H9N2亚型鸡源禽流感病毒分离与鉴定

禽流感 (AI)又名真性鸡瘟或欧洲鸡瘟 ,是由正粘病毒科 A型流感病毒引起的一种传染病 ,是国际兽医局规定的 A类烈性传染病。鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及其他野禽均可感染。我们从新乡市某蛋鸡场分离鉴定 1株低致病力的 H9N2亚型的禽流感病毒毒株 ,现报告如下。1　材料与方法1.1　材料　病料来自河南职业技术师范学院禽病研究所接诊检验的病、死鸡。禽流感 A型琼扩抗原、标准阳性血清以及抗 HA、NA分型血清购自中国农科院哈尔滨兽医研究所 ;抗新城疫 (ND)血清和抗减蛋综合征 (EDS- 76 )血清由本院禽病研究所提供。 SPF鸡胚和雏鸡购自…     

一株鸡源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

从福州市某活禽市场采集的鸡泄殖腔棉拭子样品中分离出1株病毒,经血凝抑制试验(HI)和聚合酶链反应(PCR)方法鉴定为H9N2亚型禽流感病毒。在GenBank基因库中对该病毒株的3个基因片段的测序结果进行BLAST比对分析表明,3个基因片段均属于H9N2亚型禽流感病毒的基因。HA基因遗传进化分析表明,该病毒分离株与代表株DK/HK/Y280/97处于同一分支,与上海的鸡源分离株A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)同源性最高,同源性为99.5%。     

云南2株H4N6亚型禽流感病毒株的分离与鉴定

采集家禽喉气管作为检测样品,用甲型流感病毒M基因检测引物进行RT-PCR检测,确定样品为甲型流感病毒感染。用已建立的PCR法检测H5、H9亚型及新城疫结果为阴性。在9日龄鸡胚中进行病毒分离培养,收集48 h后死亡鸡胚尿囊液进行血凝和血凝抑制试验,有血凝效价但不能被H5、H7、H9和新城疫阳性血清抑制。为进一步确定病毒的亚型,用甲型流感病毒血凝素基因通用引物进行RT-PCR扩增、克隆及测序,将测得的HA基因序列与血凝素亚型标准序列进行比对,同源性为34.9%～87.3%,与H4亚型的同源性为87.3%;设计神经氨酸酶基因测序引物,将所测序列与神经氨酸酶亚型标准序列进行比对,同源性为47.7%～90.8%,与N6亚型的同源性高达90.8%。通过进行HA和NA基因序列比对,可以确定试验所分离到的2株甲型流感毒株为H4N6亚型禽流感病毒。     

一株普通鵟源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

从深圳野生鸟类救护基地的1只普通鵟的泄殖腔拭子中分离到1株禽流感病毒,将该禽流感病毒进行鸡胚接种和HA、HI试验鉴定、HA基因扩增及测序分析,并进行致病性试验。结果表明,该分离株为H9N2亚型禽流感病毒,按照国际流感病毒系统命名原则将该病毒株暂命名为A/Wild bird/Guangdong/SZ-YN05/2015(H9N2)。进化分析显示,该毒株属于4.2.1分支,与SS/94株同源性较低,与A/Chicken/Shandong/GM-TH/2014(H9N2)的遗传距离最近。同时以血凝价HA 8log2病毒尿囊液稀释200倍静脉注射接种感染4周SPF鸡,感染3d后从心、肝、肺、肾、气管、咽及肛分别检测到病毒,感染7d后从心、肝、肺、肾、气管均未分离到病毒,咽部病毒分离率2/6,肛部病毒分离率3/6。     

