陆地棉钾转运体基因GhHAK5启动子的克隆与功能分析

KUP/HAK/KT钾转运体基因的转录调控是植物响应低钾胁迫的一项重要机制。克隆和分析棉花钾转运体基因的启动子,不仅有助于了解其表达模式及调控机制,对于改良棉花的钾吸收特性也具有重要意义。陆地棉钾转运体基因GhHAK5是一个在根中特异性高表达的基因,其表达受低钾胁迫诱导,目前关于该基因启动子的功能还不清楚。本研究以陆地棉品种百棉1号为材料,通过PCR方法对GhHAK5上游2000bp启动子片段(pGhHAK5)进行克隆,并通过转化拟南芥、GUS组织定位和低钾诱导表达特性分析来研究其功能。结果表明, pGhHAK5除具有TATA-box和CAAT-box等基本顺式作用元件外,还含有多个响应于光、逆境胁迫、植物激素和生物钟等的顺式作用元件。pGhHAK5与雷蒙德氏棉pGrHAK5在重要调控元件的数量和位置分布上具有较高的一致性,均具有5个参与根特异性表达调控的元件(ATAAAAT)和1个参与低钾条件下转录调控的ARF转录因子结合位点(TGTCNN)。GUS组织化学染色结果显示,转基因拟南芥幼苗的叶脉和胚轴维管束组织染色较深,根系染色较浅;成熟期转基因拟南芥植株的根、叶脉和花萼维管束组织染色...     

陆地棉MADS-box基因GhMADS13的功能分析

为了研究GhMADS13的功能,利用NCBI上提交的序列设计引物进行PCR扩增,扩增序列与提交序列的ORF (Open reading frame)的一致性为100％.qRT-PCR结果表明:棉花的各个组织中,GhMADS13在花中的表达量最高,是表达量低的根的几百倍;花器官中GhMADS13在萼片、花瓣、雄蕊、心皮和胚珠中都有表达,表达量虽有差异,但差异不大,其在胚珠中的表达量最高.将GhMADS13插入到pBI121载体上,构建了植物超表达载体.通过浸花法转化拟南芥,获得了2个转基因株系,分子检测和表型数据统计的结果表明GhMADS13的转录水平越高植株越矮小,角果的长度越短,种子的数目越少.根据GhMA DS13的qRT-PCR结果和异位表达分析,推测GhMADS13主要抑制胚珠的发育.     

陆地棉耐盐相关基因GhERF79的克隆与分析

利用RACE-PCR技术克隆陆地棉ERF基因的全长cDNA,命名为GhERF79,该cDNA长度为980 bp,含有一个完整的ORF(Open reading frame)为756 bp,编码251个氨基酸的多肽;亚细胞定位显示该基因表达产物定位于细胞核中,生物信息学分析表明GhERF79属于ERF转录因子家族内的A-1亚族。Real-time PCR分析结果表明,GhERF79的表达受盐胁迫和植物激素诱导,该基因在耐盐材料中9806中的诱导表达水平显著高于盐敏感材料中棉所12;外源激素ABA(Abscisic acid)、ET(Ethylene)、MeJA(Methyl jasmonate)可以显著诱导GhERF79的表达,推测其可能在棉花响应盐胁迫途径中发挥重要功能。     

陆地棉纤维发育相关基因GhEXPs的分析及表达研究

【目的】扩展蛋白是1种细胞壁蛋白,能够松弛细胞壁从而促进细胞伸长。本研究旨在挖掘棉花纤维发育过程中特异的扩展蛋白基因。【方法】利用转录组测序和定量PCR(Polymerase chain reaction)研究棉花扩展蛋白基因的表达模式,并运用生物信息学的方法分析扩展蛋白进化关系、预测三维结构和关键氨基酸位点。【结果】以陆地棉cDNA(Complementary DNA,互补DNA)为模板,克隆得到4个棉花扩展蛋白基因GhEXPA1d、GhEXPA4b、GhEXPA23b和Gh EXPB3a,开放阅读框长度分别为768 bp、795 bp、798 bp和804 bp。进化树分析表明,GhEXPA1d、GhEXPA4b、GhEXPA23b属于EXPA (α-expansin)亚家族,GhEXPB3a属于EXPB(β-expansin)亚家族。组织特异性表达分析表明它们是纤维发育特异基因;定量PCR验证了这4个Gh EXPs都是在纤维发育的起始期和伸长期表达量较高。根据序列比对以及三维结构模型预测了4个棉花扩展蛋白的关键氨基酸位点,分别是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸,均为芳香族氨基酸,在三维结构模型中处于同一个平面上。【结论】获得的4个棉花扩展蛋白基因在棉花纤维发育起始期和伸长期特异表达,为进一步阐明GhEXPs对棉花纤维发育的分子机制提供了参考。     

