桃树苹果花叶病(APMV)的RT-PCR检测

本试验比较了4种桃叶片RNA提取方法,建立了RT-PCR桃苹果花叶病检测体系.结果表明:凯基TRIzol试剂法简便快捷,提取的RNA质量较好,可用于RT-PCR.RT-PCR最适反应体系为MgCl2 1.5 mmol/L,引物0.5 μmol/L,模板1.0 μg/50 μl,退火温度为43.5 ℃.采集桃主产区北京、陕西、山东、河北、河南、新疆以及江苏的徐州、无锡、南京等地带叶芽的桃枝样品作为试材,利用RT-CR进行苹果花叶病检测.结果显示,在河北重阳红、山东春雪、无锡朝晖、新疆2号、新疆3号、新疆5号、徐州朝晖发现苹果花叶病毒(APMV).     

南方水稻黑条矮缩病毒的新的自然寄主

2010年,由南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)引起的新水稻矮缩病在湖南省大面积爆发.为确定南方水稻黑条矮缩病毒的自然寄主范围,采集湖南省永州零陵、邵阳隆回、郴州宜章等地发病田块及附近的禾本科作物及杂草,提取RNA后,用自行设计的专利引物对,对其进行RT-PCR检测,发现高粱、野燕麦、牛筋草是新的SRBSDV自然寄主.     

半矮生桃基因组DNA的提取及SSR-PCR反应体系的优化

为获得高纯度高质量的DNA和建立稳定的SSR-PCR反应体系,采用常规CTAB法和改进CTAB法提取半矮生桃基因组DNA。结果表明:改良CTAB法提取的DNA纯度高,多糖和蛋白质含量低,可用于SSR反应。同时,通过对影响SSR反应的6个要素设计正交试验,确定了最优的SSR-PCR反应体系,20μL反应体系为:25 mmol/LMg2+1.5μL、2.5 mmol/L dNTPs 2μL、5 U的Taq酶0.22μL、10×Buffer缓冲液4μL、10 mmol/L引物0.6μL、20 ng模板0.8μL,优化的退火温度为57.6℃。     

南芥菜花叶病毒分子生物学快速检测方法的研究

根据南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic Nepovirus)CP基因序列,设计并合成了特异性RT-PCR检测引物,对南芥菜花叶病毒和非南芥菜花叶病毒的感病植物组织进行了PCR扩增反应。结果,南芥菜花叶病毒的感病植物组织的PCR产物均出现364bp的特异性扩增条带,而非南芥菜花叶病毒均未出现扩增条带,证明这对引物具有南芥菜花叶病毒鉴定特异性。将提取的南芥菜花叶病毒总RNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果表明,此体系最低可检出南芥菜花叶病毒提取的RNA模板浓度为150pg/μL。     

2种水稻矮缩病毒一步检测方法的建立

水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)是引起水稻矮缩病的2种主要病毒,这2种病毒病在田间危害症状较相似,难以准确鉴定。为建立这2种病毒的一步快速检测方法,从混合引物配比、退火温度2个方面优化了反应体系与反应程序,并用这2类病毒的总RNA进行了RT-PCR验证,最终建立了准确、灵敏、快速的一步检测方法。利用建立的方法对从江西省大余县和南昌县采集的水稻矮缩病毒叶片样品进行检测。结果表明:大余县10份样品均为南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV),检出率为100%;南昌县10份样品中有7份样品检出南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV),检出率为70%,另外3份样品检出水稻黑条矮缩病毒(RBSDV),检出率为30%。     

不同提取方法对检测单头白背飞虱携带SRBSDV灵敏度的影响

为找到较好的白背飞虱RNA提取方法用于大规模带毒率检测、SRBSDV的早期监测及科学防控提供参考,采用Trizol试剂盒法、改良Trizol法、改良CTAB-LiCl法、改良异硫氰酸胍法和NaOH粗提法5种方法提取单头白背飞虱的总RNA,进行检测比较其提取速率和稳定性。结果表明:采用Trizol试剂盒法、改良Trizol法、改良CTAB-LiCl法、改良异硫氰酸胍法和NaOH粗提法5种方法提取单头白背飞虱的总RNA浓度分别为113.08ng/μL、222.43ng/μL、57.68ng/μL、102.16ng/μL和31.06ng/μL,改良Trizol法和改良CTAB-LiCl法提取的RNA纯度较高。5种方法提取的RNA均能用于SRBSDV的检测,其中改良Trizol法RT-PCR扩增的灵敏度最高,稀释梯度为10-4,NaOH粗提法灵敏度最差,稀释梯度仅为10-1,其余3种均能达到10-3。改良Trizol法提取的虫体RNA较完整且扩增效果稳定,但试剂价格较昂贵,不适合做大量样品提取;NaOH粗提法的灵敏度虽相对较低,但由于操作简便,经济快速,更适合用于大量样品的检测。     