鸡胚中H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

将来自有产蛋下降的肉用型父母代种鸡群的种蛋孵化,每日观察鸡胚死亡情况。在孵化的50个鸡胚中9日龄时开始死亡1个,尿囊液无血凝性,盲传一代后,鸡胚尿囊液有血凝性。在HI试验中,对H9亚型禽流感病毒(AIV)单因子血清在1∶26稀释度时呈现血凝抑制活性,对新城疫病毒(NDV)和H5亚型AIV单因子血清不呈血凝抑制活性,由此确定为低致病性禽流感病毒,命名为ZKH90901。对该毒株进行HA和NA基因扩增克隆测序,把获得的HA和NA基因与已经发表的H9N2毒株的相应序列比较,结果表明该毒株确实为H9N2亚型禽流感病毒,HA基因的裂解位点序列为KSGR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒H9N2蛋白裂解位点的分子特征,仍属于低致病力毒株。从鸡胚中分离到H9N2亚型禽流感病毒在国内尚未见报道。     

一株H5N2亚型鹦鹉源禽流感病毒的分离鉴定

在广东进行流行病学调查时从鹦鹉采集的拭子样本中分离到一株禽流感病毒,应用聚合酶链反应(PCR)、血凝抑制试验(HI)和基因测序等方法技术对其进行了亚型鉴定。结果表明,此分离株具有血凝活性,且被H5亚型禽流感病毒标准阳性血清特异性抑制;分别用针对禽流感病毒的M、H5亚型禽流感病毒的HA基因、N2亚型禽流感病毒的NA基因特异性鉴定引物对该分离株进行PCR扩增,均扩增出特异性目的片段;测序及BLAST分析表明其与H5N2亚型禽流感美国分离株的HA基因和NA基因核苷酸序列相似性高达97%以上,由此该分离株鉴定为H5N2亚型禽流感病毒,并命名为A/Parrot/Guangdong/268/2005。     

两株H6N8亚型禽流感病毒分离株的分离与鉴定

为了解禽流感病毒(AIV)在我国华南地区的流行情况,我们对活禽市场中分离得到的两株鸭源H6N8亚型AIV[A/duck/Fujian/S2191/2011 (H6N8) (FJ/191/11)和A/duck/Guizhou/S4035/2011 (H6N8) (GZ/035/11)]进行全基因序列测定,并进行其对SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性试验.序列分析显示:HA裂解位点基序为339pQIETR ↓GLFG348,为低致病性AIV特征.内部基因分别源于两个国内流行的H6亚型病毒家系(ST339-like和HuN573-like).序列分析表明FJ/191/11和GZ/035/11为H6亚型病毒与其他亚型AIV的N8NA基因发生重组,呈现明显的异源性.两分离株的感染性试验显示,它们对鸡和小鼠均呈低致病性;而且不能在鸡体内有效复制;对小鼠的感染性实验结果显示,小鼠肺脏和鼻甲病毒分离结果为阳性,其他脏器病毒滴定结果为阴性.     

湖北地区鸡源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为了分离鉴定病鸡排泄物中的禽流感病毒,并分析其遗传背景,通过鸡胚接种试验区和病毒特异性抗体中和试验区,从病鸡排泄物中分离鉴定出2株禽流感病毒,分别命名为A/chicken/Jinmen/JM0305/2017(JM0305)和A/chicken/Daye/DY0602/2017(DY0602)。利用禽流感病毒亚型特异性抗体中和试验区和基因测序分析等方法对2株禽流感病毒进行亚型鉴定。结果表明,2株禽流感病毒均属于H9N2亚型。为了解这2株H9N2亚型禽流感病毒的生物学特性,对其全基因组进行了分析以及毒力测定。结果显示,将2株毒株感染雏鸡后,未产生明显的禽流感临床症状,2株H9亚型禽流感病毒的MDT值分别为72.0h和91.2h,HA裂解位点处的氨基酸序列均为-PSRSSR/GL-,表明2株禽流感病毒均属于低致病性禽流感。遗传进化分析表明2株病毒的HA基因均在H9亚型分支上,NA基因均在N2亚型的分支上;通过进化树分析表明2株病毒属于以A/chicken/Beijing/1/94(H9N2)为代表的欧亚谱系。该结果为进一步研究鸡源H9N2亚型禽流感病毒分子进化奠定了基础。     

