼脂上添加生长素2,4-D 0.5～2.0 mg/L或者NAA 1.0 mg/L和2.0 mg/L时,最有利于未成熟合子胚愈伤组织的诱导,而细胞分裂素单独使用时,对未成熟合子胚愈伤组织的诱导不能起到积极作用;3)在培养基为1/4MS+3%蔗糖+0.65%琼脂+0.5 mg/L 2,4-D上时未成熟合子胚的分化率最高,达70.37%;在添加2.0 mg/L ZT的培养基上,其分化率最高,达到58.15%。     

马尾松幼苗茎段愈伤组织诱导的研究

以马尾松优良种子萌发后的幼苗的茎段为实验材料,研究了不同培养基类型、激素种类和激素质量浓度对愈伤组织诱导的影响.结果表明:改良GD培养基为诱导愈伤组织的最佳诱导培养基;改良GD+4 mg·L-12,4-D+2 mg·L-16-BA+500 mg·L-1CH+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1琼脂的组合为愈伤组织最佳增殖配方;暗堵养20 d后平均直径能达到8.5 mm.这为马尾松幼苗茎段愈伤组织分化或进行遗传转化奠定了研究基础.     

榛子嫩枝扦插生根相关氧化酶活性变化及繁殖技术

选用品种(品系)、生长素(IBA、α-NAA)、质量分数3个因素,采用L16(42×29)正交设计研究榛子嫩枝扦插繁殖技术,研究生根过程中过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和吲哚乙酸氧化酶(IAAO)的活性变化.结果表明:生长素质量分数对扦插生根率影响最大,依次为品种、生长素种类.不同质量分数水平间生根率差异极显著,IBA 0.03%质量分数处理的插穗生根率最高.不同品种间生根指数差异显著,巴赛罗娜生根指数最大.榛子嫩枝扦插生根过程可分为愈伤组织形成期、诱导期和表达期3个阶段.POD活性在愈伤组织形成期呈上升趋势,表达期下降;PPO活性在愈伤组织形成期和诱导期上升,表达期下降;IAAO活性在愈伤组织形成期上升,诱导期和表达期下降.     

针叶十大功劳愈伤组织诱导研究

针叶十大功劳Mahonia fortunei生长期长、市场需求量大、野生资源日益匮乏的现状,首次以针叶十大功劳Folium Mahoniae茎、叶为外植体诱导愈伤组织生长.实验结果表明选用B5及MS培养基,温度24±1℃,暗培养条件下均可诱导出愈伤组织,但B5培养基更适宜于针对十大功劳愈伤组织诱导.培养基中添加植物激素2,4-D0.5 mg/L、KT0.5 mg/L时,愈伤组织诱导率最大,且外植体污染率最低.相同培养条件下,选用茎为外植体较选用叶片为外植体可获得更高的愈伤组织诱导率.培养基中添加3%蔗糖有利于愈伤组织的诱导,但添加NH4NO3则可明显降低愈伤组织诱导率.研究结果对开展十大功劳的人工繁殖研究具有一定的参考价值.     

农杆菌介导慈竹4CL基因遗传转化梁山慈竹

以梁山慈竹2种类型成熟胚的愈伤组织为材料,采用农杆菌遗传介导的方法,将已构建好的具有降低木质素含量的PBI121-4CL-RNAi表达载体导入愈伤组织,探讨愈伤组织预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间和温度对遗传转化的影响。研究结果表明,淡黄色、颗粒状、疏松易碎的胚性愈伤组织是较好的遗传转化材料。以在愈伤组织培养基上预培养8天的淡黄色、颗粒状、疏松易碎的胚性愈伤组织为转化受体,在菌液浓度为OD600=0.05的EHA105中侵染20min后,在25℃、黑暗条件下共培养2天(共培养基表面加一层无菌滤纸),在含有卡那霉素为55mg.L-1的抗性筛选培养基上筛选30天,抗性愈伤组织率为90%,经PCR检测,慈竹4CL基因已导入梁山慈竹愈伤组织中。抗性愈伤组织在芽诱导培养基上诱导30天,可获得丛生芽,待丛生芽长至3～5cm后,在生根培养基上经过20～30天的诱导,可产生1～8条根,获得再生植株。经PCR检测,慈竹4CL基因已导入梁山慈竹再生植株中,获得了转基因植株,转化效率为9%。RT-PCR检测结果表明,转4CL基因的梁山慈竹愈伤组织和植株的内源4CL基因的表达受到抑制,且表达量比对照明显降低。     

中华猕猴桃愈伤组织的诱导与分化

以中华猕猴桃的叶片为外植体,对猕猴桃愈伤组织的诱导与分化进行了初步研究。结果表明,诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+0.5 mg.L-12,4-D+0.5 mg.L-1ZT培养基,2,4-D是诱导愈伤组织较适合的生长素;将在MS+1.0 mg.L-1ZT培养基上培养2周后的愈伤组织,转接到MS+1.0 mg.L-1ZT+0.2 mg.L-1IBA培养基上,其不定芽的分化能力最强;将在无生长调节物质的MS培养基上培养2周后的愈伤组织,转接到1/2 MS+0.5 mg.L-1IBA培养基上,其生根效果最好。     

植物生长调节剂对黑果枸杞愈伤组织诱导、增殖及分化的影响

为建立黑果枸杞高频再生体系及进行细胞突变体筛选、遗传转化奠定基础,以黑果枸杞叶片、茎段和腋芽为外植体,以MS为基本培养基,附加不同浓度的植物生长调节剂进行愈伤组织的诱导、增殖及不定芽分化研究。结果表明:诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+2,4-D 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L;在愈伤组织的继代培养过程中,高浓度的2,4-D有利于愈伤组织的诱导,但对愈伤组织的生长有一定的抑制作用,最佳培养基为MS+2,4-D 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L;在愈伤组织的再分化过程中,6-BA对再生芽的分化效果最好,出芽率高,且多诱导出丛芽,最佳培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.10mg/L。试验表明:黑果枸杞叶片、茎段和腋芽均可诱导愈伤组织,茎段诱导率最高;筛选出了茎段愈伤组织诱导、增殖及再生芽分化的适宜培养基,为其细胞工程育种及规模化生产提供支撑。