一个油茶金属硫蛋白基因的克隆与序列分析

在油茶cDNA文库和EST文库构建的基础上,根据油茶金属硫蛋白的FAST序列设计特异引物,以油茶近成熟种子为材料,利用3'RACE技术,克隆到1个金属硫蛋白基因的cDNA全序列.该基因全长为675 bp,其中5'非编码区59 bp,3'非编码区379 bp,开放阅读框长234 bp,编码78个氨基酸;该蛋白含有14个半胱氨酸,分布在蛋白质的N端和C端,呈CC,CX,CXXC形式排列.预测该蛋白相对分子量为7 864.9 Da;等电点为4.86;37～48位氨基酸间有较强的疏水区.多序列比对发现油茶MT核苷酸序列与茶的相似性达到99%,推导的氨基酸序列与茶完全相同,因此将该基因命名co_mtl.     

灵芝金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和3′-RACE相结合的方法获得了灵芝(Ganoderma lucidum)金属硫蛋白的cDNA序列。该序列全长为315bp,5′-端非翻译区为47bp,3′-端非翻译区具有166bp,开放阅读框长度为102bp(包括一个终止密码子),可编码33个氨基酸。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸(Cys)含量最高,占21.2%,其次是丝氨基酸(Ser)和丙氨基酸(Ala),均占12.1%。对其编码的氨基酸序列进行分析发现该序列具有金属硫蛋白的保守序列模式,是金属硫蛋白家族的成员。     

二色补血草中2个金属硫蛋白基因的克隆及分析

从二色补血草中分离出2个金属硫蛋白基因的cDNA全序列,分别命名为LbMT1和LbMT2。LbMT1全长为569bp,其中5′非编码区23bp,3′非编码区300bp,开放读码框(ORF)长246bp,编码含81个氨基酸的蛋白,相对分子质量为8070,等电点为4.7;LbMT2全长为523bp,其中5′非编码区61bp,3′非编码区216bp,开放读码框长246bp,编码81个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量为8000,等电点为5.0。这2个基因编码的氨基酸都含有14个半胱氨酸Cys,分布在蛋白质的N端和C端,呈CC、CXC和CXXC形式排列。疏水性分析表明:这2个蛋白都存在35~48个氨基酸之间较强的疏水区。通过对多种植物的MT蛋白序列比对分析表明,金属硫蛋白家族在氨基酸数目上保守性差,但半胱氨酸残基(Cys)的位置和数目保守性达到100%,揭示了Cys对金属硫蛋白的功能十分重要。这2个基因已经在Genbank上注册,LbMT1基因的登录号为EF103574,LbMT2基因的Genbank登录号为EF103575。     

柽柳、星星草金属硫蛋白基因双价植物表达载体的构建及其在烟草中的表达

将在柽柳(Tamarix and rossowii)和星星草(Puccinellia tenuiflora)cDNA文库中克隆到的金属硫蛋白基因PCR扩增后,连接到载体pROKII上,构建了分别由2×CaMV35S启动子调控的柽柳金属硫蛋白基因和星星草金属硫蛋白基因双价植物表达载体pRCXM,经PCR检测及酶切鉴定证实pRCXM构建成功。通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tobacum Longjiang911),获得了抗卡那霉素的转基因植株。经初步检测结果显示,外源基因已整合进烟草基因组。重金属抗性结果证明:转基因烟草可以在CdCl2的浓度为300μmol/L的培养基中生长,而对照烟草只能在CdCl2的浓度为100μmol/L的培养基中生长。     

黄河鲤金属硫蛋白基因的克隆及表达分析

采用RT-PCR方法克隆获得黄河鲤(Cyprinus carpio)金属硫蛋白基因的编码区(CDS)序列,该序列长183bp,编码60个氨基酸,不含芳香族氨基酸,其中20个半胱氨酸(Cys)集中分布在肽链的N端和C端,具有MT典型的Cys-X(1³个)-Cys结构,预测分子量为6013 D,理论等电点为8.38。经多序列比对,黄河鲤与高身鲫(Carassius cuvieri)的同源性最高,达94%。采用RT-q PCR进行黄河鲤MT的组织表达分析,结果表明:黄河鲤MT基因的表达存在组织性差异,其相对表达量表现为肝脏>肾脏>腮>脑>肌肉。     

黄河鲤金属硫蛋白基因的克隆及表达分析

采用RT-PCR方法克隆获得黄河鲤(Cyprinus carpio)金属硫蛋白基因的编码区(CDS)序列,该序列长183bp,编码60个氨基酸,不含芳香族氨基酸,其中20个半胱氨酸(Cys)集中分布在肽链的N端和C端,具有MT典型的Cys-X(1~3个)-Cys结构,预测分子量为6013 D,理论等电点为8.38。经多序列比对,黄河鲤与高身鲫(Carassius cuvieri)的同源性最高,达94%。采用RT-q PCR进行黄河鲤MT的组织表达分析,结果表明:黄河鲤MT基因的表达存在组织性差异,其相对表达量表现为肝脏肾脏腮脑肌肉。     

柽柳dir基因的克隆及序列分析

在柽柳cDNA文库测序中获得了dir基因的全长cDNA序列,去除PolyA后,该基因全长为724bp,其中5′非翻译区26bp,3′非翻译区143bp,开放阅读框(ORF)长555bp,编码184个氨基酸.基因编码蛋白的分子量为19·69kD,理论等电点为6·96·疏水性分析表明,蛋白的前41个氨基酸为亲水性的.dir基因编码的蛋白质参与木质素的形成,与植物体的病菌防御有关.该基因的Genbank登录号为DQ462418(基因)和ABE73781(蛋白).     