H9N2亚型禽流感病毒TJ1株的分离与鉴定

从发病蛋鸡群分离到H9N2亚型禽流感病毒TJ1株,对其进行了系统的生物学特性鉴定.结果表明,分离毒TJ1株具有血凝性,且凝集不被新城疫和产蛋下降综合征抗血清抑制,而被H9亚型禽流感病毒标准阳性血清抑制,禽流感琼扩试验结果为阳性,在电镜下呈典型的流感病毒粒子形态,证明该毒株为A型流感病毒;通过致病力试验,分离毒TJ1株对6周龄SPF鸡无致病性,为低致病性毒株;用其制备成油乳剂灭活疫苗免疫雏鸡,能很快产生对H9特异的血凝抑制抗体,于免疫后3周攻毒,可以保护雏鸡抵御同病毒攻击的感染,表明分离毒TJ1株具有良好的免疫原性.     

H6亚型禽流感病毒的分离鉴定与生物学特性分析

为了解低致病性禽流感病毒(LPAIVs)在广西地区家禽中的流行情况,对广西地区活禽市场的家禽进行LPAIVs流行病学监测,分离鉴定出7株H6亚型禽流感病毒(AIV)。通过在广西地区活禽市场采集家禽咽喉和泄殖腔棉拭子样品,将其接种SPF鸡胚,收集尿囊液进行HA和HI试验,结果显示这7株只与H6亚型AIV的阳性血清发生反应,产生血凝抑制现象,初步鉴定为H6亚型AIV。通过HA和NA基因的克隆与测序鉴定,进一步确定为H6亚型AIV,与NA基因存在5种组合,包括H6N1、H6N2、H6N5、H6N6和H6N8。鸡致病性试验表明分离株可感染但不致死SPF鸡,并通过咽喉和泄殖腔排毒,结合HA裂解位点附近的氨基酸序列,表明所分离到的7株H6亚型AIV符合LPAIV的特征。     

两株H9N2亚型猪流感病毒全基因进化分析

用RT-PCR方法扩增了H9N2亚型猪流感病毒河南株(Swine/Henar/Y1/09)和H9N2亚型猪流感病毒上海株(Swine/Shanghai/Y1/09)的8个基因片段,进行测序分析.结果表明,这两株猪流感病毒HA基因长度均为1701 bp,编码566个氨基酸,HA切割位点序列均为R-S-S-R-G,属非高致病性毒株;这两个毒株的HA蛋白均有8个潜在的糖基化住点.两个分离株的NA基因长度为1401 bp,编码467个氨基酸,这两个毒株均在茎区63、64、65位发生氨基酸缺失.两株猪流感病毒HA基因的同源性为96.6％,NA基因的同源性为98.6％.两株毒株的8个基因片段系统发生树分析表明它们均为重组体,与2008年上海地区健康鸡群中分离的H9N2亚型毒株(Ck/Shanghai/Y 1/2008)8个基因片段均分别属于同一个基因群.     

免疫鸡群H5N1和H9N2亚型禽流感病毒混合感染及H9N2亚型病毒进化分析

本研究分析了免疫鸡群H5N1和H9N2亚型禽流感病毒混合感染中H9N2亚型分离毒株A/chicken/Yuyao/01/2010(H9N2)的基因组特征。氨基酸序列分析显示,HA蛋白裂解位点为PSRSSR/GL,具有低致病性禽流感病毒特征,HA受体结合位点出现了人流感病毒结合位点226L,D基因出现了S31N的突变。遗传分析表明,A/chicken/Yuyao/01/2010病毒的HA基因、NA基因和NS基因在进化上属于CK/BJ/94-Like谱系,D基因和PB2基因属于G1-Like谱系,NP基因、PA基因和PB1基因属于Ck/SH/F/98-Like谱系。结果表明,从H5N1和H9N2亚型混合感染鸡体内分离的H9N2亚型禽流感病毒是一株来源于CK/BJ/94-Like谱系、G1-Like谱系和Ck/SH/F/98-Like谱系的重组病毒。     

