番鸭细小病毒国内分离株主要结构蛋白基因的克隆和序列分析术

摘 根据国外已发表的番鸭细小病毒（MDPV）FM株基因组核苷酸序列设计1对引物，应用PCK技术扩增MDPVFS株的VP2-VP3蛋白基因片段。将扩增后的VP2-VP3结构蛋白基因克隆到T载体上，MDPVFS株基因大小为1764bp，编码528个氨基酸，对插入片段进行序列测定。结果表明，我国分离的MDPVFS株基因序列与国外发表序列的同源性为98．6％，与已发表的YZ株同源性为99．5％，可见番鸭细小病毒结构蛋白基因较保守。     

番鸭细小病毒国内分离株主要结构蛋白基因的克隆和序列分析

根据国外已发表的番鸭细小病毒 (MPV) FM株基因组核苷酸序列 ,设计了 1对引物 ,分别对国内 2株番鸭细小病毒分离株 MPV扬州 (YZ)株和 MPV佛山 (FS)株主要结构蛋白 (VP2和 VP3)基因进行 PCR扩增 ,并克隆到p CR3.1T载体 ,经酶切鉴定筛选出阳性克隆质粒并进行核苷酸序列分析比较。结果表明 ,MPV YZ和 MPV FS的VP2 - VP3基因大小均为 176 4bp,编码 5 88个氨基酸。 MPV YZ、MPV FS与 MPV FM核苷酸序列同源性分别为98.5 %和 98.6 % ,氨基酸序列同源性为 97.1%和 97.8% ;MPV YZ与 MPV FS核苷酸序列的同源性为 99.5 % ,氨基酸序列同源性为 98.8%。     

番鸭细小病毒安徽分离株结构蛋白基因的克隆及序列分析

为研究番鸭细小病毒(MDPV)安徽分离株的遗传变异特征,通过PCR扩增获得了MDPV结构蛋白(VP)基因全长序列AH-MDPV-VP,并将该序列与GenBank中登录的12条MDPV和鹅细小病毒(GPV)VP基因序列进行比对。结果显示,AH-MDPV-VP基因全长2 199bp,包括完整的VP1、VP2和VP3蛋白编码区。MDPV与GPV的VP基因部分序列一致,但具有明显的差异。进化分析显示,MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH为同一分支,亲缘关系较近。同源性分析显示二者核苷酸序列同源性最高,为99.9%,且AH-MDPV-VP与GPV毒株SHFX1201的序列同源性也有89.5%。此外安徽分离株与其他MDPV的VP1、VP2和VP3基因同源性有逐步下降的趋势,而与GPV则相反呈上升趋势。进一步显示MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH相似,可能为MDPV和GPV基因重组型水禽细小病毒。     

番鸭细小病毒MDPV YZ株VP2和VP3蛋白基因的克隆和序列测定

根据国外已发表的番鸭细小病毒（MDPV）FM株基因组核苷酸序列设计了1对引物，应用PCR技术扩增了MDPV YZ株的VP2和VP3蛋白基因片段。将扩增后的VP2和VP3蛋白基因克隆到pCR3.1T载体上，MDPV YZ株基因大小为1764bp，编码528个氨基酸，并对播入片段进行序列测定。测定结果表明，我国分离的MDPV YZ株蛋白基因序列与国外发表的序列的同源性为98.5%。     

鹅细小病毒国内分离株主要结构蛋白（VP2-VP3）基因的克隆和序列分析

根据国外已发表的鹅细小病毒（GPV）A株基因组核苷酸序列设计了一对引物,对国内两株鹅细小病毒毒株(GPV　CC株)和(GPV　FS株)主要结构蛋白（VP2-VP3）基因进行PCR扩增，并克隆到pCR3.1T载体，分别获得正向、反向连接重组质粒pVPC1、pVPC2和pVPF1、pVPF2，经酶切鉴定筛选出阳性克隆质粒并进行核苷酸序列分析比较，序列分析结果表明：GPV　CC株和GPV　FS株VP2-VP3的核苷酸大小分别为1　764　bp和1　763　bp,其中GPV　CC株与A株同源性达到98.9%；GPV　FS株缺失一个碱基,与A株同源性为93.5%,与GPV　CC株同源性为93%。     

