乙型脑炎病毒SXBJ07株E基因的克隆及原核表达

为构建乙型脑炎病毒(JEV)SXBJ07株E基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达;根据JEV SXBJ07株基因组全序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增E基因全长;将目的基因插入pGEM-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET32α中,再转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后对其产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:扩增到了全长为1 500 bp的JEV SXBJ株E蛋白基因;重组质粒pET-32α-E构建成功;融合蛋白可以与乙脑阳性血清抗体特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白。     

乙型脑炎病毒结构蛋白基因的克隆表达与免疫特性分析

研究分别克隆了乙型脑炎病毒SA14-14-2株的结构蛋白C、PrM/M及E蛋白基因.将3个结构蛋白基因分别插入表达质粒pET30(a)中,成功构建3个原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后利用IPGT诱导,SDS-PAGE分析结果表明,3个结构蛋白获得了表达,表达产物大小与预期一致.Western-blot分析结果表明:表达产物中PrM/M和E蛋白具有很好的免疫反应性,可被抗乙型脑炎病毒血清很好地识别;而C蛋白的免疫反应性较差,不能很好地被乙型脑炎病毒阳性血清识别.该结果提示,乙型脑炎病毒结构蛋白中除E蛋白外PrM/M蛋白也很可能具有诊断抗原的应用潜能.     

犬瘟热病毒截短P蛋白的表达及纯化

为获得犬瘟热病毒(CDV)野毒株截短磷蛋白(aa232～507),以Asia 1型CDV-PS为基础,经PCR扩增得到P(aa232～507)基因,插入原核表达载体pEASY~R-Blunt E1中,构建重组原核表达载体pEASY~R-Blunt E1-CDV-P;将重组质粒转化到BL21感受态细胞中进行原核表达并对诱导条件进行优化;超声破碎最佳条件下的诱导产物经离心后对重组蛋白进行可溶性分析,随后用镍柱对重组截短P蛋白进行纯化并用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果显示:重组P蛋白大小约37 kDa,在IPTG终浓度0.1 mmol/L,诱导时间为8 h时,表达量最高;重组P蛋白以包涵体形式存在,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,成功纯化出重组截短P蛋白;重组P蛋白具有良好的免疫反应性。本研究成功制备出CDV-PS截短P蛋白,为进一步P蛋白抗原表位的研究和CDV抗体诊断方法的研发奠定基础。     

乙型脑炎病毒EⅢ基因片段的表达与EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒的研制

为了研制乙型脑炎病毒EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒,将乙型脑炎病毒EⅢ基因克隆至原核表达载体p ET-32a(+),重组质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达。以纯化后的重组蛋白EⅢ包被酶标板,优化ELISA反应条件,组装试剂盒。SDS-PAGE和Western bloting分析表明,重组蛋白分子质量约为30ku,经IPTG诱导后高效表达,且具有来良好的免疫原性。优化试验确定重组抗原最佳包被浓度为4.7μg/m L,血清样本的阳性临界值为0.255。特异性试验结果表明,重组蛋白与猪瘟、猪伪狂犬、猪圆环病等多种病原体的阳性血清无交叉反应。敏感性试验结果表明,血清稀释至1∶6400时仍检测为阳性。该试剂盒的批内、批间变异系数均小于10%。用该试剂盒检测224份临床猪血清样本,并与商品化ELISA试剂盒检测结果比较,两者的符合率为90.7%。研究结果表明,原核表达的猪流行性乙型脑炎病毒EⅢ蛋白具有良好的免疫原性,研制的猪流行性乙型脑炎病毒EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒敏感性、特异性和重复性较好,为猪流行性乙型脑炎的抗体水平检测、流行病学调查、类症鉴别等方面提供了重要方法。     

日本脑炎病毒SA14-14-2株E基因的克隆及原核表达

根据GenBank公布的日本脑炎(Japanese encephalitis virus,JEV)SA14-14-2减毒株E基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增其E基因全长cDNA,将扩增产物克隆入pUCm-T载体中,测序后亚克隆到原核表达载体pET-32a( ),筛选重组质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3)宿主菌.经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表达产物.结果获得了含全长日本脑炎病毒E基因的重组质粒,经测序证实,与GenBank上E基因序列的同源性达到100%.所表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,为制备JEV实验室诊断抗原打下了基础.     

