猪NAP1L5基因克隆、序列鉴定及在不同妊娠时期胎盘中的差异表达分析

旨在获得猪NAP1L5基因的序列特征、组织表达及生物学功能等相关信息.本试验通过RT-PCR克隆了猪NAP1L5基因,并运用生物信息学方法分析了不同物种序列进化关系,运用荧光定量PCR技术检测了NAP1L5在梅山猪不同妊娠时期胎盘中的表达.序列分析结果表明,猪NAP1 L5基因CDS全长579 bp,编码193个氨基酸.其核苷酸序列与牛的相似性为89％,其中氨基酸序列包含一段保守的核小体组装蛋白(Nucleosome assembly protein,NAP)特征序列.荧光定量结果表明NAP1L5基因随着妊娠时期的增长呈上升表达,在26和50 d之间表达量差异极显著(P＜0.01).以上结果支持了NAP1L5基因可能与猪胎儿营养获取及早期发育有关,为进一步研究猪NAP1 L5基因的功能奠定了基础.     

荣昌猪胸腺素β15A(TMSB15A)cDNA全长克隆、序列信息及组织表达分析

旨在克隆荣昌猪TMSB15A基因全长,检测该基因在荣昌猪各组织中的表达特征,并对其基因的结构与功能进行分析。本研究利用RCAE(Rapid-amplification of cDNA ends)-PCR以及RT-PCR(Real-time quantitative PCR)技术克隆荣昌猪TMSB15A基因mRNA全长序列以及检测该基因在荣昌猪各组织中的表达特征。结果表明,荣昌猪TMSB15A基因全长654bp,其中CDS区长138bp,编码45个氨基酸,5′UTR和3′UTR分别长86和430bp。生物信息学分析表明,TMSB15A蛋白的理论分子量为5.2ku,有10个带负电的氨基酸,9个带正电的氨基酸,蛋白理论等电点为5.3;预测TMSB15A蛋白无疏水区、信号肽结构、跨膜结构域,其主要在细胞质中发挥生理功能;TMSB15A蛋白的三级结构由α-螺旋和无规则卷曲构成。TMSB15A基因编码的氨基酸序列与人、长臂猿以及黑猩猩的同源性最高,为97.8%,其次是骆驼和兔,为93.3%,与马的同源性最低,为11.1%。TMSB15A在荣昌猪免疫相关组织脾和胸腺中表达量最高(P0.01),在淋巴结和肺中呈中等丰度表达,在心、肝、肾和肌肉中表达量较低。本试验为研究TMSB15A基因的功能奠定了基础,也为荣昌猪抗病育种研究提供了理论支撑。     

梅山猪UBE2b基因的克隆及组织表达特征的研究

UBE2b基因编码的泛素结合酶参与的泛素-蛋白酶通路(UPP)在哺乳动物精子发生中起着重要作用。本研究根据相关ESTs拼接的序列采用PCR扩增鉴定的方法获得梅山猪UBE2b基因cDNA全序列,对其序列进行生物信息学分析,利用半定量RT-PCR的方法研究150日龄梅山公猪UBE2b基因的组织表达特征和不同日龄(2、30、60、90、150日龄)公猪睾丸的表达规律。结果表明:梅山猪UBE2b基因cDNA全长1 329 bp,编码153个氨基酸,具有UBCc家族的保守结构域。该基因编码氨基酸序列在不同物种间具有较高的保守性,根据编码氨基酸序列构建的分子进化树显示猪与牛的亲缘关系最近,与斑马鱼的关系最远。UBE2b基因在梅山公猪各组织中广泛表达,其中睾丸为高丰度表达。该基因在梅山猪睾丸中的表达随日龄增加呈显著上升趋势,与睾丸发育显著相关(r=0.82,P<0.01),推测UBE2b可能在梅山猪精子发育和性发育中起重要作用。     