上海市三株H9N2鸭禽流感病毒全基因遗传进化分析

为了解上海市鸭群中H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）的遗传变异特征,以及与疫苗株A/Chicken/Shan dong/6/1996和A/Chicken/Shanghai/F/1998之间的遗传距离,对2007年和2009年分离自上海市鸭气管和泄殖腔样品采用荧光RT-PCR检测,将H9亚型禽流感病毒核酸阳性样品处理后,经鸡胚尿囊腔接种分离病毒,HI进一步确定血凝素（haemagglutin,HA）亚型,随后进行了全基因测序,并结合GenBank中的相关序列进行遗传进化分析。结果表明：3株分离毒株为H9N2亚型鸭禽流感病毒,HA蛋白裂解位点的氨基酸组成为PARSSRGLF,符合低致病性禽流感病毒特征,均属于经典的H9N2 Ck/Bei群系;NA基因均属于Y280系;NP、PA基因和A/Goose/Guangdong/1/1996（H5亚型）归为一群;PB2和M基因属于Qa/HK/G1/97系;NS基因仍为Ck/Bei系;2007年的分离株和2009年的分离株在PB1基因上分属不同亚群。3株病毒的HA1基因与疫苗株A/Chicken/Shandong/6/1996和A/Chicken/Shanghai/F/1998之间的遗传距离均大于7%。由此可见,3株鸭H9N2亚型毒株可能是由不同禽流感病毒基因亚群间发生自然重排的产物,现有疫苗对分离株的保护性需要进一步评估。     

H9N2亚型禽流感病毒反向遗传操作平台的建立

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在自然界中广泛存在和传播,给养禽业造成了巨大损失。为了进一步揭示该病毒的致病机制,本研究采用RT-PCR技术扩增禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/1/2006(简称SH1)的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS 8个基因片段,并分别克隆至PLLB双向表达载体上。采用8质粒系统共转染293T细胞,转染48 h后加入TPCK胰酶作用2 h,将上清液和细胞一同接种9~11日龄SPF鸡胚,并检测其血凝效价。经序列比对,拯救获得的病毒rSH1的8个基因片段序列均与亲本病毒SH1的序列相同。实验结果表明,本研究成功建立了H9N2亚型禽流感病毒反向遗传操作系统,为该病毒的致病机理和传播机制研究等奠定了技术平台。     

2017年上海市活禽市场H9N2亚型禽流感病毒全基因进化分析

为了解上海市活禽市场H9N2亚型禽流感病毒(AIV)分离株的遗传变异情况,本研究对2017年分离的6株H9N2 AIV的8个基因片段进行RT-PCR扩增、克隆和测序,并对获得的HA基因序列进行同源性和关键位点分析.结果显示:6个分离株的HA裂解位点均为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV的分子特征;6株分离株均有8处糖基化位点;受体结合位点除198位和202位有变异外,其它位点均保守,226位氨基酸均为L,228位氨基酸均为G,因此具有与哺乳动物唾液酸α2-6受体结合的特征;所有分离株HA基因核苷酸同源性为93.4%~99.9%,氨基酸同源性为93.8%~99.5%,HA基因进化树显示上述6株分离株均属于近几年在中国鸡群中流行的h9.4.2.5分支;从8个基因片段组成方式分析这6个毒株属于G57基因型.本研究结果为H9N2亚型AIV的防控和疫苗研制提供了科学参考.     

猪源H9N2亚型流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析

2008年10月~2009年3月采集剖检病死猪喉拭样品41份,从中分离鉴定了2株H9N2亚型猪流感病毒,对其进行部分生物学特性的研究、全基因测序和遗传演化分析,发现血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白335~338的裂解位点上,A/Swine/Yangzhou/1/08为RSNR,A/Swine/Taizhou/5/08为RSSR,均为典型低致病性禽流感病毒的特征性序列。2株病毒的HA、神经氨酸酶（neuraminidase,NA）、核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,NP）、非结构蛋白（nonstructural protein,NS）、血清前白蛋白（prealbumin,PA）和多聚酶蛋白（polymerase protein1,PB1）基因均来源于A/Chicken/Shanghai/F/98,基质蛋白（matrix,M）基因与A/Swine/Yangzhou/1/08的PB2基因来源于A/Quai/Hong Kong/G1/97,值得注意的是A/Swine/Taizhou/5/08的PB2基因虽然可能来源于A/Chicken/Shanghai/F/98但与A/environment/Hunan/1-35/2007（H5N1）的高度同源,生物学特性试验也表明A/Swine/Taizhou/5/08比A/Swine/Yangzhou/1/08毒力强。     

