基于间歇浸没式生物反应器的荔浦芋组培快繁体系优化

[目的]优化基于间歇浸没式生物反应器系统(TIBs)的荔浦芋组培快繁体系,为荔浦芋脱毒组培苗的工厂化、自动化生产提供技术支持.[方法]以荔浦芋新品种桂芋2号茎尖分生组织脱毒诱导获得的不定芽为外植体,利用TIBs培养系统筛选出适合组培苗增殖及生根的最佳激素组合,并分析不同继代材料、接种密度及浸没间歇频率对组培苗增殖和生根效果的影响.[结果]利用TIBs培养系统可有效提高荔浦芋组培苗的增殖效果,增殖倍数达28.96倍,约是传统固体培养方法(2.87倍)的10倍,且组培苗的株高和生根数均极显著高于传统固体培养植株(P<0.01).在TIBs培养系统中,含4.00 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+0.05 mg/L萘乙酸(NAA)的培养基最适合荔浦芋组培苗增殖和生长,其组培苗增殖倍数为32.04倍.当接种材料为第4代荔浦芋继代材料、接种密度为10株/L、浸没间歇频率为5 min/6 h时,最有利于组培苗增殖和生长,增殖倍数均在30.00倍以上,可缩短萌芽时间,组培苗长势良好,且培养基污染率为0.[结论]利用TIBs培养系统对荔浦芋继代材料进行高效快繁具有可行性,可为实现及推动荔浦芋健康种苗繁育的工厂化生产提供技术支持.     

嵌合猪圆环病毒的构建

[目的]为了构建猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)的嵌合病毒,并为PCV2疫苗研究奠定基础.[方法]以PCV1基因组为骨架,将其衣壳基因替换为PCV2衣壳基因,来构建嵌合猪圆环病毒(PCV1-2)DNA克隆,将PCV1-2 DNA克隆转染PK-15细胞以获得拯救病毒PCV1-2,并测定PCV1-2在PK-15细胞中的增殖特性.[结果]酶切和序列测定显示成功构建出PCV1-2 DNA克隆;免疫荧光试验和PCR检测显示成功获得拯救病毒PCV1-2,其效价达到1060 TCIDs0/mL以上;一步生长曲线显示PCV1-2在PK-15细胞中的增殖特性与其亲本病毒近似.[结论]成功构建了1种具有较高体外增殖能力的嵌合猪圆环病毒.     

蚕丝及Ⅱ型胶原凝胶支架负载软骨细胞构建组织工程类软骨

观察软骨细胞在蚕丝及胶原凝胶2种支架上生长状态,为软骨组织工程支架选择提供依据。将体外第2代兔关节软骨细胞接种于蚕丝和Ⅱ型胶原凝胶,倒置显微镜下观察软骨细胞在支架内的生长增殖状况,并对细胞-支架复合物进行组织切片观察。结果显示,经胶原包被后的蚕丝对软骨细胞表现出良好的吸附作用,并有利于软骨细胞的生长增殖。在培养初期,蚕丝内细胞生长增殖较胶原凝胶内的慢,但随后随着胶原支架的缀陵降解细胞增殖速度减慢,而蚕丝上的细胞数量仍在增加。该研究表明软骨细胞在蚕丝和胶原凝胶两种支架上都能维持正常生长状态,但蚕丝作戈、软骨组织工程支架在长期效果优于胶原凝胶。     

微生态制剂对锦鲤生长及水质的影响研究

[目的]探讨微生态制剂对锦鲤生长及水质的影响.[方法]以锦鲤为试验对象,通过在饲料和水体中添加微生态制剂,研究其对锦鲤生长及水质的影响.[结果]微生态制剂对锦鲤的生长具有促进作用,最佳添加量为6％.试验组水体pH、氨氮含量、亚硝酸盐含量均低于对照组.[结论]复合微生态制剂在水产养殖业中有着广阔的应用前景.     

L-β-苯基乳酸对小麦幼苗生长及生理的影响

[目的]探究L-β-苯基乳酸(LPA)在小麦幼苗生长中的调控作用及其适宜浓度水平,为LPA应用于小麦及其他作物生产提供参考依据.[方法]以小麦品种扬麦16为试验材料,以未添加LPA的1%MS营养液为对照组(CK),添加不同浓度LPA(10.0、100.0和1000.0mg/L)的1%MS营养液为处理组,采用基质培养试验培养小麦幼苗,在培养的第7和14d分别测定幼苗的株高和根长,叶片的叶绿素、可溶性总糖和可溶性蛋白含量及过氧化物酶(POD)和吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性等生理指标.[结果]与CK相比,添加不同浓度的LPA对小麦幼苗生长及其生理指标的影响效应呈低浓度(10.0~100.0mg/L)增强、高浓度(1000.0mg/L)减弱的规律.适宜浓度水平(100.0mg/L)的LPA处理幼苗,培养至第7和14d时的叶片主要生理指标均较CK显著提高(P<0.05,下同),其中叶绿素含量是CK的29.37和3.57倍,可溶性总糖含量是CK的1.50和2.69倍,可溶性蛋白含量是CK的3.00和4.33倍;IAAO活性显著降低96.64%和95.05%,POD活性显著降低75.69%和71.12%.[结论]LPA对小麦幼苗生长的调节效应类似于其他生长素,即低浓度(10~100mg/L)促进生长、高浓度(1000mg/L)抑制生长.以100mg/L浓度处理的效果相对较好,可在小麦幼苗生产中推广应用.     