版纳微型猪近交系VEGF基因克隆及其组织中转录水平的检测

为克隆版纳微型猪近交系血管内皮生长因子(VEGF)基因并检测该基因在各组织中的转录水平,本研究提取版纳微型猪近交系18种组织RNA,利用RT-PCR方法扩增VEGF基因编码区全长序列,进行克隆测序。利用VEGF基因序列的推导氨基酸序列与牛等8个物种的VEGF氨基酸序列构建物种系统进化树,同时采用半定量RT-PCR方法分析VEGF基因在版纳微型猪近交系18种组织中的转录水平。结果显示,版纳微型猪近交系VEGF基因编码区全长573 bp,编码190个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,与牛等8个物种具有90%以上的相似性,分子系统进化表明其序列与人的关系最近,其次为牛、羊和兔。多组织半定量RT-PCR研究表明VEGF mRNA在版纳微型猪近交系的18个组织中均有转录水平的表达,其中在卵巢、脾脏、心脏、肺脏及皮肤中表达量较高,其他组织中表达量略低。     

牦牛SLC25A31基因的CDS序列及其表达蛋白生物信息学分析

为了研究牦牛ANT4在脑组织中的表达情况,试验通过RT-PCR技术克隆牦牛SLC25A31基因的cDNA序列,并利用DNAMAN、MAGA4、SWISS-MODEL、ExPASy等生物信息学软件系统对其进行分析。结果表明:扩增出的牦牛SLC25A31基因的编码区长972 bp,编码323个氨基酸;与普通牛、鼠和人相应基因核苷酸序列进行比对,序列一致性分别为99.28%、84.88%和89.81%;其编码蛋白分子质量为35.695 ku,含多个修饰位点。说明SLC25A31基因的CDS序列及其表达蛋白的结构在高原牦牛与普通牛间并无明显差异,保守性极强;并且通常在睾丸中表达的ANT4在高原牦牛脑组织中也能表达。     

胡麻异质型ACCase亚基基因的克隆与表达分析

为研究胡麻异质型乙酰辅酶A羧化酶BCCP、BC、α-CT和β-CT四个亚基基因的生物学功能,采用基因克隆、生物信息学和RT-PCR技术分别对胡麻accA、accB、accC和accD 4个基因进行分析。结果发现陇亚10号accA基因编码α-CT亚基,CDS序列全长为2364 bp,编码787个氨基酸;accB基因编码BCCP亚基,CDS序列全长为1173 bp,编码275个氨基酸;accC基因编码BC亚基,CDS序列全长为1574 bp,编码527个氨基酸;accD基因编码β-CT亚基,CDS序列全长为1137 bp,编码378个氨基酸,且4个基因编码的蛋白都是脂肪酸系数较高的亲水性蛋白。RT-PCR结果表明,胡麻accA、accB、accC和accD 4个基因在3个胡麻品种(高含油量的张亚2号、中含油量的陇亚10号和低含油量的R2-17)的不同时期不同组织的表达模式不同,accA、accB、accC和accD四个基因在R2-17、陇亚10号和张亚2号3个胡麻品种所有时期的不同组织中均有表达,但在种子中的表达量均明显高于其他组织,尤其在种子发育10~25 d油脂快速积累时期,4个基因的表达量都迅速增加并达到最高峰。研究表明异质型乙酰辅酶A羧化酶基因可能调控胡麻种子发育前期油脂的合成积累。     

牛HSL基因的克隆和生物信息学分析

旨在克隆牛HSL基因的CDS序列,并对该基因进行生物信息学、组织表达谱分析。根据GenBank登录的牛HSL基因序列(NM_001080220)设计1对引物,对牛组织样品中的HSL基因CDS序列进行RT-PCR扩增及序列测定;利用半定量RT-PCR方法检测HSL基因在牛各组织中的表达情况;利用生物信息学软件对其所编码的牛HSL蛋白进行分析。结果显示,获得的牛HSL基因CDS全长为2271bp,编码756个氨基酸,与GenBank登录的牛HSL基因同源性最高,为99.9%。HSL蛋白含有一个HSL-Nsuperfamily保守结构域,无信号肽结构,具有疏水性。半定量RT-PCR显示,HSL基因在检测的心脏、脾脏、肺脏、肾脏、肝脏、大网膜、皮下脂肪、肌肉8种组织中均有表达,其中在大网膜和皮下脂肪中表达量较高,在肾脏、脾脏、肝脏、肺脏、肌肉和心脏中度表达。该试验可为研究牛HSL蛋白的结构和功能提供参考。     