李矮缩病毒RT-PCR方法建立及检测应用

 以感病和健康指示植物GF305的总RNA为模板，进行cDNA的合成和PCR 扩增，结果从感病材料中扩增出与预期的172 bp大小一致的目的片段，而健康的材料无此扩增产物。对此PCR 扩增产物克隆测序，进一步佐证了RT-PCR检测结果。经过多次试验验证该检测体系，都可得到很好的重演性，从而建立了李矮缩病毒快速、灵敏、准确的RT-PCR检测技术，并进行了实际应用。     

桃SRAP-PCR反应体系建立及与半矮生型相关标记的研究

试验采用常规CTAB法提取了桃叶片基因组DNA,并以半矮生型桃基因组DNA为模板,通过对影响扩增结果的Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶浓度及引物浓度的梯度试验,对桃SRAP-PCR反应体系进行了优化.结果表明:桃SRAP-PCR的最佳反应体系为DNA模板25～30ng,10×Buffer2μL,Mg2+浓度2.5mmol·L-1,dNTP浓度0.25mmol·L-1,Taq酶1.1U,引物浓度0.3μmol·L-1.通过BSA法建立半矮生型和普通型基因池,从266对SRAP引物中筛选出21对与桃半矮生性状相关的SRAP标记,并通过对18个个体的扩增检测,发现了1个与半矮生性状相关的标记.     

萝卜DDRT-PCR技术体系的优化

【目的】探索快速高效的RNA提取方法,建立高效率的mRNA差异显示体系。【方法】以萝卜幼嫩薹叶及花蕾为材料,比较了酸性酚-异硫氰酸胍-氯仿提取法(异硫氰酸胍法)与BIOZOL试剂法提取RNA的效果,并对DDRT-PCR体系中Taq酶、Mg2+、dNTPs、引物及cDNA用量进行了优化。【结果】BIOZOL试剂提取的RNA量大质好,经纯化后,其OD260/OD280值为1.8~2.1,表明杂质少,质量浓度大于1μg/μL,符合mRNA差异显示的要求;确定的最佳DDRT-PCR反应体系(20μL)为:10×Buffer 2.5 mmol/L,Mg2+2.8 mmol/L,dNTPs 0.25 mmol/L,Taq酶1.5 U,锚定引物2.5μmol/L,随机引物1.25μmol/L,cDNA用量0.5μL。mRNA差异显示结果表明,高分辨率的片断为100~1 000 bp。经验证,该体系也适用于大白菜和油菜mRNA差异显示研究。【结论】通过两种RNA提取方法比较和DDRT-PCR体系优化,获得了萝卜最佳RNA提取方法及mRNA差异显示反应体系。     

应用复合RT-PCR同时检测烟草环斑病毒和番茄环斑病毒

将烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus)和番茄环斑病毒(Tom ato ringspot virus)的CP基因及RNA2基因序列引物,合成特异性RT-PCR检测引物,对烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的感病植物组织进行了PCR扩增反应,结果显示,感染了烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的植物组织的PCR产物均出现600 bp和470 bp特异性扩增条带,而其他病毒均未出现扩增条带,证明这两对引物具有烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的鉴定特异性。将提取的烟草环斑病毒和番茄环斑病毒总RNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果显示,此体系最低可检出烟草环斑病毒和番茄环斑病毒提取的RNA模板浓度为234 pg/μl和264 pg/μl。表明,复合RT-PCR是一种可同时检测烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的快速检测方法。     

改良CTAB法提取成熟肥城桃果实的总RNA

为了从成熟的肥城桃果实中提取纯净完整的RNA,本试验在原CTAB法的基础上进行了改进,并对RNA的完整性、产率和纯度等方面进行评价。结果表明,采用改良CTAB法所得RNA完整性好,条带清晰,无明显降解,28S和18S rRNA的亮度比约为2：1,A260／A280达1．89,且产率较高,为356．21ug/g,经RT—PCR后得到一特异条带,表明该RNA可用于后续分子生物学操作。     