蜡梅金属硫蛋白基因的克隆与原核表达

金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类富含Cys,能够结合重金属的低分子量蛋白质,广泛分布于生物界。在构建好的蜡梅花cDNA文库并进行EST分析的基础上,通过随机克隆测序得到了1个蜡梅金属硫蛋白的cDNA,命名为CpMetallothionein(CpMT)。CpMTcDNA全长为1083bp,基因内部含有一长度为240bp的开放阅读框,可编码79个氨基酸残基。将CpMT插入原核表达载体pET-32a,并转化Origami2感受态细胞。诱导表达产物经SDS-PAGE结果显示,目的蛋白约为30kD。表达的融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白2种形式存在,用His-Bind蛋白纯化回收试剂盒对其进行纯化回收,得到了高纯度蛋白,为今后研究奠定基础。     

平邑甜茶金属硫蛋白基因MhMT2的克隆和表达分析

【目的】克隆平邑甜茶金属硫蛋白（metallothionein,MT）基因,探讨该基因对逆境的响应机理,为苹果抗逆分子育种提供依据。【方法】采用电子克隆和RT-PCR技术从平邑甜茶叶片中克隆MhMT2基因,利用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推测氨基酸序列进行分析,通过定量PCR技术研究在胁迫条件和激素处理下该基因在叶片中的表达模式。【结果】平邑甜茶MhMT2基因cDNA全长534 bp,具有1个243 bp的完整开放阅读框,编码含80个氨基酸的多肽,其分子量为7.87 kD。同源性比对显示,MhMT2编码的氨基酸序列与其它植物的MT2蛋白有很高的相似性,其中与小金海棠的同源性最高,达到96.4%。MhMT2编码的多肽包含14个Cys残基,其N端富含Cys的结构域具有C-C、C-X-C和C-X-X-C基序,而C端仅有C-X-C基序。聚类分析显示,该基因属于植物MT2基因家族。定量PCR分析表明,MhMT2基因在叶中表达量最高,其次是根,在茎中表达量最低。在ABA、H2O2、机械损伤及NaCl处理下,该基因在叶片中的表达都上调,其中以H2O2最明显。【结论】对MhMT2基因在ABA、H2O2、机械损伤及盐胁迫下的表达模式分析,预示该基因表达水平在植物抗逆反应中起着重要作用。     

大珠母贝金属硫蛋白cDNA克隆与序列特征分析

[目的]探讨重金属对大珠母贝苗种存活的影响。[方法]对大珠母贝金属硫蛋白基因进行克隆和序列分析。[结果]结果表明,通过构建大珠母贝外套膜全长cDNA文库,首次克隆得到大珠母贝金属硫蛋白（PmMT）全长cDNA序列。该序列全长599 bp,5′UTR（Un-translated region）为75 bp,3′UTR为296 bp,开放阅读框（Open reading frame,ORF）为228 bp,编码75个氨基酸。编码的氨基酸中半胱氨酸含量丰富,达29.3%;赖氨酸和甘氨酸含量也较高,均为9.3%;不含苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸;含有软体动物等无脊椎动物金属硫蛋白的特征序列。序列特征分析表明,该序列具备金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族成员。[结论]该研究为海洋贝类金属硫蛋白的进化及功能研究提供基础资料。     

柽柳泛素结合酶基因(E2s)的序列分析及功能验证

从柽柳(Tamarix androssowii)cDNA文库中测序得到一条长度为607bp、编码146个氨基酸的全长cDNA基因序列,对该基因序列进行生物信息学分析,确定其属于泛素结合酶(Ubiquitin conjugating enzyme,E2s)蛋白家族。采用根癌农杆菌介导法对烟草进行E2s基因的遗传转化,通过分子检测证明,该基因整合到烟草基因组中,并在mRNA水平上有不同程度的表达。对各转基因及非转基因对照烟草进行干旱胁迫处理,通过调查相对电导率和相对生长量的变化,研究E2s基因抗旱方面的功能。结果表明,在非干旱胁迫条件下,各转基因株系与对照烟草的相对电导率差异不明显,各株系的相对电导率随着干旱胁迫时间的延长均呈上升趋势,且均小于对照烟草;干旱胁迫20d时,各转基因株系的相对电导率平均为9.12%,非转基因烟草的相对电导率则为12.35%,并且非转基因烟草的相对生长量仅为45.4%,而各转基因株系的相对生长量平均为141.1%,说明E2s基因的导入提高了转基因烟草的耐旱性。     