猪Fosl2基因克隆、结构预测及其mRNA发育性表达变化

本试验旨在克隆猪Fosl2基因CDS序列并对其进行分析,研究该基因在猪的不同阶段各种组织(心、肝、脾、肺、肾、背最长肌、背部脂肪)中的发育性表达规律。以豫南黑猪为材料,利用RT-PCR技术克隆猪Fosl2基因CDS区域,利用生物信息学方法预测蛋白结构,应用qRT-PCR检测豫南黑猪7~180日龄上述组织中Fosl2基因的发育性表达。结果表明,猪Fosl2基因的CDS区为984bp,编码327个氨基酸,跨膜序列为17~33位氨基酸,该肽链没有信号肽,为跨膜非分泌型蛋白,在122~187位氨基酸的位置存在亮氨酸拉链结构域,核苷酸和氨基酸序列同其他种属间的保守性很高。Fosl2基因拥有广泛的组织表达谱,在心、肝、脾、肾、肺、背最长肌和背部脂肪的不同发育阶段均有不同程度的表达,而其在肺中的表达量均高于同时期其他组织内的表达量,推测猪Fosl2基因可能与肺部组织的发育有关;其在背部脂肪不同发育阶段的变化趋势表明其可能参与调控猪脂肪的生成进而影响瘦肉率。本研究结果将为进一步研究猪Fosl2结构及其多功能奠定基础。     

西农萨能奶山羊SLC7A5基因克隆及其功能初步研究

本研究旨在通过对奶山羊SLC7A5基因的克隆、生物信息学及组织表达谱分析,探究SLC7A5基因在奶山羊乳蛋白合成中的功能。实验以西农萨能奶山羊为研究对象,利用PCR技术克隆萨能奶山羊SLC7A5基因CDS序列,并使用多款生物软件和在线工具进行生物信息学分析,同时分析其组织表达情况。结果表明:成功克隆得到奶山羊SLC7A5基因CDS区,全长1 518 bp,其编码氨基酸505个,蛋白分子量为55.01 ku,理论等电点为8.18,有4个磷酸化位点,为具有跨膜结构的稳定碱性蛋白质;SLC7A5与SLC3A2、SLC38A2、SLC1A1、SLC1A2、SLC1A4、SLC1A5、SLC1A6、SLC1A7、C1H3orf58、BSG蛋白存在互作关系,与山羊、绵羊和牛亲缘最近;组织表达分析表明,SLC7A5基因在奶山羊乳腺组织中显著高表达,其次是脾脏,在小肠和肾脏中表达含量较低;SLC7A5基因在奶山羊泌乳后期显著高表达,其次是前期,泌乳盛期差异不显著。     

猪PNLIPRP2基因的分离、分子特征以及组织表达谱研究

本研究旨在分离鉴定猪胰脂肪酶相关蛋白2(Pancreatic lipase-related protein 2,PNLIPRP2)基因,并对其分子特征及在主要组织中的表达分布进行探讨.利用电子克隆和RT-PCR技术克隆出猪PNLIPRP2基因编码区(CDS)全长,并将序列提交到GenBank;采用GENSCAN等软件和NCBI等在线资源对其及其预测编码蛋白序列进行生物信息学和比较基因组学分析;同时利用半定量PCR技术分析该基因在2月龄大白猪12种组织中的表达情况.结果表明,猪PNLIPRP2基因CDS全长1416 bp(EU715062),编码471个氨基酸,含有1个保守的甘油三酯脂酶抑肽酶PLAT结构域(PLAT-PL),在进化上与人、黑猩猩PNLIPRP2的遗传距离较近.进一步分析显示,该基因定位于猪14号染色体,含有12个外显子和11个内含子.另外,猪PNLIPRP2在小肠中表达量最高,脑、脂肪中次之,骨髓、胃中表达量较低,在其它组织中几乎不表达.本研究对猪PNLIPRP2基因CDS进行了克隆,初步分析了该基因的结构与表达特征,结果提示,猪PNLIPRP2可能是与脂肪沉积和免疫调节密切相关的重要候选基因.     