果树果实总RNA提取方法的改良研究

植物总RNA的提取尽管已成为一种常规的技术,但由于果树果实材料的特殊性,其RNA的提取至今没有一种比较理想的技术和方法。本研究在以往CTAB方法的基础上,对其进行改良以探讨一种适于果实总RNA提取的通用方法,从而为果实分子生物学研究奠定基础。研究结果表明,在提取缓冲液中加入PVP和β-巯基乙醇,使其终浓度分别为16%和3%,在匀浆上清液中加入1/3体积5 mol/L KAC(pH4.8),可有效地提高RNA提取的质量。利用改良后的CTAB法成功地从苹果、桃、草莓和葡萄果实中提取出总RNA。经过紫外、电泳、反转录分析结果表明,该改良的CTAB法是一种适合果实总RNA提取的首选方法。     

红肉桃果实总RNA提取方法的研究

以红肉桃果实为材料,采用Unizol总RNA提取试剂盒、CTAB法、冷酚法和改良SDS法4种方法分别提取果皮和果肉中总RNA,以期获得提取红肉桃果肉中总RNA的最适方法。比较,发现改良后的SDS法更适合于红肉桃果实总RNA的提取。此方法所得RNA完整性好,纯度和浓度均较高,可用于RT-PCR分析研究及后续实验。     

基于能值与生命周期评价耦合模型的农业系统生态效率评估——以北京市郊区为例

结合能值分析和生命周期评价模型,从期望产出效率和非期望产出效率两个角度构建生态效率计量方法,评价京郊3种典型农作物生产系统的可持续性,为北京市农业内部结构优化提供科学的决策依据。研究表明:玉米、蔬菜和桃的能值投入产出比分别是6.61×10~4、1.47×10~5、1.92×10~5sej·J~(-1),玉米的期望产出效率最高,蔬菜其次,桃最低;玉米、蔬菜和桃生产系统的非期望产出效率分别是1.29×10~6、1.60×10~5和2.59×10~5,玉米的非期望产出效率最高,桃其次,蔬菜最低;玉米的生态效率最高,为2.95×10~(-4),蔬菜其次,为7.42×10~(-6),桃最低,为7.05×10~(-6);以蔬菜为例进行敏感性分析表明,投入要素中对生态效率敏感性最大的是电能(用于农田灌溉),氮肥次之,再次是有机堆肥和农药。调整种植业结构不仅要考虑农产品的产量及经济收益,还需要考虑生态效率。有机肥替代化肥能够显著提高农作物生产系统的生态效率,但要注意有机肥中重金属含量对人体健康的影响。总之,发展节水型粮食作物种植、加强农业节水和提高有机肥比例是改善北京市农田生态系统生态效率的重要措施。     

虫瘟霉属真菌中国一新纪录种--西虫瘟霉的分离和鉴定

从福建省邵武市的桃蚜上分离出1株病原真菌,通过形态学鉴定为西虫瘟霉Zoophthora occidentalis。其初生分生孢子长椭圆形,有明显的孢领,大小为（23.4～31.2）μm×（7.8～10.9）μm,L/D＝2.4～3.8。次生分生孢子与初生分生孢子同形,大小为（15.6～25.4）μm×（7.8～10.4）μm,L/D＝2.46～4.08。毛管孢子大小为（20.8～29.9）μm×（6.0～10.4）μm,L/D＝2.4～3.6,柄长36.4～104.0μm。菌丝直径6.5～8.8μm。休眠孢子表面光滑,无色透明,直径23.9～29.9μm。用“孢子浴”方法将该菌对桃蚜接种,结果显示接种后第4d为死亡高峰期,最终累计死亡率5.4％～95.7％,因剂量而异。经时间-剂量-死亡率模型分析,测得接种4d后LD50低于10个孢子·mm-2,表明该菌株对桃蚜具有较强的毒力。     

光皮桦木质部cDNA-AFLP 技术体系的建立及应用

为了挖掘光皮桦材性相关基因,本研究以光皮桦木质部为材料,通过对RNA 的提取、cDNA 的反转录及纯化 的对比分析,以及选扩体系优化等,建立了相应的cDNA-AFLP 体系。结果表明:采用CTAB 和RNAiso 试剂相结合 的方法得到的RNA 质量较好,cDNA 经纯化后选扩效果明显变好。选扩体系为:4.0 μL 预扩产物(稀释40 倍)、1.6 μL 的引物(10.0 mmol/ L)、0.2 μL 的dNTP(2.5 mmol/ L)、0.4 μL 的Mg2 + (25.0 mmol/ L),以及0.2 μL 的Taq DNA 聚合酶(5 U/ μL)。进一步以来自不同木质化茎段的cDNA 为模板,筛选出31 对扩增效果较好的引物组合,同时分 离出一些差异表达的基因片段,经测序后探讨了其在木质化发育过程中可能的功能。      

