KK-42对日本沼虾幼虾蜕皮周期的影响及其可能机制

为了探索KK-42对日本沼虾幼虾蜕皮周期的影响及其可能的机制,以水产基地自行繁殖的2月龄幼虾(体长1.2~2.0 cm)为材料,捕捞后暂养于流水养殖水槽,水温(26±1)°C,每天投喂2次,1周后用于实验研究。用1.95×10–4 mol/L的KK-42溶液(处理组)或不含KK-42溶液(对照组)浸润1 min,取出,一部分用于幼虾生长速率、蜕皮周期的测定;从剩余部分中选择处于蜕皮间期(C)和蜕皮前期(D)的幼虾,Real-time PCR分析表皮几丁质酶1基因(Mnchi-1)的转录水平,同时进行表皮几丁质酶的活力测定。在实验观察期间,KK-42处理组平均体质量均显著高于对照组,体质量增长率的升高出现在处理后的前2周。随着幼虾的生长,蜕皮周期的持续时间均趋于延长,在4个连续测定的蜕皮周期中,KK-42处理能明显缩短前2个周期的时程,分别从(8.70±1.07)、(9.81±0.43)d/周期缩短为(6.93±0.97)、(8.11±1.20)d/周期。KK-42处理可显著上调C期表皮Mnchi-1的表达,在第3、6和9 h,其m RNA水平比对照组高10倍以上,酶活性同比提高2倍以上;KK-42对D期的影响相对较弱,该基因的表达水平及酶活性仅在12 h显著升高。结果表明,KK-42能显著诱导D期、尤其是C期表皮Mnchi-1基因的表达,提高几丁质酶活性,推测幼虾对旧表皮的分解提前至C期,这可能是KK-42缩短幼虾的蜕皮周期、促进其生长的分子机制之一。     

罗氏沼虾几丁质酶3B基因的克隆及其在蜕皮周期中的表达

罗氏沼虾的生长发育及繁殖都与蜕皮紧密相关。几丁质酶是甲壳动物在蜕皮过程中最重要的酶之一。本研究对罗氏沼虾蜕皮周期外观特征和腹肢刚毛进行了观察描述,克隆并分析了罗氏沼虾的几丁质酶Ⅲ基因(MrChi3B),制备了几丁质酶Ⅲ蛋白的多克隆抗体,研究了其在蜕皮周期中的表达。罗氏沼虾几丁质酶基因cDNA的开放阅读框为1 143 bp,编码380个氨基酸,大小为41.91 ku。通过氨基酸序列比对发现,MrChi3B与日本沼虾几丁质酶基因(Chi3B)的同源性最高,为94%。MrChi3B含有一个糖苷键水解酶家族18的催化域。实时定量PCR (qRT-PCR)和蛋白印迹法(WB)检测结果显示,MrChi3B在罗氏沼虾多个组织中均有表达,但是不同组织中的表达有差异。在蜕皮期之后,其在胃、表皮和肌肉中的表达量显著上升。在胃中其表达量在蜕皮间期达到最高;在表皮和肌肉中其表达量在蜕皮后期达到最高;肠中的表达量在蜕皮前期和蜕皮期有所上升;眼柄期的表达量在所有蜕皮期都偏低。本研究结果为进一步研究几丁质酶的功能提供参考依据。     

日本沼虾cytMnSOD和mtMnSOD基因全长cDNA克隆及表达

利用RACE技术从日本沼虾肝胰腺中克隆了cytMnSOD和mtMnSOD基因cDNA全长序列。cytMnSOD基因cDNA全长1 233 bp,开放阅读框为858 bp,编码286个氨基酸,N端含有60个氨基酸残基组成的延伸区;mtMnSOD基因cDNA全长1 113 bp,开放阅读框为654 bp,编码218个氨基酸,N端含有20个氨基酸残基组成的信号肽;cytMnSOD和mtMnSOD预测蛋白分子量及等电点分别为31.33、24.05 ku和5.62、7.12。日本沼虾cytMnSOD推导的氨基酸序列与其mtMnSOD的相似性为40%,二者均含有MnSOD的特征肽段(DVWEHAYY)、4个Mn2+结合位点和2个N-糖基化位点。Real-time PCR结果表明,cytMnSOD和mtMnSOD在日本沼虾肝胰腺、肌肉、血细胞、大颚器官、卵巢和鳃等组织均有表达,其中肝胰腺表达量最高;肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD基因的表达量在蜕皮间期最高,蜕皮后期和蜕皮前期较低。嗜水气单胞菌刺激后3 h,肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD的表达量显著增加,推测MnSOD是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。     