陆地棉耐盐相关基因GhSAMS的克隆及表达

为了挖掘棉花耐盐相关基因,我们根据陆地棉耐盐性抑制消减文库中的一个S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的同源EST设计引物,利用RACE结合RT-PCR技术克隆陆地棉S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的cDNA全长,命名为GhSAMS。该cDNA全长1 576 bp,ORF为1 182 bp,编码393个氨基酸的多肽。生物信息学分析表明GhSAMS蛋白与拟南芥、盐地碱蓬、水稻中该蛋白的相似性分别为91%、93%和93%。系统发育树结果显示GhSAMS与盐地碱蓬中该蛋白的亲缘关系最近。Real-time PCR分析结果表明,GhSAMS的表达受盐胁迫诱导,在盐敏感材料中诱导被推迟,而且,该基因表达水平在耐盐材料中9835中明显高于在盐敏感材料中S9612中。我们构建了原核表达载体pET28-GhSAMS,经IPTG诱导,实现了GhSAMS在大肠杆菌中的表达,为进一步开展GhSAMS的遗传转化工作奠定了有益基础。     

陆地棉耐盐相关基因(GhVP)的克隆及分析

液泡膜质子转运无机焦磷酸酶(V-PPase)酸化植物液泡并为液泡的次级转运系统提供能量。本研究根据棉花耐盐抑制消减(SSH)文库中的一个EST序列设计特异性引物,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术首次克隆了陆地棉焦磷酸酶基因,将其命名为GhVP。生物信息学分析显示,该基因包含一个2301 bp的完整开放读码框,编码766个氨基酸的多肽,与拟南芥和烟草的同源性分别达90%和93%。RT-PCR结果显示,GhVP的表达丰度随着盐处理时期的增加而变化,盐处理6 h表达量最高,随后开始下降,这一结果与Thellungiellahalophila中的研究相似,该研究将有助于了解非盐生植物的耐盐特性。     

陆地棉GhDAHP基因的克隆与表达分析

棉花黄萎病是制约棉花产业健康发展的一种重要病害,在生产上未发现有效的根治办法,使用现代基因工程技术,从基因库中挖掘抗黄萎病相关基因,为棉花抗黄萎病育种工作的提供理论基础。本研究根据在GenBank中检索到抗黄萎病基因SDAHP(GU479467,1,3-脱氧-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶),从陆地棉基因组数据库中检索到3个同源基因(NM_016893351.1,XM_016849738.1和XM_0168151150.1),根据3个同源基因核苷酸序列设计引物,以陆地棉cDNA为模板进行克隆,获得3个目的基因,依次命名为GhDAHP-1、GhDAHP-2和GhDAHP-3。利用ProtParam和Prot Scale等在线软件对目的基因进行生物信息学分析;RT-PCR分析黄萎病菌诱导后目的基因在陆地棉叶片中的表达量。结果表明:GhDAHP-1序列全长1983 bp,氨基酸总数为539,分子质量约59.45378 kD,理论等电点pI为8.7;GhDAHP-2序列全长1832 bp,氨基酸总数516,分子质量约57.02998 kD,理论等电点pI为7.68;GhDAHP-3序列全长1652 bp,氨基酸总数517,分子质量约56.95491 kD,理论等电点pI为8.52。系统进化树分析,GhDAHP与雷蒙德氏棉(Gossypium raimindii)、木本棉(Gossypium arboreum)的亲缘关系最近。棉花叶片在黄萎病菌的处理下,GhDAHP基因表达量呈现先升高后降低的趋势,推测受到黄萎病诱导后,GhDAHP基因可能参与了黄萎病菌侵染的防卫过程。     

陆地棉干旱胁迫基因GhRBCO的克隆与表达分析

Rubisco蛋白(ritmlose-1,5-bisphosphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco)的上调表达是植物应对非生物胁迫的特征之一.本研究在前期蛋白质组学分析的结果上,利用同源克隆获得陆地棉'KK1543'在干旱胁迫下差异表达的基因GhRBCO.GhRBCO基因编码区长...     