猪NDUFS2基因的定位、克隆和组织表达谱分析

利用辐射杂种克隆板对猪NDUFS2(NADH dehydrogenase(ubiquinone)Fe-S protein 2)基因进行了染色体定位,克隆了该基因的CDS序列,用相关软件进行了基因结构和功能预测,并利用半定量RT-PCR对基因的组织表达谱进行了分析。研究结果表明:NDUFS2基因定位于猪的4号染色体SSC4q,与标记SW589紧密连锁。获得NDUFS2基因的CDS为1 392 nt,编码463个氨基酸。物种间系统进化树分析表明:猪与牛的NDUFS2基因序列同源性更高。结构预测发现猪NDUFS2基因具有一个NuoD保守结构域,与能量的产生和转化功能有关。根据组织表达谱分析结果,NDUFS2在猪的11种组织中的表达量有差异。     

胡麻异质型ACCase亚基基因的克隆与表达分析

为研究胡麻异质型乙酰辅酶A羧化酶BCCP、BC、α-CT和β-CT四个亚基基因的生物学功能,采用基因克隆、生物信息学和RT-PCR技术分别对胡麻accA、accB、accC和accD 4个基因进行分析。结果发现陇亚10号accA基因编码α-CT亚基,CDS序列全长为2364 bp,编码787个氨基酸;accB基因编码BCCP亚基,CDS序列全长为1173 bp,编码275个氨基酸;accC基因编码BC亚基,CDS序列全长为1574 bp,编码527个氨基酸;accD基因编码β-CT亚基,CDS序列全长为1137 bp,编码378个氨基酸,且4个基因编码的蛋白都是脂肪酸系数较高的亲水性蛋白。RT-PCR结果表明,胡麻accA、accB、accC和accD 4个基因在3个胡麻品种(高含油量的张亚2号、中含油量的陇亚10号和低含油量的R2-17)的不同时期不同组织的表达模式不同,accA、accB、accC和accD四个基因在R2-17、陇亚10号和张亚2号3个胡麻品种所有时期的不同组织中均有表达,但在种子中的表达量均明显高于其他组织,尤其在种子发育10～25 d油脂快速积累时期,4个基因的表达量都迅速增加并达到最高峰。研究表明异质型乙酰辅酶A羧化酶基因可能调控胡麻种子发育前期油脂的合成积累。     

长白猪CIDEC基因、启动子的克隆及其在不同组织中的表达研究

本研究旨在克隆长白猪诱导细胞凋亡DFF45样效应因子C(CIDEC)基因及其转录起始位点前约2000bp启动子区域,并检测其在长白猪不同组织中的表达水平,从而为研究CIDEC在猪中的作用及表达调控机制提供依据。选择8头6月龄去势长白猪,提取肝脏RNA,利用RT-PCR技术扩增CIDEC基因的CDS序列,使用生物信息学相关软件分析其结构和功能;屠宰后采集长白猪心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、皮下脂肪、腿肌、颈阔肌、肱二头肌、小肠、空肠等组织样品,分别提取各样品的总RNA,利用qRT-PCR检测CIDEC在各组织中的mRNA表达量;提取长白猪肝脏总DNA,采用降落PCR方法获得CIDEC启动子序列,利用Methprimer在线软件对CpG岛区域进行预测。结果表明:克隆得到的长白猪CIDEC基因CDS序列长度为747bp,编码238个氨基酸,进化关系分析发现猪与羊、牛的亲缘性较近。CIDEC基因在长白猪的各个组织均有表达,其中在皮下脂肪组织表达量最高,在肾脏中表达量最低。对CpG岛区域预测结果显示CIDEC基因CDS序列不存在典型的CpG岛。     