番鸭细小病毒浙江分离株VP基因的克隆与序列分析

为明确番鸭细小病毒结构蛋白VP的特征,本研究运用PCR从已分离鉴定的番鸭细小病毒浙江分离株(MDPV-ZJ)中分段扩增出VP基因,并对其进行克隆测序和分析。结果表明,番鸭细小病毒浙江分离株VP基因全长为2 199 bp,编码732个氨基酸。所编码的包膜蛋白大小为81.32 ku、理论等电点为6.59、不稳定系数为37.49、亲水性平均系数为－0.667,属于亲水性稳定类蛋白,该编码的结构蛋白没有信号肽,为非分泌蛋白。根据VP基因特征从遗传进化上可将MDPV分为2个大的基因型:经典型和基因重组型,经典型MDPV可以进一步划分为台湾亚群、大陆亚群和欧洲群,MDPV各分离株在遗传进化上存在明显的地域性。本试验中MDPV浙江分离株株处于MDPV大陆亚群。     

番鸭细小病毒XX株VP2基因的克隆和序列分析

根据国内外已发表的番鸭细小病毒(MDPV)FM株和GD株基因序列,应用DNAstar分子生物学软件设计1对引物,应用PCR技术扩增MDPV XX株的结构蛋白基因VP2全基因片段。将扩增得到的VP2全基因克隆到PGEM-T easy载体上,经菌液PCR鉴定后的重组子进行序列测定。结果表明,MDPV XX株基因大小为1764bp,编码587个氨基酸,其基因序列与国内外发表的FM株、GD株核苷酸序列同源性分别为98.4%和99.8%,而与同属的小鹅瘟病毒B株核苷酸同源性仅为78.2%。可见编码番鸭细小病毒结构蛋白的VP2基因较保守,且和同属的小鹅瘟病毒明显不同,这也是该病毒目前只有一个血清型的分子基础。     

番鸭细小病毒和鹅细小病毒广东株VP1基因的克隆与序列分析

参考GenBank中的MDPV FM株和GPV B株全基因序列,设计并合成一对引物,分别对MDPV GD株和GPV GD株的结构蛋白基因(VP1)进行PCR扩增,并克隆到pMD18-T载体,筛选到重组质粒并测序.通过对MDPV GD株和GPVGD株的VP1基因的核苷酸序列分析,这两种病毒VP1基因大小均为2 199 bp,核苷酸序列同源性为87%,而位于VP1基因上的VP2至VP3基因起始密码子之间的核苷酸序列的差异较大,同源性仅为64%.另外对MDPV GD株和GPV GD株与各地方毒株的VP1和VP3基因核苷酸序列的同源性比较,显示它们之间差异较小.     

鹅细小病毒国内分离株主要结构蛋白（VP2—VP3）基因的克隆和序列分析

根据国外已发表的鹅细小病毒（GPV）A株基因组核苷酸序列设计了一对引物，对国内两株鹅细小病毒毒株（GPV CC株）和（GPV FS株）主要结构蛋白（VP2－VP3）基因进行PCR扩增，并克隆到pCR3.1T载体,分别获得正向，反向连接重组持粒PVPC1，PVPC2和PVPF1，PVPF2，经酶切鉴定选出阳性克隆质粒并进行核苷酸序列分析比较，序列分析结果表明：GPV CC株和GPV FS株VP2－VP3的核苷酸大小分别为1764bp和1763bp，其中GPV CC株与A株同源性达到98．9％，GPV FS株缺失一个碱基，与A株同源性为93．5％，与GPV CC株同源性为93％。     

番鸭细小病毒NS2基因的克隆和序列分析

本研究参考GenBank发表的MDPVFM株全基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR技术扩增出MDPVS1株NS2基因,目的片段长约1.3 kb,将目的片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析,结果表明,MDPVS1株NS2基因全长1357 bp,编码451个氨基酸,与国外已发表的MDPVFM株相比核苷酸序列同源性为99.26%,推导氨基酸序列同源性为98.23%。     