有机硒对汞致日本沼虾毒性的拮抗作用

研究了饲料中添加0.45 μg/g的富硒酵母对日本沼虾生长及对Hg2+毒性的拮抗作用,探明SOD作为Hg胁迫指标的可行性.选择体长2.6～3.0 cm、体质量0.30～0.40 g的日本沼虾,暂养于 60 cm×30 cm×45 cm的水族缸中,投喂含豆油、面粉、豆粉、玉米面、维生素预混物、无机盐预混物的配合饲料.结果表明,有机硒组的体长和体质量增长率均大于无硒对照组;有机硒组和无硒对照组中日本沼虾的SOD活力均随HgCl2质量浓度呈现峰值变化;说明饲料中添加适量有机硒可促进机体生长,提高机体SOD的活力,在一定程度上拮抗HgCl2所致的毒性.     

虾青素对日本沼虾血细胞密度及吞噬活力的影响

从雨生红球藻粉中提取虾青素,以60mg/kg的浓度添加到日本沼虾（Macrobrachium nipponemis）的配合饵料中,在实验室条件下饲养三周,研究虾青素对日本沼虾血淋巴密度及吞噬活力（吞噬百分比和吞噬指教）的影响。结果显示添加虾青素组的日本沼虾不论是血细胞密度还是吞噬活力都显著高于对照组,表明虾膏素可显著提高日本沼虾的免疫力。     

中华鳖对日本沼虾幼虾捕食作用的实验研究

以平均体重为(416.67±14.21)g的中华鳖(Trionyx sinensis)为捕食者,平均全长为(18.40±0.04)mm(A)、(27.77±0.07)mm(B)和(38.90±0.07)mm(C)三种规格的日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)幼虾为猎物,采用种间捕食作用研究方法,开展了中华鳖对日本沼虾的捕食选择性和功能反应的研究,以期为进一步优化虾鳖混养模式参数和提高日本沼虾养殖效益提供理论依据。结果表明:(1)中华鳖的捕食活动时段为18:00~6:00,主要集中于0:00~4:00,该时间段中华鳖对日本沼虾幼虾的捕食量占总捕食量的80%;(2)当日本沼虾幼虾密度为30尾/m~2时,中华鳖表现出对B规格的日本沼虾幼虾更具捕食选择倾向,当密度为60尾/m2和90尾/m2时,中华鳖则表现出对A规格的日本沼虾幼虾更具捕食选择倾向;(3)中华鳖对日本沼虾幼虾的捕食功能反应属Holling-Ⅱ型,中华鳖对A、B和C三种规格日本沼虾幼虾理论上最大日捕食量分别为169、75和70尾。     

KK-42对日本沼虾D3期头胸甲表皮结构的影响

为探讨KK-42缩短日本沼虾幼虾蜕皮周期的机制,实验采用组织学方法观察了幼虾头胸甲表皮结构,定量测定了肝胰腺N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)的活力。将体长(3.3±0.5)cm的日本沼虾随机分为两组,分别用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液(实验组)或不含KK-42的溶液(对照组)浸泡处理1 min之后,选取处于蜕皮前期D3期的日本沼虾,观察头胸甲表皮结构,测定肝胰腺NAGase活力。结果显示,KK-42处理后第1天,头胸甲外表皮厚度与对照组相比显著增长42.83%;第3天和第9天,内表皮的厚度同比提高70.72%、77.27%,整个头胸甲的厚度同比显著增厚。KK-42处理后第3天,上皮细胞的高度比对照组提高31.69%。KK-42处理后6、12和24 h,NAGase活力分别比相应的对照组升高42.53%、34.28%和18.36%。研究表明,KK-42处理可显著增加D3期日本沼虾头胸甲外骨骼的厚度,提高肝胰腺NAGase活力。     