猪胎盘特异基因1(PLAC1)的克隆、组织表达及遗传方式研究

旨在研究猪胎盘特异性基因PLAC1的表达规律,并对其基因结构、生物功能和遗传方式进行初步鉴定。本研究以妊娠26、50和95天的猪胎盘组织为材料,利用RACE-PCR及RT-PCR技术克隆猪PLAC1基因及其不同转录本的全长序列,同时通过原位杂交验证其在胎盘中的表达模式。并检测猪PLAC1基因的序列变异。结果表明,猪PLAC1基因存在3种不同的转录本,3种转录本的CDS区完全相同,长525bp,编码174个氨基酸;组织表达谱和原位杂交结果显示,PLAC1基因特异性表达于猪胎盘绒毛膜上皮细胞中,并在不同妊娠时期差异表达,妊娠50和95天PLAC1mRNA的表达显著高于妊娠26天(P<0.01)。猪群中PLAC1基因的SNP基因分型检测结果表明该基因遵循半合基因的遗传方式。本试验结果为研究猪PLAC1基因在胎盘发育过程中的生物功能奠定了基础。     

猪SKP1基因的克隆及其在梅山猪与杜洛克猪卵泡中的表达研究

为探索SKP1(S-phase kinase association protein 1)基因在猪卵泡中的表达规律,本试验从猪卵泡组织中克隆了猪SKP1基因CDS区全长序列,采用Real-time PCR方法检测SKP1基因在不同组织中的表达谱,进一步分析了该基因在梅山猪和杜洛克猪S卵泡、M1卵泡、M2卵泡、L卵泡中的表达。结果表明,经克隆测序,得到了猪SKP1基因492 bp编码区全长序列,与羊、人、黑猩猩、牛、大鼠的同源性分别为93.10%、92.90%、92.29%、91.89%、89.86%。SKP1基因在各组织中均有不同程度的表达(肌肉、脂肪、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、十二指肠、卵巢、输卵管、子宫、子宫角、垂体、黄体、大脑、下丘脑),其中在子宫、脾脏、输卵管中表达量较高。SKP1基因的表达量在梅山猪S卵泡、M1卵泡和M2卵泡中的表达量均高于杜洛克猪,特别是在梅山猪M1卵泡和M2卵泡中SKP1基因的表达量极显著高于杜洛克猪(P<0.01),分别达到了2.39、2.82倍,而在L卵泡中的表达量却是杜洛克猪高于梅山猪,结果提示SKP1基因可能参与猪卵泡发育过程。     

猪TIMP-2基因克隆、序列特征和表达分析

本研究分析了五指山试验用小型猪TIMP-2基因的分子特性和可能的生物学功能.将人TIMP-2 mR-NA全长序列在猪ESTs数据库中检索获得同源性较高的ESTs,用电子克隆结合RT-PCR方法克隆获得包含完整CDS区的猪TIMP-2基因cDNA序列,应用生物信息学方法分析了其核苷酸序列及其编码蛋白质分子结构特性,应用RT-PCR研究该基因在猪不同组织和发育时期的特异表达情况.结果,猪TIMP-2 cDNA序列全长790 bp,包括663 bp的完整开放阅读框,编码221个氨基酸.多序列比对和系统进化分析表明,该基因编码蛋白质与人(97%)、大鼠(97%)、小鼠(97%)等物种TIMP-2蛋白质具有较高的同源性.蛋白质序列预测分析发现,猪TIMP-2氨基酸序列理论等电点(pI)为7.65,相对分子质量(MW)为24.5 ku,它包括27AA的前导序列和194AA的成熟肽段,其前导序列比其它物种多1个亮氨酸(Leu).结构功能预测发现其具有1个在种间高度保守的NTR_TIMP结构域和N端VIRAK保守序列,序列中存在的12个半胱氨酸(Cys)可以形成6对二硫键结构.表达谱分析表明TIMP-2基因在猪的多个组织和不同发育时期的表达量存在较大差异,在睾丸、垂体、胃、大肠、卵巢、子宫和90 d胚胎骨骼肌中高表达;而在心脏、小肠、脑、肝脏、成年猪骨骼肌中表达量极低;在肾脏、胸腺、脾、甲状腺、33 d胚胎中中度表达.结果表明该基因在发生组织发育和重构活动相对活跃的组织器官和时期表达水平较高,亦符合其固有生物学功能.     

