牛瑟氏泰勒虫二温式PCR快速检测技术的建立及初步应用

为建立一种牛瑟氏泰勒虫快速检测技术,根据GenBank上已发表的牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因序列(D84447)设计1对特异性引物,扩增出大小为244 bp的基因片段,经克隆、测序分析,与已知基因序列同源性为100%。用该对引物建立的牛瑟氏泰勒虫二温式PCR能检测出的最高敏感度为171 fg/μL,与牛新孢子虫、弓形虫和卵形巴贝斯虫不产生交叉反应,对48份临床血液样本进行检测,阳性检出率为66.67%。用同一对引物对28份临床血液样本分别进行二温式PCR和三温式PCR检测,阳性符合率为95%,总符合率为96.43%。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异等优点,可用于牛瑟氏泰勒虫病的快速临床诊断及流行病学调查。     

牛瑟氏泰勒虫ITS基因PCR诊断方法的建立

本试验根据GenBank上登录的牛瑟氏泰勒虫ITS基因序列(AY661522.1),应用Primer Premier 5.0和Oligo 6.31软件设计合成1对特异性引物,以牛瑟氏泰勒虫DNA为模板,建立了牛瑟氏泰勒虫ITS基因PCR诊断方法。该方法扩增片段大小为1020 bp,与参考序列的同源性为98%;建立的PCR方法与猪附红细胞体、犬新孢子虫和弓形虫均无交叉反应,最低DNA检出量为1.5 pg/μL;通过对60份临床样品的检测,并与血涂片方法进行比较,结果显示PCR方法具有特异、敏感等特点,适用于牛瑟氏泰勒虫的检测。     

牛瑟氏泰勒虫环介导等温扩增检测方法的建立

为建立快捷、灵敏的牛瑟氏泰勒虫(T.sergenti)检测方法,本研究以感染牛T.sergenti的阳性血液为试验材料,建立了牛T.sergenti P33表面蛋白基因环介导等温扩增(LAMP)检测技术,并优化了LAMP的各反应条件,进行了敏感性和特异性试验。结果显示,扩增产物经显色、电泳、酶切鉴定后,LAMP方法扩增牛T.sergenti产物检测管显色后呈阳性反应,最低检测量为2.3fg/μL模板DNA,比普通PCR高10倍,牛T.sergenti LAMP产物电泳后呈特征性梯状条带,而弓形虫等对照组均无扩增条带。说明本研究建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速等优点,适合于牛T.sergenti的检测。     

牛瑟氏泰勒虫不同靶基因PCR检测方法的比较

为筛选出检测牛瑟氏泰勒虫更为特异、敏感的PCR方法,本试验以牛瑟氏泰勒虫p23和p33基因、HSP70基因及18S rRNA基因为靶基因进行PCR检测,并从其敏感性、特异性和临床样本检出率等方面进行了比较。结果显示,4种靶基因引物对牛瑟氏泰勒虫的检测均有较高的特异性,当牛瑟氏泰勒虫基因组DNA浓度为127 ng/μL时,p23、p33、HSP70及18S rRNA4种基因的最小检测量分别为1×105、1×105、1×104和1×106copies/μL;检测临床样本阳性检出率分别为30.19%(16/53)、39.62%(21/53)、47.17%(25/53)和54.72%(29/53)。表明以18SrRNA基因为靶基因的PCR方法从敏感性和临床检出率上明显优于其他3种基因。     

牛瑟氏泰勒虫表面蛋白p33基因的真核表达

目的构建牛瑟氏泰勒虫表面蛋白p33基因的真核表达载体。方法根据已发表的牛瑟氏泰勒虫（Thei-leria sergenti）表面蛋白p33基因的核苷酸序列设计引物,应用PCR技术从牛瑟氏泰勒虫基因组DNA中扩增p33基因片段并克隆入pMD18-Tsimple载体。进一步将该基因插入到真核表达载体pVAXⅠ,转染Hela细胞后进行RT-PCR检测和IFA检测。结果牛瑟氏泰勒虫表面蛋白p3基因成连接到pVAXⅠ载体中,并在真核细胞中有效表达。结论本研究试验为今后该基因的进一步动物试验奠定了基础。     

牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因的克隆与原核表达

本研究根据GenBank牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因设计1对引物,利用全血基因组DNA提取试剂盒提取牛瑟氏泰勒虫全血基因组DNA,PCR扩增得到了大小为786 bp的基因片断,测序分析证明,它与已报道序列的核苷酸同源性可达99%.将该基因与pET-28a(+)载体进行连接,经酶切和PCR鉴定,证明成功构建了含有目的基因片段的重组表达载体pET-28a-P33.将此质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,用IPTG进行诱导.结果证实,该基因在大肠杆菌中用IPTG诱导4 h时表达量达到高峰,表达产物为分子质量约30.3 ku的融合蛋白,其表达量占菌体总蛋白的43%,以包涵体形式存在;Western blotting试验证明,表达蛋白P33可被牛瑟氏泰勒虫阳性血清所识别,表明该融合蛋白具有较好的反应原性.     

牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

应用PCR方法扩增了牛瑟氏泰勒虫吉林株P33表面蛋白基因片段,并将扩增产物与pMD18-T载体连接,重组质粒经PCR、双酶切鉴定后测序;构建P33重组pGEX-4T-3表达载体,转化大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达后.进行SDS-PAGE、免疫印记分析.结果显示,获得P33基因完整开放阅读框长868 bp,编码292个氨基酸,与中国株同源性为99.1%;表达的融合蛋白相对分子质量为59 000,能被牛瑟氏泰勒虫阳性血清识别,表明该融合蛋白具有较好的免疫原性.     

牛瑟氏泰勒虫病PCR诊断方法的建立

为建立特异、敏感、快速的诊断方法,根据本实验室已测得的瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因序列,设计一对特异性引物,扩增出大小为499 bp的基因片断,经克隆、测序分析,与已知基因序列同源性为100%。用该对引物建立的牛瑟氏泰勒虫病PCR诊断方法,通过对75份牛血液样本检测,检出率为72%(54/75)。该方法具有特异性好、敏感性强等优点,可用于牛瑟氏泰勒虫病的诊断和流行病学调查。     

羊泰勒虫病二温式PCR诊断方法的建立及初步应用

为建立特异、敏感、快速的羊泰勒虫病诊断方法。根据Gen Bank已报道的羊泰勒虫表面蛋白基因(AY274329)设计合成了1对引物,通过条件优化,建立了羊泰勒虫病二温式PCR诊断方法。该方法能扩增出335 bp的羊泰勒虫特异性基因片段,测序结果与已知基因序列同源性为100%。对羊泰勒虫基因组DNA的最小检测量为16 fg/μL,与新孢子虫、弓形虫、巴贝斯虫和瑟氏泰勒虫均无交叉反应。与普通PCR相比,二温式-PCR在敏感性方面无显著差异,但其反复升温降温时间消耗短。结果表明,二温式PCR诊断方法具有较高的特异性和敏感性,可用于羊泰勒虫病的快速诊断和流行病学调查。     

羊泰勒虫病半套式PCR诊断方法的建立及初步应用

试验根据羊泰勒虫 18S rRNA基因序列设计了3条引物,建立了羊泰勒虫病半套式PCR诊断方法.该方法是基于一次PCR的一种提高PCR敏感性的方法,同时也保证了产物的特异性,并对吉林省珲春地区的65份羊抗凝血进行检测,旨在为今后羊泰勒虫病的诊断和流行病学调查奠定基础.     

牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因的克隆与原核表达

构建牛瑟氏泰勒虫P23基因片段原核重组表达质粒,表达重组蛋白。采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因,将扩增产物与pMD18-T-Simple载体连接,测序,验证扩增产物。将P23基因片段克隆到载体pGEX-4T-3上,经酶切分析、PCR鉴定后,IPTG诱导表达,最后用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定表达产物。结果表明克隆的P23基因片段为684 bp,重组质粒pGEX-4T-3/P23构建成功;SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量约为58 ku;Western blotting分析结果显示,与牛瑟氏泰勒虫阳性血清发生反应,而与牛瑟氏泰勒虫阴性血清无反应,表明牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白具有良好的抗原性和特异性,提示可以利用融合蛋白来建立检测抗体的间接ELISA诊断方法。     

牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因的克隆与序列分析

为分析吉林省流行的牛瑟氏泰勒虫基因序列，根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因序列设计合成一对引物，用PCR方法扩增出牛瑟氏泰勒虫的基因片段，并成功地将该基因纯化后克隆到pGEM-TEasy载体上，将经EcoRⅠ酶切鉴定和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序。结果表明克隆的基因片段长度为868bp，编码283个氨基酸，有2个潜在的糖基化位点。核苷酸同源性分析表明，该基因片段与韩国株（AF521557）、日本株（AB016280）、俄罗斯株（AB016279）的核苷酸序列同源性分别为99．4％、88.0％、88．1％。     

奶牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因的克隆及序列分析

研究根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白的基因序列设计合成1对引物,用PCR方法扩增出了牛瑟氏泰勒虫的基因片段,将该基因纯化后连接到pMDl8-T栽体上,进行序列测定和分析,并用此方法对延边某奶牛场10头奶牛进行了检测.结果表明:10份样品中9份为阳性,所扩增的目的基因核苷酸长为868 bp,共编码283个氨基酸;该段基因片段与牛泰勒虫韩国株核苷酸序列同源性为99.4%,氨基酸同源性为99.3%.     