日本沼虾五群体形态性状对体质量的通径分析

为筛选出影响日本沼虾体质量的主要形态性状,以便确定人工选育的理想测定指标,以太湖、鄱阳湖、白洋淀、微山湖及淀山湖的野生日本沼虾为研究对象,随机选取各群体90尾虾测定19个形态指标,采用简单相关分析和通径分析等多元回归分析方法分析各群体对体质量作用较为突出的形态性状,并进行聚类分析。通径分析结果显示,太湖群体体长、头胸甲宽、第二步足长、头胸甲高、尾扇长对体质量的通径系数达到极显著,逐步回归建立其对体质量的回归方程、回归截距及相应的回归系数分别为–9.878、0.075、0.314、0.011、0.320、0.222;鄱阳湖群体头胸甲长、尾扇长、尾节宽、头胸甲宽、头胸甲高、尾节高、体长性状对体质量的通径系数达到极显著,回归截距和相应的回归系数分别为–1.618、0.392、–0.280、0.703、0.524、–0.359、0.688、–0.061;白洋淀群体体长、头胸甲宽、第二步足长和尾扇长对体质量的通径系数达到极显著,其回归截距和相应的回归系数分别为–4.796、0.082、0.222、0.007、0.136;微山湖群体头胸甲长、腹节高、第二步足长、腹节宽对体质量的通径系数达到极显著,其回归截距和相应的回归系数分别为–7.644、0.248、0.329、0.025、0.301;淀山湖群体体长、第二步足长、头胸甲宽、尾节宽、腹节宽对体质量的通径系数达到极显著,其回归截距和相应的回归系数为–6.257、0.019、0.018、0.164、0.264、0.162。体长与头胸甲性状在不同群体中都对体质量的作用十分明显。聚类结果显示,地理位置越接近,形态上越相似。研究表明,各个地区被保留的性状与体质量的复相关系数为0.965、0.904、0.902、0.971、0.955,为影响各自群体体质量的主要自变量。     

我国五大湖日本沼虾线粒体COI基因部分片段序列比较

对我国五大湖日本沼虾100个野生个体的线粒体细胞色素氧化酶亚基I（COI）部分序列进行了测定和分析,经比对获得578bp核苷酸片段,发现49个变异位点,得到35个单倍型,包括7个共享单倍型,各群体都具有较好的单倍型多态性和核苷酸多态性,其中鄱阳湖群体遗传多样性相对最高。AMOVA分析表明,五群体间总遗传分化系数F_st＝0.31873 （P<0.05）, 群体间具有较高的遗传分化。MEGA3.1软件计算五群体的Kimura 2-paramter遗传距离,洞庭湖群体和巢湖群体之间的遗传距离最远为0.0191,巢湖群体和洪泽湖群体之间的遗传距离最近为0.0051。以同属胖掌沼虾（Macrobrachium inflatum）为外群分别构建了NJ和UPGMA系统树,结果显示洞庭湖和鄱阳湖为一族群,太湖、巢湖和洪泽湖为一族群。     

pH对日本沼虾存活及肝功能相关酶活性的影响

为揭示日本沼虾(Macrobrachium nipponense)对水体pH的适应性,分析了不同pH胁迫下日本沼虾在不同时段的存活率以及96 h后蜕壳率,免疫、肝功能相关酶活性的变化。结果显示,pH胁迫处理96 h时,不同pH处理组日本沼虾的存活率显著低于对照组,除pH 7.0组的蜕壳率与对照组差异不显著外,其余pH处理组蜕壳率显著高于对照组;暴露在弱酸性水(pH 6.0)、弱碱性水(pH 8.0)、碱性水(PH9.0)中的成活率不同,其中PH6.0组虾的成活率在36 h时显著低于PH8.0组,24 h时显著低于pH 9.0组;pH 5.0酸性处理组日本沼虾在试验期间存活率始终最低,上述结果表明日本沼虾对碱性水体的适应性强于酸性水体。比较不同pH值对日本沼虾肝功能相关酶活性的影响程度时发现,日本沼虾T-SOD、ACP、GOT、T-AOC酶的耐受pH生态幅较窄,AKP酶的耐受pH生态幅较宽。通过96 h的pH值与相关酶回归分析得出,日本沼虾的最适pH值范围为7.3~7.6。     