蜱传脑炎病毒E蛋白D Ⅲ的表达与抗体间接ELISA检测方法的建立

利用PCR技术扩增蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus, TBEV)E蛋白第三结构域(DomainⅢ,DⅢ)基因并将其插入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-TBEV-E-DⅢ。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导目的蛋白表达,利用镍离子金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)纯化目的蛋白。将纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立TBEV抗体间接ELISA检测方法。结果显示,重组蛋白TBEV E-DⅢ在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,蛋白表达的最佳条件为30℃、0.6 mmol/L IPTG诱导6 h; TBEV抗体间接ELISA检测方法的最佳抗原包被浓度为1 mg/L,该方法可特异性检测TBEV阳性血清,与寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)、日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)和西尼罗病毒(West Nile virus, WNV)阳性血清无交叉反应,批内和批间变异系数(CV)均小于10%。结果表明,成功表达并纯化了TBEV E-DⅢ重组...     

乙型脑炎病毒贵州分离株E基因原核表达及其免疫原性的研究

收集某猪场1例发病种公猪的睾丸病料,处理后采用细胞培养与乳鼠脑内接毒相结合的方法盲传并结合RT-PCR方法分离鉴定,命名为乙型脑炎病毒(JEV)贵州分离株(GZ株),然后根据GenBank登录的日本乙型脑炎病毒SA14和SA14-14-2株全基因序列设计并合成1对扩增E基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增出JEV贵州分离株E基因,并将E基因克隆到pMD19-T载体上,构建重组质粒pMD19-T-E,经双酶切鉴定、测序及序列分析鉴定后,再将E基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建乙脑病毒E基因原核表达质粒pET-32a-E,将构建好的原核表达质粒pET-32a-E转化至宿主菌BL21(DH3)中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot分析,得到了约59ku条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化和浓缩目的蛋白,并将其加入弗氏佐剂后免疫小鼠,免疫后采血检测抗体。结果显示:乙型脑炎病毒贵州分离株E基因原核表达目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平,该研究为乙型脑炎亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

鸭病毒性肠炎gB基因的原核表达及产物的抗原性分析

利用DNAStar分析并筛选出鸭病毒性肠炎病毒gB基因的两段主要抗原区域,PCR扩增出这两段主要抗原区域并克隆进入载体pMD18-TVector,目的基因经PCR和酶切鉴定后连接至原核表达载体pET-32a(+)。获得的重组质粒分别转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白在IPTG诱导下以包涵体的形式高效表达,Western-bloting及免疫鼠血清ELISA抗体检测结果表明重组蛋白具有良好的免疫原性。     

日本脑炎病毒囊膜蛋白的基因原核表达及抗原性分析

参照GenBank中的日本脑炎病毒序列设计一对特异性引物,采用RT-PCR法扩增E基因得到cDNA,克隆至pMD-18T载体,经测序证实后亚克隆至原核表达载体pET-28a中,转化入BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明,成功构建了重组质粒pET-28a/JEV E,目的蛋白主要以包涵体形式表达。Western blot检测表明,表达产物与兔抗JEV多克隆抗体呈阳性反应,在ELISA试验中,用表达出的E蛋白包被,能够很明显地区分出猪日本脑炎阴性、阳性血清。     

犬贾第鞭毛虫α-12贾第素基因的原核表达及纯化

为了原核表达、纯化犬贾第鞭毛虫α-12贾第素蛋白,试验经RT-PCR获得α-12贾第素基因片段,克隆至原核表达载体p ET-28a(+),构建重组原核表达质粒p ET-28a-α-12,再转化入E.coli Rosetta(DE3)后,用IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经SDS-PAGE和Western-blot分析验证,并用Ni琼脂糖凝胶纯化融合的α-12贾第素蛋白。结果表明:重组原核表达质粒p ET-28a-α-12经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为40 ku,且主要以包涵体形式存在;表达量约占菌体总蛋白的15.7%;纯化的重组蛋白纯度达90%以上。     