马泰勒虫不同PCR检测方法的比较

为寻求一种快速、有效的马泰勒虫PCR检测方法，用Bec-UF2、Equi-R；EMA-1F、EMA-1R两对引物对56份马血液样本中马泰勒虫的核蛋白体基因和表面蛋白基因进行了常规PCR方法检测，用EMA-5、EMA-6；EMA-7、EMA-8两对引物对56份马血液样本中马泰勒虫的表面蛋白基因进行了PCR和套式PCR方法检测。结果显示，以Bec-UF2、Equi-R为引物的PCR方法的阳性检出率为57．1％（32／56），以EMA-5、EMA-6；EMA-7、EMA-8为引物的套式PCR方法的阳性检出率为51．8％（29／56），以EMA-1F、EMA-1R为引物的PCR方法的阳性检出率为17．9％（10／56）。结果表明，以Bec-UF2、Equi-R为引物的常规PCR方法为检测马泰勒虫的最佳方法。     

套式PCR扩增山羊吕氏泰勒虫18S rRNA基因

泰勒虫是一种危害动物的重要血液寄生性原虫,常寄生于牛、羊、骆驼和其他野生动物,在中国的东北、西北等地较为流行。采集安徽定远县某山羊场疑似焦虫病的山羊血样,首先采用血涂片法检查,再用Blood DNA&Tissue kit提取血液基因组,参照Kim和Wei的方法设计2对引物用于泰勒虫18S rRNA基因的扩增,并对该方法进行敏感性和特异性分析。结果显示:血涂片检查明显可见红细胞内有典型的虫体,大小为0.6~2μm,初步怀疑为泰勒虫(Theileria);PCR扩增可扩增出359 bp大小目的片段,与预期结果相一致;基因序列同源性表明,该泰勒虫分离株基因与已报道泰勒虫毒株(JQ926740.1)核苷酸同源性最高,可达99.72%;在遗传进化方面,所分离的泰勒虫和吕氏泰勒虫(Theileria luwenshuni)Nanjingdong(JQ926740.1)最接近,而且在一个分支上。本试验所建立的套式PCR具有良好的特异性,且敏感性较高,最低测出量是3.8 fg/μL。本次分离的羊血液原虫为吕氏泰勒虫。     

牛瑟氏泰勒虫p33双拷贝基因的真核表达

为构建牛瑟氏泰勒虫p33双拷贝基因真核表达质粒,以牛瑟氏秦勒虫基因组DNA为模板,应用SOE—PCR技术得到牛瑟氏泰勒虫p33双拷贝基因,将其先克隆到pMD18T—Simple载体,再亚克隆到真核表达载体pVAX1中,得到重组质粒pVAX1—2p33。对该重组质粒进行PCR、酶切鉴定及测序后,采用脂质体法将其转染到BHK-21细胞,用RTPCR和IFA进行鉴定。结果表明,牛瑟氏泰勒虫p33双拷贝基因真核表达质粒pVAX12p33构建成功并可以在BHK-21细胞中表达。本试验结果为p33双拷贝基因的免疫学研究奠定了基础。     

牛卵形巴贝斯虫巢式PCR诊断方法的建立及初步应用

根据GenBank上发表的牛卵形巴贝斯虫CCTη基因序列设计合成2对巢式PCR引物,建立牛卵形巴贝斯虫巢式PCR诊断方法,对该方法的最佳反应条件进行了筛选,并进行了特异性、敏感性及临床样本检测试验。结果表明,建立的巢式PCR方法外引物扩增牛卵形巴贝斯虫基因组片段的长度为1 008bp,内引物为537bp;该方法扩增不出牛瑟氏泰勒虫、弓形虫、犬新孢子虫基因组DNA;最低检测DNA含量为16fg;通过对46份临床样本的检测,该巢式PCR较常规PCR阳性检出率高8.7%。本试验为牛卵形巴贝斯虫病的诊断提供了一种更为特异、敏感的检测技术。