猪ROCK1基因克隆、序列分析及时空表达研究

为进一步获得猪肉质性状候选基因Rho相关激酶1(Rho-associated,coiled-coil containing protein kinase1,ROCK1)的序列特征、生物学功能及时空表达规律等信息,本研究通过PCR、SMARTer RACE PCR的方法克隆了猪ROCK1基因,应用生物信息学方法分析该基因的蛋白质序列在不同物种中的进化关系,并采用RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法检测其在不同组织和不同猪种背最长肌不同发育阶段的表达。结果显示,ROCK1基因有2个转录本,包含4 065bp的开放阅读框(ORF),编码1 354个氨基酸;猪ROCK1基因ORF序列与人、小鼠和大鼠的ORF序列的同源性分别为95%、91%和91%,相应的氨基酸序列同源性分别为98%、96%和94%,该蛋白在不同物种间高度保守;ROCK1基因的组织分布较广泛,不同发育阶段在同一组织中的表达会发生变化;胚胎期ROCK1基因在梅山猪背最长肌中的表达极显著高于大白猪(P0.01),出生后ROCK1基因在2个猪种背最长肌中的表达无显著差异(P0.05)。本试验结果为研究ROCK1基因在猪骨骼肌发育中的生物学功能及其分子机制奠定基础。     

猪ALAS1基因的克隆、序列分析及表达模式的研究

目的:首先克隆了猪ALAS1(5-aminolevulinate synthase 1)DNA序列,并对CDS序列进行了序列分析,分析了该基因的表达模式。方法:以4月龄长大母猪的卵巢为材料,运用同源序列克隆技术,对猪ALAS1 DNA序列进行克隆并对其进行生物信息学分析;利用性腺激素处理卵巢颗粒细胞并结合RT-PCR方法分析了猪ALAS1基因的表达模式。结果:克隆得到了猪ALAS1 DNA序列9 137 bp,其中包括53 bp的5'非编码区序列、1 922 bp的CDS序列和2~9内含子序列,共编码640个氨基酸;猪ALAS1蛋白氨基酸序列与人和小鼠的相似性一致(100%);ALAS1蛋白的分子量约为38.0 KDa,等电点为9.07,可能存在10个PKC磷酸化位点、1个CAMP磷酸化位点、4个N-糖基化位点、12个豆蔻酰化位点、3个CKII磷酸化位点和1个酰胺位点,还包含1个天冬酰胺转氨酶超家族(AAT-1)保守结构域;猪ALAS1在性腺激素处理2个卵巢颗粒细胞后,可检测到该基因在卵巢颗粒细胞中的显著性表达,之后其表达量迅速下降,12 h后表达量又提高,之后表达量再次迅速下降。结论:猪ALAS1基因的CDS区在物种间保守性强,推测猪ALAS1基因参与卵泡的发育和排卵及在黄体化过程中发挥一定作用。     

Tektin3基因在猪生殖系统发育中的表达规律研究

TEKTIN是附着于精子尾部基因丝的重要组分,对于基因丝的稳定和结构的复杂性起重要作用。Tektin3是其家族成员之一。研究采用RACE方法,获得梅山猪Tektin3基因全序列,利用生物信息学方法分析其结构和功能,采用半定量的方法研究150日龄梅山公母猪23个不同组织Tektin3基因的表达特征,并用Realtime PCR方法分析2、30、60、90和150日龄梅山公猪睾丸的表达规律。结果表明:(1)Tektin3基因全序列1 761bp,包含5'UTR 95bp,完整的CDS序列1 473bp和3'UTR 193bp,编码490个氨基酸,相对分子质量为56 481.3,理论等电点为7.94。(2)Tektin3基因在睾丸中高丰度表达,在下丘脑和子宫角中表达丰度较低。(3)Tektin3基因从梅山猪60日龄开始表达,到90日龄时显著下降(P0.05),150日龄时显著上升(P0.05)。结果表明该基因编码氨基酸除与精子发生有关,可能还与部分组织或器官的纤毛发生及公猪的性发育有关。