棉纤维发育相关基因GhCHS、GhCPI的克隆与鉴定

  以陆地棉李氏超短纤维突变体Li₁li₁自交后代野生型li₁li₁和超短纤维突变体Li₁li₁开花后4 d的胚珠纤维的复合体的RNA为探针,通过基因芯片的方法筛选优质材料7235棉纤维伸长、次生壁加厚不同发育时期混合cDNA文库,分离出两个在两种材料中差异表达的cDNA序列,分别命名为GhCHS（GenBank登录号：EF643506）和GhCPI（GenBank登录号：EF643507）。RT-PCR分析表明：开花后4 d,GhCHS,GhCPI在陆地棉李氏野生型li₁li₁纤维中的表达量低于超短纤维突变体Li₁li₁。Southern杂交结果表明两个基因在陆地棉基因组中都存在两个拷贝     

陆地棉三个WRKY基因的克隆及表达分析

WRKY转录因子可调控下游抗逆基因的表达,进而在植物生长发育以及对外界环境的反应中起着重要的调控作用,目前对棉花WRKY家族基因的研究比较少。本研究利用电子克隆的方法,从陆地棉品种山农圣杂3号中克隆得到了3个具有完整开放阅读框的棉花WRKY基因,聚类分析表明它们同属于WRKY家族中的第Ⅱ类。利用RT-PCR结果表明:250mmol/LNaCl盐胁迫和20%PEG6000干旱胁迫下同时诱导GhWRKY4的基因表达,GhWRKY5仅受干旱胁迫下的诱导,而GhWRKY6对这两种逆境胁迫都没有变化。     

陆地棉NF-YA基因家族的全基因组鉴定与功能分析

【目的】通过对陆地棉NF-YA基因家族进行全基因组鉴定,分析其表达特性,鉴定其中与棉花开花相关的基因。【方法】利用生物信息学方法系统分析了其理化性质、基因结构、共线性、Ka/Ks、顺式作用元件和表达模式,实时荧光定量聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)分析表达特征,采用病毒诱导基因沉默技术验证基因功能。【结果】陆地棉中鉴定到29个NF-YA基因家族成员,分为5个亚组,定位在18条染色体上;全基因组复制和片段复制是GhNF-YA基因家族扩张的主要动力;启动子区含有大量光反应的顺式作用元件。GhNF-YA基因家族基因在茎、叶中高表达;12个GhNF-YA基因在早熟品种鲁棉研19号和晚熟品种鲁棉研37号中均在第三至六叶时期表达量较高,并且大部分基因在品种间表达差异显著。沉默GhNF-YA18基因的鲁棉研37号植株比对照提前11 d现蕾,并且该基因在白化期和现蕾期的表达量均低于未沉默对照棉株。【结论】本研究对陆地棉NF-YA基因家族进行了鉴定和表达分析,为进一步研究棉花开花调控的分子机制奠定了基础。     

陆地棉Dirigent-like基因(GhDIR)的克隆与分析

Dirigent-like基因(DIR)编码蛋白质参与木质素的形成,与植物体的病菌防御有关.本研究以抑制差减杂交( SSH)技术获得DIR的EST为信息探针,对棉花EST数据库进行同源搜索和序列拼接,获得了全长为768 bp的DIR基因cDNA全长,将该基因命名为GhDIR.该基因序列的开放阅读框(ORF)位于70 ～...     

陆地棉GhERF8基因的克隆与表达分析

 乙烯响应元件结合因子（Ethylene-responsive element-binding factor,ERF）是植物中最大的转录因子家族之一。本研究以棉花叶片cDNA文库为基础,从陆地棉中棉所10号中克隆得到一个新的ERF基因,命名为GhERF8（GenBank：JN656957）。该基因编码265个氨基酸,蛋白序列中包含一个AP2保守结构域。采用荧光定量PCR（RT-PCR）的方法,对GhERF8基因在棉株不同生育时期叶片和不同组织中的表达水平进行了定量分析。结果表明,GhERF8基因在各组织中均有表达,但在成熟后期的叶片中表达量最高。GhERF8表达量与叶片衰老过程中叶绿素含量出现相反的变化趋势,推测GhERF8可能与叶片衰老有一定关系。在乙烯利和茉莉酸处理下GhERF8基因在叶片中上调表达,而在脱落酸处理下GhERF8表达量无显著变化,推测GhERF8可能处于乙烯和茉莉酸信号转导网络中,且表达途径为非ABA依赖途径。     