利用正交设计优化桃SRAP-PCR反应体系

以桃基因组DNA为模板,通过正交试验设计,从Mg2+、Taq酶、dNTP、引物、模板5种因素4个水平对桃SRAP反应体系进行优化,建立了适合于桃的SRAP-PCR优化反应体系,该25μL反应体系:模板DNA50 ng,MgCl22.5 mmol/L,dNTP200μmol/L,上下引物各0.4μmol/L,Taq DNA聚合酶1.5 U,以灭菌双蒸水补齐至25μL。PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1 min,5个循环;94℃变性1 min,50℃复性1 min,72℃延伸1 min,35个循环,72℃延伸10 min。     

蟠桃磷脂酶D基因RNAi表达载体构建

[目的]构建蟠桃磷脂酶D基因的RNAi表达载体.[方法]以英格尔蟠桃为材料,将CTAB改良法提取的蟠桃总RNA反转录成cDNA作为模板,通过RT - PCR扩增约347 bp的保守片段,将目标片段插入到pSK - int中间表达载体中,获得pSK - PLD - RNAi中间表达载体,然后将其转入植物双元表达载体pCAMBI1301中,构建该基因的shRNAi表达载体pCAMBIA - PLD - RNAi.[结果]经限制性内切酶酶切和测序鉴定证明蟠桃磷脂酶D基因的RNAi表达载体pCAMBIA - PLD - RNAi已构建成功.[结论]蟠桃磷脂酶D基因的RNAi表达载体的构建为进一步通过RNAi技术延长蟠桃果实的贮藏寿命奠定了基础.     

鼻气管炎鸟疫杆菌株的分离鉴定及最低抑菌浓度测定

为测定鼻气管炎鸟疫杆菌对不同药物的敏感程度,本试验从北京、吉林、河北、内蒙和山东地区患严重气囊炎病鸡的肺脏以及辽宁肉种鸡蛋黄中成功分离到了6株鼻气管炎鸟疫杆菌（Ornithobacterium rhinotracheale,ORT）,并通过染色镜检、生化试验和PCR法对其进行了鉴定。随后选择山东分离株在培养基上繁殖,经腹腔注射接种21日龄SPF鸡,接种后出现典型的肺炎和气囊炎,并测定其半数致死量。在此基础上,采用微量测定法测定6个临床分离菌株和3个对照菌株对12种药物的最小抑菌浓度（MIC）。9株ORT对于莫西沙星、甲磺酸加替沙星和乳酸环丙沙星比较敏感,MIC值为0.49～31.25μg/mL;临床广泛使用的盐酸强力霉素MIC测定值变化较大,分布在1.90～125μg/mL;除北京株和吉林株外,其他7株ORT对利福平比较敏感,MIC值为3.91～15.6μg/mL;分离株对于氟苯尼考、四环素、金霉素、磺胺间甲氧嘧啶、磷霉素钠和头孢噻肟钠不敏感,部分菌株的MIC值已经超过1 000μg/mL。     

李果实高质量RNA提取方法的比较和优化

李果实富含酚类和多糖,成熟李果实的总酚和总糖含量分别可达140.28μg/g和80.75mg/g,因此常规方法不能有效提取其RNA以进行分子生物学研究。比较了改良的异硫氰酸胍法、改良的Trizol法、改良的CTAB法和高氯酸盐法提取李果实RNA的效果,结果表明高氯酸盐法效果较好。根据李果实材料的特点,进一步优化了高氯酸盐法,包括用0.1mol/LTris-硼酸缓冲液(pH7.4)取代0.3mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.3);提取缓冲液中β-巯基乙醇的浓度由1%提高到2%,可溶性PVP的浓度由8.5%降低至1%;联合使用10%乙醇和醋酸钾以除去多糖;用12000×g离心替代使用填充有玻璃丝的Centriflo柱实现分离提取缓冲液中杂质的目的等。在230、260和280nm下测定所提取RNA的吸光值,并用提取的RNA反转录后扩增β-actin基因片段验证RNA的质量,结果表明:用优化了的高氯酸盐法提取李果实的RNA完整性好,杂质少,得率较高,适用于RT-PCR等后续实验,并且也适合提取其他富含酚类物质或多糖果实的RNA。