日本沼虾C型凝集素结构域家族3的cDNA克隆、原核表达和定位分析

C型凝集素(C-type lectin)是一类能与糖类结合的非抗体的蛋白质或糖蛋白家族,为了研究C型凝集素基因在日本沼虾组织分布、细胞定位和细菌感染过程中的表达情况,本研究应用cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了日本沼虾C型凝集素结构域家族3基因(MnLec3)的全长序列,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MnLec3基因在不同组织、细菌感染后不同时间的表达水平,Western blot和免疫荧光分别分析蛋白的表达水平和细胞定位。结果显示,MnLec3基因cDNA全长1 357 bp,包括125 bp的5′末端非翻译区(UTR)、1 026 bp的开放阅读框(ORF)和206 bp的3′UTR,其中开放阅读框编码341个氨基酸。氨基酸序列比对显示,日本沼虾MnLec3基因含有保守钙结合点(Met 1-Glu17)和糖识别结构域(CRD)。同源性分析结果显示,MnLec3与罗氏沼虾C型凝集素3相似度较高;邻接法(Neighbor-Joining,NJ)进化树分析结果显示,MnLec3与其他甲壳动物C型凝集素聚为一支。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白rMnLec3,并将纯化重组蛋白免疫大鼠获得抗血清,免疫荧光结果显示,绿色荧光信号主要在肝胰腺细胞核中表达。qRT-PCR结果显示,MnLec3在日本沼虾所检测组织中均表达,其中肝胰腺中表达量最高,血细胞次之;与对照组相比,在嗜水气单胞菌刺激12～48 h时MnLec3表达量显著升高,48 h表达量最高,Western blot分析结果显示,MnLec3蛋白表达丰度与基因表达模式基本相似,提示克隆得到的MnLec3参与日本沼虾抵御细菌入侵的免疫过程。     

日本沼虾血清淀粉样蛋白A(SAA)基因的克隆及其免疫功能

为探索血清淀粉样蛋白A(SAA)在日本沼虾免疫防御系统中的作用,实验利用RACE方法克隆了日本沼虾SAA(MnSAA)基因cDNA全长序列,采用实时荧光定量PCR(QPCR)分析其在日本沼虾不同组织、不同发育时期的表达情况,以及溶壁微球菌、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒(WSSV)感染后MnSAA在血淋巴细胞和肝胰腺中的表达情况,同时还利用RNA干扰(RNAi)技术检测了MnSAA基因沉默后,日本沼虾再感染嗜水气单胞菌后其肝胰腺中激活子蛋白-1(AP-1)和B类清道夫受体(CD36)基因表达变化及虾的累积死亡率变化。结果显示,MnSAA基因cDNA全长649 bp (GenBank登录号:MK292888),包含21 bp 5′非编码区,232 bp 3′非编码区,369 bp开放读码框,编码131个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,MnSAA蛋白属于急性期血清淀粉样蛋白A蛋白(A-SAA),在进化上与无脊椎动物香港牡蛎的亲缘关系最近;mRNA表达分析显示,MnSAA基因在日本沼虾的各组织和各生长阶段均有表达,分别在肝胰腺和成虾阶段中的表达量最高;病原体感染实验表明,在日...     

KK-42对蜕皮后期日本沼虾头胸甲超微结构的影响

为了深入探究KK-42对表皮结构的影响,本实验以外表皮形成趋于结束而内表皮开始出现的蜕皮后期幼虾为材料,通过扫描电镜观察石蜡切片法,分析了KK-42处理前后头胸甲外表皮,尤其是内表皮结构的变化。将处于蜕皮间期的健康幼虾[体长(3.5±0.1)cm]随机分为2组,分别用1.95×10-4 mol/L的KK-42溶液和不含KK-42的溶液处理,取蜕皮后1.5、3.0、6.0及12.0 h幼虾头胸甲,观察其超微结构。另取蜕皮后6.0 h头胸甲,用解剖刀轻轻刮去内面组织,通过扫描电镜观察内表皮的表面结构。结果显示,蜕皮后1.5和3.0 h,头胸甲只包含上表皮和外表皮,KK-42处理组外表皮的板层数量显著增加,外表皮厚度分别比相应对照组提高了72.07%和38.67%;蜕皮后6.0～12.0 h,外表皮中疏松的板层趋于致密,其厚度在二组间无统计学差异。蜕皮后6.0 h,只有1层板层的内表皮出现,到蜕皮后12.0 h,板层数增至2层(对照组)和3层(处理组),且板层结构均疏松。此外,内表皮表面分布着大小不等、头尾走向的梭形孔道(pore canals);KK-42处理组内表皮结构未见明显变化。实验...     