陆地棉转录因子GhNAC78基因的特征及功能分析

本实验室从陆地棉中克隆得到GhNAC78,分析了其基因特征及功能。该基因cDNA全长为937 bp,开放阅读框为876bp,编码291个氨基酸,隶属于NAM转录因子亚家族。体外转录激活实验表明,GhNAC78具有转录激活活性。上游启动子区1537 bp序列的生物信息学分析可知其包含多种激素、胁迫和光响应元件,表明GhNAC78广泛地参与植物生长发育和胁迫响应的调控。荧光定量结果显示,GhNAC78在棉花叶片衰老过程中高调表达,推测其参与叶片衰老的调控。     

棉花芽黄突变体十个叶绿体蛋白编码基因 RNA 编辑位点的测定及分析

RNA编辑是陆生植物叶绿体转录后基因表达调控的一种方式.已有研究表明植物黄化或白化可能与叶绿体RNA编辑有关.本实验采用PCR,RT-PCR及测序的方法,确定棉花芽黄突变体V1子叶与真叶的10个叶绿体蛋白编码基因中各有34个编辑位点,有6个位点存在编辑效率的差异.将这些编辑位点与柯字310比较发现,芽黄突变体多5个编辑...     

陆地棉GAI基因原核表达与多克隆抗体制备

 DELLA蛋白是GA信号响应的关键负调节因子,本文采用基于EST的电子克隆方法,从棉花中克隆了DELLA蛋白家族的一个成员GhGAI。根据电子克隆序列,从陆地棉花胚珠cDNA中扩增得到GhGAI全长基因片段。将其在原核中表达,得到了分子量（Mr）为62000的蛋白质条带。表达蛋白经His-Tag亲和层析纯化后,对兔子进行免疫,制备的抗血清通过间接ELISA检测,具有较高的效价和特异性。     

陆地棉GhBZR1基因的克隆及功能研究

[目的]BZR1是油菜素内酯(Brassinosteroid,BR)信号通路中关键的转录因子,去磷酸化后可直接调控BR信号通路下游基因的表达,影响植物的生长发育和免疫反应.明确其功能对了解棉花的抗/感病分子机制具有重要意义.[方法]分析未接种和接种黄萎病菌(大丽轮枝菌,Verticilium dahliae)的中植棉K...     

3个陆地棉球蛋白基因启动子的克隆与功能初步分析

为克隆陆地棉来源的种子特异性启动子,根据雷蒙德氏棉测序结果,设计针对GhαGLOA、GhβGLOA和GhβGLOB基因编码区上游约1.5 kb序列的引物,分别以陆地棉总DNA为模板克隆了3条序列。构建了含有编码区上游序列驱动GUS的表达载体,经农杆菌介导转化野生型拟南芥。转基因拟南芥种子的GUS活性荧光检测结果表明,所克隆序列具有启动子功能,其中GhαGLOA启动子的转录活性极显著高于其他2个启动子。在转基因拟南芥成体植株的多个器官中,仅可检出痕量的GUS活性,认为所克隆启动子为种子特异性启动子。     

陆地棉色素腺体密度与丰产早熟性的相关及后代的遗传变异

本研究利用两个有色素腺体品种与两个无色素腺体品种,配成4个杂交组合,每组合包括P_1、P_2、F_1、F_2。在对4个组合各性状进行了世代间的方差分析后,着重研究F_24个部位及4个部位平均的色素腺体密度与19个产量因素及早熟性性状之间的相关性。结果表明,色素腺体密度与各产量及早熟性性状之间均无密切相关。在进行育种工作时,色素腺体密度可不做为必须着重考虑的因素。对遗传参数的估算结果表明,衣分的遗传力较高,单株铃数、单铃重为低到中等,单株籽棉产量和皮棉产量遗传力最低。遗传进度由高到低的变化趋势为:单株籽棉产量、单株皮棉产量>单株铃数>单铃重、衣分。