云南地区猪毕氏微孢子虫的分子检测及其基因型鉴定

[目的]从寄生虫角度明确猪场发生猪腹泻的主要病原体,为防控云南规模化猪场毕氏微孢子虫感染提供理论依据.[方法]通过巢式PCR对云南玉溪和保山地区4个猪场的129份猪粪样本进行猪毕氏微孢子虫检测,扩增微孢子虫的ITS序列,经测序分析和构建系统发育进化树确定其基因型.[结果]129份猪粪样中有30份感染毕氏微孢子虫,感染率为23.26%;其中,云南保山地区的猪毕氏微孢子虫感染率为56.82%(25/44),玉溪地区的感染率为5.88%(5/85),二者差异极显著(P<0.01,下同).按不同发育阶段划分,发现以仔猪的毕氏微孢子虫感染率最高(76.92%),成年猪的感染率相对较低(11.39%),感染率在不同发育阶段间差异极显著.经测序分析发现共有6个基因型,包括5个已知基因型[CHC5(n=3)、CHG19(n=7)、EbpD(n=9)、EbpA(n=2)和EbpC(n=4)],1个新的基因型YNZ1(n=5);从基于微孢子虫ITS序列同源性构建的系统发育进化树可知,检测出的6种基因型均属于Group 1,即具有人兽共患的可能性.[结论]云南猪场普遍存在毕氏微孢子虫感染,且均属于具有人兽共患可能性的基因型.因此,要重点加强猪场微孢子虫的防控工作,养殖过程中产生的粪便等养殖污染物必须经过堆肥发酵或消毒处理后才能作为农家肥使用或排入污水中.     

低温胁迫下水稻苗期低温失绿突变体cisc(ta)的miRNA表达谱分析

[目的]鉴定水稻耐冷相关功能基因、解析其调控耐冷性的分子机制.[方法]以耐冷籼稻材料"P1211"和冷敏型籼稻突变体cisc(ta)为试验材料,进行了低温胁迫处理和水稻幼苗转录组测序分析.[结果]冷敏型突变体cisc(ta)低温胁迫处理后共有4542个差异表达基因,其中有3673个基因上调,869个基因下调.在冷敏突变体cisc(ta)的差异表达基因中筛选到一些与低温胁迫相关的典型基因,如基本的螺旋-环-螺旋(bHLH)、活性氧清除(SOD1)和富亮氨酸重复序列(LRR)等调控基因,此外,还筛选出一些与生长素、脱落酸(ABA)、赤霉酸(GA)和冷应激反应调控(DREB/CBF)等相关的基因.为了确认RNA-seq数据,随机选择差异表达基因进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)表达分析,结果与这些基因的RNA-seq表达测定一致,证实了RNA-seq数据的准确性.[结论]该研究为水稻耐冷机理的研究和筛选水稻遗传改良有用的候选基因奠定基础.     

何首乌离体快繁技术体系的建立

[目的]建立何首乌离体快繁技术体系,为其种苗生产提供技术支持.[方法]以从广西陆川县采集的何首乌幼嫩单芽茎段为外植体,分析不同灭菌时间、不同植物生长调节剂种类和浓度及不同培养方式对其组织培养快繁技术的影响.[结果]适宜何首乌外植体消毒灭菌的方法为0.1%HgCl2浸泡处理8 min;适宜不定芽诱导的初代培养基为MS+1.0 mg/L 6-氨基腺嘌呤(6-BA)+0.05 mg/L a-萘乙酸(NAA),腋芽萌发率达96.7%;适宜的继代增殖培养基为MS+2.0 mg/L苯基噻二唑脲(TDZ)+0.05 mg/L NAA,增殖系数为5.68,植株健壮;无菌苗的单芽茎段以浸没间歇式培养(TIBs)增殖系统效果最佳;适宜的生根培养基为1/2MS+0.01 mg/L NAA,生根率达91.33%.[结论]建立了以带腋芽茎段为外植体的何首乌离体快繁技术体系,可为其种苗生产提供新途径.     