携带BCoV抗原表位的乙型肝炎病毒核心抗原病毒样颗粒的制备及免疫效果评价

为了制备可用于牛冠状病毒(BCoV)亚单位疫苗的含BCoV S蛋白抗原表位的病毒样颗粒(VLP)，本研究将BCoV S1和S2蛋白中含B细胞表位的aa351～aa403 (159 bp)和aa771～aa784 (42 bp)对应的密码子按大肠杆菌偏好性原则优化后插入乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)主要免疫显性区域(MIR)，合成该重组基因后克隆至pET-32a(+)，经酶切鉴定显示正确构建了重组质粒pET-32a(+)-HBcAg-BCoV S1+S2。将该重组质粒分别转化E.coli BL21(DE3)和伴侣感受态细胞BL21(DE3)(含pG-KJE8分子伴侣质粒)，经诱导表达后采用镍柱亲和层析法纯化两种不同表达形式的重组蛋白，SDS-PAGE检测重组蛋白的表达及纯化效果，结果显示两种表达系统均正确表达了重组蛋白，分别命名为VLP-A、VLP-B，前者为包涵体表达，后者为可溶性表达。纯化后浓度分别为0.9 mg/mL、1.4 mg/m L。利用透射电镜观察纯化后的两种重组蛋白是否形成VLP，结果显示二者均形成VLP，且可溶性表达的重组蛋白形成的VLP产量略高。将两种VLP乳化后...     

乙型脑炎病毒E蛋白抗原优势区域的鉴定

流行性乙型脑炎（Japanese Encephalitis,JE）是一种人与动物共患的虫媒病毒性疾病,严重危害着人畜的健康。E蛋白是乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）的主要结构蛋白,在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。为了确定该蛋白的抗原优势区域,本研究设计了3对引物,将E蛋白分成3个大段,分别是EF1（1～291aa）、EF2（292～402aa）和EF3（403-500aa）,又将EF1分成4个相互重叠的小片段,分别是EF1-1（1～88aa）、EF1—2（68～155aa）、EF1—3（129～222aa）和EF1—4（202～291aa）,将以上基因片段分别克隆到原核表达载体进行GST融合表达。SDS-PAGE电泳鉴定各融合蛋白均获得表达,各表达产物以包涵体的形式存在。通过Western blot分析表明融合蛋白GST-EF1、GST—EF2、GST—EF1—1、GST-EF1-2、GST—EF1—3和GST—EF1～4均能被阳性血清识别。通过ELISA鉴定,GST-EF2反应性最强,GST-EF1反应性比GST-EF2稍弱,而GST-EF3反应性最弱,GST-EF1-1、GST-EF1—2、GST-EF1—3和GST—EF1—4片段融合蛋白反应性与GST—EF1相似。由此本研究鉴定出1-402aa是E蛋白的抗原优势区域,在此区域内包括了12个Cys的保守区及域Ⅰ、域Ⅱ和域Ⅲ3个主要抗原域。E蛋白抗原优势区域的鉴定,为E蛋白抗原表位的鉴定以及针对于E蛋白诊断试剂的开发奠定了基础。     

猪瘟病毒蛋白E2、N^pro基因的克隆表达及纯化

克隆了猪瘟病毒（CSFV）石门株E2和Npro基因,并分别插入pGEX-6p-1表达载体中,构建了原核重组表达质粒。经IPTG诱导后,应用SDS-PAGE电泳检测结果表明,重组质粒均得以成功表达。使用超声法破碎菌体获得蛋白,将带有GST标签的融合蛋白进行亲和层析,其中E2和Npro的表达形式分别为包涵体表达和可溶性蛋白表达。将E2变性后重折叠,应用亲和层析法纯化蛋白,Western blot检测发现CSFV蛋白E2能够被CSFV阳性血清识别,具有良好的反应原性,而Npro不能与CSFV阳性血清反应。     

猪瘟病毒蛋白E2、Npro基因的克隆表达及纯化

克隆了猪瘟病毒(CSFV)石门株E2和Npro基因,并分别插入pGEX-6p-1表达载体中,构建了原核重组表达质粒。经IPTG诱导后,应用SDS-PAGE电泳检测结果表明,重组质粒均得以成功表达。使用超声法破碎菌体获得蛋白,将带有GST标签的融合蛋白进行亲和层析,其中E2和Npro的表达形式分别为包涵体表达和可溶性蛋白表达。将E2变性后重折叠,应用亲和层析法纯化蛋白,Western blot检测发现CSFV蛋白E2能够被CSFV阳性血清识别,具有良好的反应原性,而Npro不能与CSFV阳性血清反应。     