福建省H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因的进化分析

为进一步了解福建省H9N2亚型禽流感病毒的基因遗传进化关系,本研究将福建省2011年分离的毒株FZ-04、FZ-11与GenBank上登录的2000～2011年福建省分离的H9N2毒株及国内外典型代表株进行HA、NA基因的序列比对和遗传进化分析。结果表明,分离株FZ-04和FZ-11的HA基因与CK/FJ/G9/09株核苷酸同源性最高,属于国内常见的CK/BJ/1/94亚系。HA裂解位点处的氨基酸序列为-PSRSSR/GL-,符合低致病性禽流感病毒的分子特征。NA基因在遗传进化关系上呈现独立的分支,与CK/FJ/10954/05毒株核苷酸序列同源性最高,属于CK/HK/G9/97亚系,且NA基因推导的469个氨基酸序列中没有缺失。同时,从HA和NA基因的遗传进化树上可知,2000～2011年福建省H9N2禽流感病毒进化相对比较稳定,可能有一个共同的起源。     

2007～2008年上海地区H9亚型禽流感病毒HA基因序列分析

对分离自上海活禽批发市场的11株H9亚型禽流感病毒（Arian influenza virus,AIV）（2007年5株、2008年6株）进行了血凝素（hemagglatinin,HA）基因序列的测定,以阐明2007年至2008年上海地区H9 AIV分离株HA基因的遗传变异及分子特征。采集鸡气管和泄殖腔棉拭子样品,将H9亚型荧光RT-PCR试剂盒检测出的阳性样品处理后,经鸡胚尿囊腔接种分离病毒,血凝抑制试验（haemagglutination inhibition,HI）进一步确定HA亚型,通过RT-PCR方法分别扩增了11个毒株的HA基因并进行了序列测定。遗传发生关系分析,这11株分离株均属于Ck/Bei/1/94系。2007年至2008年上海地区H9亚型分离株具有相同的起源,且分子特性相似。     

一株番鸭源N6亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的克隆及序列分析

为了丰富水禽源流感病毒神经氨酸酶基因（NA）的分子流行病学资料,通过对2008年分离自福建省某种番鸭1株罕见的H6N6亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）NA基因进行克隆分析,发现该毒株NA基因全长为1431bp,开放阅读框为1380bp（19～1398）,其中从第175～207位缺失33个核苷酸：其编码459个氨基酸,颈部存在有11个氨基酸的缺失（TNSTTTIINNN）,为在N6亚型神经氨酸酶基因中首次报道有颈部缺失。该NA基因和我国分离的A／duck／Eastern China／01／2007（H4N6）NA基因的核苷酸同源性最高,达97．1％,并处在同一遗传进化分支上;与其它H6N6亚型AIV分离株NA基因的同源性均较低,同源性处在78．3％到79．6％之间,相互之间遗传关系较远,其它H6N6亚型AIVNA基因在遗传进化上呈独立进化分支。     

H1N2亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的建立

利用RT-PCR技术扩增猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07（H1N2）的8个基因片段,分别克隆至双向转录表达载体PBD上,构建出8个能在哺乳细胞中复制和表达的质粒。将8个质粒共转染293T细胞,收取转染48 h时的细胞上清并接种9～11日龄SPF鸡胚,成功拯救出有血凝活性的病毒。经序列测定,确定拯救病毒的8个基因片段均来自猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07（H1N2）基因组。H1N2亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的成功建立为猪流感病毒致病机理、传播机制及病毒基因功能的研究奠定了基础;同时,为H1N2亚型猪流感新型疫苗的研制开辟了新的途径。