磁化微咸水对滴灌棉花生长及产量的影响

[目的]研究一种能可持续利用微咸水利用方式.[方法]在灌溉管上安装磁化设备,设置不同磁化处理,对灌溉微咸水进行磁化,研究其对棉花生长及产量的影响.[结果]微咸水磁化灌溉棉花后,对棉花鲜物质和干物质的累积及棉花产量产生了影响,棉花株高、茎秆、蕾铃重及产量等均明显高于对照,其中二次磁化处理(T3、T5)增加量更加明显.[结论]咸水磁化处理能够明显增加棉花株高、鲜物质和干物质积累,能够促进单株铃数的增加,进而提高棉花的产量,二次磁化效果更加明显.     

外源激素ABA对藜和灰绿藜种子萌发的影响

[目的]探究外源ABA对新疆荒漠地区植物藜和灰绿藜种子萌发及幼苗生长的调控作用.[方法]以藜和灰绿藜种子为材料,研究不同浓度(0、0.5、1.0、5.0、10.0μmol/L) ABA长时间(直播)与短时间(浸种)处理对上述两种种子萌发及幼苗生长的影响.[结果]外源ABA在低浓度下可促进藜种子萌发,对灰绿藜种子萌发无显著影响;高浓度ABA对两种种子萌发均起到抑制作用.不同浓度的ABA在直播及浸种处理下对藜幼苗生长均有促进作用,浸种处理对灰绿藜幼苗有不显著的促进但直播处理显著抑制其幼苗生长;高浓度(10.0μmol/L)短时间(浸种)处理对两种植物的幼苗生长均有促进效应,而高浓度长时间(直播)处理效果则相反.[结论]ABA做为胁迫因素在短时间内对两种藜科抗逆植物的种子萌发和幼苗生长均有促进效应,而长时间作用则使两种植物产生不同的适应策略,这种差异可能由于两种种子大小不同所导致.     

利用电极盘进行猪卵母细胞电激活

[目的]研究不同电激活参数以及电脉冲联合6-DMAP对猪卵母细胞孤雌激活效果的影响。[方法]使用电极盘,测定不同场强（1．1、1．3、1．5、1．7、1．9kV／cm）,不同脉冲时程（30、50、70、90、110ps）,1次脉冲下猪卵母细胞囊胚率的变化。[结果]结果表明,脉冲强度以1．5和1．7kV／cm效果最好,在80胂时其猪卵母细胞囊胚率分别达到（22．35±5．16）％和（20．59±9．41）％;脉冲强度1．5kWcm,1次电脉冲后4h联合6-DMAP激活卵母细胞,当脉冲时程达到70和90μs时,囊胚率分别达到（21．65±9．95）％和（23．10±16．27）％。[结论]在试验条件下,使用电极盘的最适电激活参数为脉冲强度1．5-1．7kV／cm,脉冲时长80μs,1次脉冲电激活。     

长大二元杂交猪胎儿成纤维细胞的生物学特性

【目的】研究长大二元杂交猪胎儿成纤维细胞的生物学特性。【方法】采用室温消化法从妊娠30d的长大二元杂母猪胚胎中分离胎儿成纤维细胞,利用MTT法检测第5、10、15、25、35、45、60、70代胎儿成纤维细胞的增殖能力,通过倒置显微镜观察不同代数的细胞形态,流式细胞仪分析细胞周期变化,DAPI染色观察细胞核染色质的形态以及衰老相关β-葡糖苷酶活性的染色测定等方法来判断细胞的衰老程度。【结果】①采用消化液室温消化法成功分离到猪胎儿成纤维细胞,细胞具有典型的成纤维细胞形态。②猪胎儿成纤维细胞于生长初期1～6d呈对数增长,此后进入平台期。【结论】随着细胞代数的增加,细胞的增殖能力虽有所下降,但仍然呈稳定的增长状态,各代次猪胎儿成纤维细胞生长良好。     

鹿茸角软骨细胞体外培养方法的建立及生长特性分析

【研究目的】建立梅花鹿鹿茸软骨细胞体外分离培养和扩增方法,观察鹿茸软骨细胞在体外培养的生物学特性,为鹿茸再生机理的研究奠定基础;【方法】体外分离培养鹿茸软骨细胞,采用组织学、MTT比色法、免疫组化等多种手段动态检测细胞生长增殖情况;【结果】核心部分,约150字鹿茸软骨细胞贴壁生长,原代细胞比传代生长速度快,原代及传代4代内的鹿茸软骨细胞均有活跃的增殖能力,软骨细胞呈三角形,多边形等多种形态,II型胶原免疫组化,甲苯胺蓝染色为阳性;【结论】体外分离培养鹿茸软骨细胞具有较强的增殖能力,传代培养4代内细胞生长旺盛并维持其生物学特性,可满足后续实验研究要求。     

玉米赤霉烯酮对猪睾丸间质细胞DNA损伤作用的彗星试验(英文)