柽柳eIF1A基因耐重金属CdCl_2胁迫能力分析

通过实时荧光RT-PCR技术研究了CdCl2胁迫下不同时间点柽柳根、茎、叶中eIF1A基因的表达模式,结果表明:该基因受CdCl2胁迫诱导明显,可能参与柽柳的CdCl2胁迫应答。进一步对转柽柳eIF1A基因的T2代烟草进行CdCl2胁迫,测定各转基因株系及野生型烟草的MDA、POD、SOD、可溶性蛋白含量等各项抗逆生理指标,结果表明柽柳eIF1A基因具有提高烟草的耐CdCl2胁迫的能力。     

翻译起始因子(eIF1A)基因的获得及抗旱性分析

从柽柳cDNA文库中测序得到一条长度为631bp,编码113个氨基酸的全长cDNA基因序列,利用生物信息学软件对该基因进行分析,确定其属于eIF1A家族。采用农杆菌介导法进行烟草的遗传转化,通过分子检测证明eIF1A基因已经整合到烟草基因组中,并且在mRNA水平上得到不同程度的表达。对各转基因烟草及非转基因对照烟草进行旱胁迫处理,测定抗逆生理指标、生长量大小。结果证明,柽柳的eIF1A基因具有提高烟草的抗干旱能力。     

白花柽柳微小染色体维系蛋白3（TaMCM3）特异性识别 W-box 元件1）

真核生物翻译起始因子5A（eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A）是一个普遍存在于真核生物中高度保守的蛋白,参与多种生命活动。通过对已克隆得到的一个柽柳eIF5A基因（ TaeIF5A1）启动子分析发现,其-622～-627 bp区域存在W-box“CTGACT”元件,利用酵母单杂交技术筛选柽柳cDNA文库获得一个能够识别W-box的微小染色体维系蛋白3（minichromosome maintenance 3,MCM3）,命名为TaMCM3。进一步利用酵母单杂交验证发现,将W-box的核心序列“TGAC”中的“A”突变成“G”或者将“G”突变成“A”,TaMCM则不能识别这些序列,说明TaMCM3对W-box的识别具有特异性。 TaMCM能够结合含有W-box元件的TaeIF5A1启动子片段,但当W-box序列突变后则不能识别,说明TaMCM是通过与W-box相结合来与TaeIF5A1启动子相互作用的。研究表明,TaMCM能够特异性地识别W-box,并可能具有转录因子的功能。     

刚毛柽柳水通道蛋白ThPIP基因启动子的克隆及其活性分析

[目的]研究刚毛柽柳水通道蛋白ThPIP基因启动子的克隆及其活性分析.[方法]采用染色体步移技术,克隆到刚毛柽柳ThPIP基因起始密码子上游1241bp启动子序列,并通过PLACE和HantCARE预测启动子序列中所包含的主要顺式作用元件.将该启动子替换pCAMBIA1301上的35S启动子,构建融合表达基因proThPlP∷GUS,通过基因枪瞬时转化烟草,并进行GUS组织化学染色.[结果]该启动子具有活性,能够驱动GUS基因的表达.[结论]为进一步鉴定该启动子中的顺式作用元件及相互作用的调控因子奠定基础,从而为揭示刚毛柽柳ThPIP基因的分子调控机制提供依据.     

干旱与NaHCO3胁迫下柽柳基因表达的比较

用cDNA微阵列技术比较了NaHCO3及干旱胁迫下柽柳基因的表达异同。柽柳分别采用0.4mol/L的NaHCO3和干旱处理约30h后取材,分离总RNA,选用Cy3和Cy5进行标记,并与载有柽柳基因的cDNA微阵列杂交,比较了柽柳干旱胁迫的基因表达谱和NaHCO3胁迫的基因表达谱。结果显示,2种胁迫下,有14条基因共同下调表达,31条基因共同上调表达,说明柽柳的抗旱耐盐性状相似性较高。有1个基因在干旱胁迫下为上调表达,在NaHCO3胁迫下为下调表达。同时,和Lea蛋白、脱水诱导蛋白RD22同源的基因在干旱胁迫下表达量升高明显,但NaHCO3胁迫表达量上升不明显;NaHCO3胁迫使与SMDC基因和水通道蛋白同源的基因表达量明显上升,而干旱胁迫其表达量无明显升高,提示了柽柳的抗旱、耐盐性状也存在明显的差异。     

柽柳甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达分析

从柽柳(Tamarix hispida)cDNA文库中分离出甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ThGAPDH)全长cDNA序列,该基因全长1294bp。其中:5′非翻译区84bp,3′非翻译区184bp,开放阅读框1206bp,编码含341个氨基酸的蛋白质,编码蛋白的相对分子质量为37200,理论等电点(pI)为6.97。采用实时定量RT-PCR方法研究了刚毛柽柳在PEG、NaCl、NaHCO3及CdCl2胁迫下不同时间该基因ThGAPDH的表达模式。结果表明:PEG、NaCl及CdCl2处理均能诱导ThGAPDH基因在根中的表达而抑制其在茎和叶中的表达,而NaHCO3处理均能诱导该基因在根、茎、叶中的表达。基因ThGAPDH的cDNA序列在GenBank中的登录号为GQ478708。