青虾冷休克蛋白Y-box编码基因的cDNA全长克隆与表达分析

为研究冷休克蛋白Y-box基因在青虾应答环境胁迫过程中所起的调控作用,实验应用RACE PCR技术首次克隆了青虾的冷休克蛋白Y-box基因全长c DNA序列,并利用在线软件对其序列特征进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR技术对其在青虾不同组织及环境胁迫过程中的表达变化特征进行分析。青虾冷休克蛋白Y-box基因c DNA全长1501 bp,包括84 bp的5′末端非翻译区(UTR),876 bp的开放阅读框(ORF),541 bp的3′UTR,开放阅读框编码291个氨基酸。氨基酸相似度比对显示,青虾冷休克蛋白Y-box基因富含高度保守的冷休克结构域。系统进化树分析显示,青虾冷休克蛋白Y-box基因与水蚤等节肢动物冷休克Y-box聚类一支,具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示,冷休克蛋白Y-box基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量在肝胰腺组织中最高,使用荧光定量PCR检测青虾冷休克蛋白Y-box基因在低温胁迫和恢复条件下在肝胰腺中的m RNA时空表达情况,结果显示,与对照组相比冷休克蛋白Y-box在肝胰腺中的表达量分别在低温和低氧胁迫3,6和12 h出现了显著上调,而在恢复刺激后其表达量与对照组差异不显著。此外,本实验对Y-box进行了原核表达,为进一步研究Y-box基因的功能奠定了基础。     

日本沼虾VASA蛋白的原核表达、抗体制备及其免疫鉴定

Vasa基因具有在性腺中特异表达的特点,在生殖细胞分化与发育过程中起重要作用。从日本沼虾精巢cDNA中克隆了vasa基因的阅读框,连接到pET-32a载体,构建重组表达质粒pET32a-vasa,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导融合表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约85 ku,表达量约占包涵体总蛋白的48.7%,Westernblotting检测表明,融合蛋白可特异地被anti-HIS标签抗体识别。用Ni²⁺-NTA纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备获得多克隆抗体,ELISA显示该抗体效价达1∶160 000,Western免疫鉴定显示该抗体不仅能识别融合蛋白,而且也能识别日本沼虾性腺粗提液中的内源性VASA蛋白,免疫组化进一步显示,VASA蛋白主要分布在卵母细胞核周围和精原细胞质中,成熟精子中无信号,暗示VASA在日本沼虾生殖细胞发育分化过程中扮演重要角色。     

不同水温与饲料磷水平对日本沼虾生产性能、组织及水体磷含量的影响

为探讨不同水温与饲料磷水平对日本沼虾生产性能、组织及水体磷含量的影响,实验采用3×3因子设计,设定3个水温梯度(20、25和30°C)和3个饲料磷水平(1.1%、1.5%和1.9%),共9组(分别命名为20/1.1、 20/1.5、 20/1.9、 25/1.1、 25/1.5、 25/1.9、30/1.1、30/1.5和30/1.9),每组4个重复。虾饲养于室内循环系统中,养殖期为8周。结果显示,从水温来看,30°C组的终末体质量、特定生长率和增重率均显著高于20°C组,但与25°C组间差异不显著,而摄食量和饵料系数的变化趋势与此相反。此外,30°C组的磷保留率显著高于其他2组,且该组血淋巴磷含量显著高于25°C组,而与20°C组无显著差异。从饲料磷水平来看,1.9%磷水平组的终末体质量、增重率和磷保留率显著低于其他2组,而磷摄入量与饵料系数的变化趋势与之相反。1.9%磷水平组的特定生长率显著低于1.5%磷水平组,但与1.1%磷水平组差异不显著。此外,1.1%磷水平组全虾磷含量显著低于其他2组,且该组的血淋巴钙含量显著高于1.9%磷水平组,而与1.5%磷水平组无显著差异;1.5%磷水平组血清碱性磷酸酶活性显著高于1.1%磷水平组,但与1.9%磷水平组间无显著差异。水温和饲料磷水平之间的交互作用显著影响摄食量、磷摄入量、磷保留率、血淋巴磷含量及碱性磷酸酶活性,峰值分别发现于20/1.1、25/1.9和30/1.9、30/1.1、30/1.9及25/1.5组。另外,水体磷含量随时间延长显著升高,而20/1.5组水体磷含量极显著高于25/1.1组和30/1.1组。研究表明,当水温为30°C而饲料磷水平为1.1%时,日本沼虾的生长性能及饲料效率最优,同时其对水体中磷的排放量也较低。