马乙型脑炎病毒NS1基因的原核表达及抗原性鉴定

为了研究马乙型脑炎病毒NS1蛋白的特性,试验采用RT-PCR方法获得SA14-14-2弱毒株的NS1基因,将该基因克隆于pMD18-T载体后进行测序,进而构建重组表达质粒pET28a-NS1,并转化于Rosetta(DE3)中,再进行IPTG诱导和SDS-PAGE分析。结果表明:获得分子质量约为46 ku的重组蛋白,经Western-blot和间接ELISA检测证明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。     

流行性乙型脑炎多克隆抗体的制备及其囊膜E蛋白ELISA方法的建立

为了建立流行性乙型脑炎病毒(JEV)的检测方法,试验用纯化的乙型脑炎病毒免疫健康新西兰白兔制备多克隆抗体,并对多克隆抗体进行纯化和效价测定;以纯化原核表达的乙型脑炎重组结构蛋白(E蛋白)为包被抗原,通过对检测方法相关条件的优化,建立了检测乙型脑炎病毒抗体的间接ELISA方法。结果表明:该抗原不与猪其他疾病的阳性血清反应,具有良好的特异性;在批内重复试验中,变异系数小于10%。     

猪日本脑炎病毒NS3蛋白的基因克隆、原核表达及纯化

提取猪日本脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增JEV的NS3基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,酶切鉴定和PCR鉴定重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3,转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组His-JEV-NS3蛋白,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达,his-band试剂盒纯化重组蛋白。获得了1.8kb NS3基因片段,成功构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3。IPTG诱导获得分子质量为64ku的His-JEV-NS3蛋白,该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的30%以上,纯化后获得高纯度重组蛋白,其占总蛋白比例达70%以上。     

猪乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ原核表达和抗原性分析

为分析猪乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白Ⅲ结构域的抗原性,本研究克隆了JEV疫苗株SA14-14-2的E蛋白结构域Ⅲ,并通过pET-28a载体进行融合表达和纯化。用纯化后蛋白作为免疫原,免疫8周龄BALB/c小鼠,通过SDS-PAGE、Western blotting、间接ELISA及间接免疫荧光方法(IFA)检测小鼠及猪抗体滴度,验证E蛋白结构域Ⅲ的抗原性。SDS-PAGE结果表明融合蛋白以包涵体形式表达;Western blotting、间接ELISA检测结果表明表达产物具有良好的抗原性;纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠ELISA方法检测特异性抗体滴度可达1×10⁵;猪JEV阳性血清ELISA抗体滴度可达5.1×10⁴;IFA结果表明JEV E Ⅲ蛋白产生的抗血清能很好的识别乙型脑炎病毒抗原。以上结果表明,表达、纯化的重组JEV E Ⅲ蛋白具有良好的抗原性。本试验结果为建立以E蛋白结构域为抗原的诊断方法提供了重要依据。     

日本乙型脑炎病毒保护性抗原基因表达的研究

日本乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒引起的严重的人畜共患性传染病,日本乙型脑炎病毒的结构蛋白包括C、Pr M和E 3种。其中C蛋白主要参与病毒RNA和蛋白之间的相互作用,且具有核定位信号序列,在乙脑病毒中,缺失此序列后C蛋白只在感染细胞的细胞质中出现;PrM和E基因是其主要免疫保护性抗原基因,表达的蛋白是乙型脑炎病毒的主要结构蛋白,是病毒颗粒的主要成分,也是维持病毒粒子形态结构的主要物质,主要参与病毒感染的后期阶段,可诱导产生保护性免疫。近年来许多学者对日本乙型脑炎病毒保护性抗原基因原核表达和真核表达及其相关免疫原性进行了大量的研究,取得了一定的研究进展,文章主要针对日本乙型脑炎病毒保护性抗原基因表达的研究进展进行了综述,为乙型脑炎基因工程疫苗的进一步研究提供参考。     

H9N2亚型猪流感病毒血凝素重组蛋白在LAT诊断方法中的应用

利用原核表达的H9亚型猪流感病毒血凝素蛋白做为抗原,建立了检测H9亚型猪流感病毒抗体的乳胶凝集试验方法。阳性重组质粒pGEX-HA转化大肠杆菌BL21获得了原核表达,表达的血凝素蛋白位于包涵体中,包涵体经变性、复性处理,利用复性产物作为抗原,经碳二亚胺(EDAC)将表达产物和羧基化的乳胶共价偶联,建立了该LAT检测方法。结果表明应用HA重组蛋白作为诊断抗原建立的检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可用于H9亚型猪流感抗体水平监测、流行病学调查和现地疫病普查。