番鸭细小病毒ＭＤＰＶ—Ｑ株ＶＰ２蛋白基因的克隆与序列测定

根据genebank中番鸭细小病毒（ＭＤＰＶ）的基因序列，设计了一种引物ＬＨＭＰ７／ＬＨＭＰ８，同时在这２条引物中分别加入２种限制性核酸内切酶SacⅡ和KpnⅠ的酶切位点，使扩增后的ＤＮＡ片段的两端，分别含有这２种酶的酶切位点。应用ＰＣＲ技术扩增了ＭＤＰＶ－株的ＶＰ２蛋白基因片段。将扩增后的ＶＰ２蛋白基因重组到pMD18-T质粒载体上，并插入片段进行序列测定，测定结果表明，我国分离的ＭＤＰＶ－Ｑ株基ＶＰ２蛋白基因序列与国外分离株的同源性达９７．９％。     

番鸭细小病毒和鹅细小病毒生化及基因组特性的比较

番鸭细小病毒莆田株（MPV-P）和鹅细小病毒莆田株（GPV-P）分别感染的番鸭胚尿囊液经氯仿处理、PEG沉淀和Sepharose4B柱纯化。纯化样品在电镜下观察，均见到实心和空心2种病毒粒子。病毒粒子呈圆形，立体对称，无囊膜，直径为20-24nm。经SDS-PAGE分析，MPV和GPV均呈现3条结构蛋白带。MPV结构蛋白的相对分子质量约为VP1 89000、VP2 78000和VP3 61000，其中VP3为主要结构蛋白。GPV要相对分子质量与MPV有微小差别。MPV和GPV核酸均为单链DNA，长度约为51000bp。分别以MPV核酸和GPV核酸为模板，加到无引物的DNA聚合酶Ⅰ大片段合成体系中，合成产物经1%琼脂糖凝胶电泳，均可见长度约为5600bp的双链DNA带，证明MPV和GPV核酸的3'末端具有发夹结构。对这2种病毒核酸及经Klenow合成的双链核酸进行限制性内切酶分析，两者的酶切结果明显不同，表明MPV和GPV核酸在一级结构上存在明显差异。以上结果证明，MPV和GPV不但在致病性上有显著养异，而且在核酸结构上也有明显差异。     

番鸭源新城疫病毒F蛋白基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术对番鸭源新城疫病毒FP1/02株的F蛋白基因进行分段扩增、定向克隆到pMD 18-T Simple Vector质粒载体，然后制定其核苷酸序列，拼接出F基因全序列．并推导出其相应的氨基酸序列。FP1／02株的F蛋白基因全长1690bp．编码553个氨基酸，其裂解位点的氨基酸序列为^112R-R-Q-K-R-F^112．具有强毒蛛特有的氨基酸序列结构特征。核苷酸序列分析结果表明，FP1／02株与其他不同源新城疫病毒毒株之间的核苷酸序列同源性为87.2%～93.3%.     

Cloning and Sequence Analysis of VP gene of Muscovy Duck Parvovirus Zhejiang Isolate

In order to enrich the biological characteristics of VP gene from Muscovy duck parvovirus Zhejiang isolate (MDPV-ZJ),the target VP gene fragments were amplified by PCR method with specific primers,then the obtained PCR products were cloned and sequenced.The bioinformatics analysis of VP gene of MDPV-ZJ was conducted.The results revealed that MDPV-ZJ VP gene was 2 199 bp in length,coding an open reading frame (ORF) with 732 amino acids.The molecular weight,theoretical isoelectric point,instability index and grand average of hydropathicity of MDPV-ZJ VP gene were 81.32 ku,6.59,37.49 and －0.667,respectively,and with no signal peptide.The genetic evdution ary tree based on the VP gene showed that the MDPV isoaltes contains two groups:The typical MDPV and recombinant MDPV; Also,the typical MDPV could be divided into three branches:Taiwanese branch,Maniland China branch and Euro branch,which existed obvious regional genetic evolution relationship.In this assay MDPV-ZJ was belonged to MDPV Maniland China branch.     

猪细小病毒结构蛋白VP2主要抗原表位区基因的克隆及原核表达

本文参照GenBank发表的猪细小病毒结构蛋白VP2基因序列,设计一对引物,通过PCR方法扩增出一段包含VP2主要抗原表位编码区的片段,产物克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32(a)的T7启动子下游,构建的重组质粒pET-VP2经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子量为39.1KDa,主要以包涵体形式存在。BandScan分析,表达量约占菌体蛋白的65.2%。表达产物用His亲和层析柱纯化。Western blotting结果显示,该种蛋白能与阳性血清发生特异性反应。结果说明,该重组蛋白具有抗原性,可以作为鉴别诊断用抗原。