[目的]观察玉米赤霉烯酮(ZEN)对猪睾丸间质细胞(Leydig cell)的DNA损伤效应。[方法]以体外培养的猪Leydigcell为材料,用四氮唑蓝比色分析法(MTT法)测定ZEN对离体培养的猪睾丸间质细胞的半数致死浓度,选用0(对照组)、1、5、10和20μmol/L浓度的ZEN体外作用于猪Leydigcell,通过彗星试验观察了ZEN对猪Leydig cell DNA的损伤效应。[结果]ZEN浓度为0、1、5、10和20μmol/L时,所造成的细胞拖尾率分别为16.67%、34.00%、40.67%、52.00%和64.67%,各染毒组细胞拖尾率与对照组比较,差异均有极显著统计学意义(P<0.01),且存在明显的剂量-效应关系;各剂量组对应的拖尾细胞尾长(Taillength)分别为57.60±4.78、57.75±6.25、78.97±5.83、100.50±6.94和146.83±12.31μm,尾部DNA含量(Tail DNA %)分别为21.29±2.25%、22.24±2.43%、31.21±6.27%、37.45±4.33%和60.68±9.83%,与对照组比较,5μmol/L及以上ZEN浓度染毒组的Tail length和Tail DNA %均有显著性差异(P<0.05),且随ZEN浓度增加呈上升趋势。[结论]ZEN对猪Leydig cell存在遗传毒性,可以损伤Leydig cell的DNA,且有明显的剂量-效应关系。     

玉米赤霉烯酮对猪睾丸间质细胞DNA损伤作用的彗星试验

[目的]观察玉米赤霉烯酮(ZEN)对猪睾丸间质细胞(Leydig cell)的DNA损伤效应。[方法]以体外培养的猪Leydig cell为材料,用四氮唑蓝比色分析法(MTT法)测定ZEN对离体培养的猪睾丸间质细胞的半数致死浓度,选用0(对照组)、1、5、10和20μmol/L浓度的ZEN体外作用于猪Leydig cell,通过彗星试验观察了ZEN对猪Leydig cell DNA的损伤效应。[结果]ZEN浓度为0、1、5、10和20μmol/L时,所造成的细胞拖尾率分别为16.67%、34.00%、40.67%、52.00%和64.67%,各染毒组细胞拖尾率与对照组比较,差异均有极显著统计学意义(P<0.01),且存在明显的剂量-效应关系;各剂量组对应的拖尾细胞尾长(Tail length)分别为57.60±4.78、57.75±6.25、78.97±5.83、100.50±6.94和146.83±12.31μm,尾部DNA含量(Tail DNA%)分别为21.29±2.25%、22.24±2.43%、31.21±6.27%、37.45±4.33%和60.68±9.83%,与对照组比较,5μmol/L及以上ZEN浓度染毒组的Tail length和Tail DNA%均有显著性差异(P<0.05),且随ZEN浓度增加呈上升趋势。[结论]ZEN对猪Leydig cell存在遗传毒性,可以损伤Leydig cell的DNA,且有明显的剂量-效应关系。     

猪生长激素启动子的克隆及功能分析

[目的]克隆猪生长激素启动子,确定其启动子核心序列和主要的顺式作用元件。[方法]根据NCBI上公布的序列设计引物,PCR扩增了猪生长激素5’端-1 821～+61 bp的序列,并通过移步缺失的方法,获得9段长短不一的启动子序列,将其分别构建到双荧光素酶表达载体pGL3-basic上。通过重组质粒瞬时转染大鼠垂体瘤细胞(GH3)、猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)和转染后细胞荧光素酶活性的测定,检测这些5’末端缺失质粒在垂体及非垂体细胞中的相对转录活性。[结果]成功扩增了猪GH基因5’上游启动区1 882 bp的片段,并构建了9个pGL3-mGH promoter报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测系统证实插入报告基因载体中的启动子具有非常强的细胞特异性。[结论]猪生长激素特异性在垂体细胞中表达,其最小启动子位于-110 bp以内,启动子区-218～-110 bp和-429～-218 bp间存在正向调控元件。     

猪生长激素启动子的克隆及功能分析(英文)

[目的]克隆猪生长激素启动子,确定其启动子核心序列和主要的顺式作用元件。[方法]根据NCBI上公布的序列设计引物,PCR扩增了猪生长激素5’端-1821~+61bp的序列,并通过移步缺失的方法,获得9段长短不一的启动子序列,将其分别构建到双荧光素酶表达载体pGL3-basic上。通过重组质粒瞬时转染大鼠垂体瘤细胞(GH3)、猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)和转染后细胞荧光素酶活性的测定,检测这些5’末端缺失质粒在垂体及非垂体细胞中的相对转录活性。[结果]成功扩增了猪GH基因5’上游启动区1882bp的片段并构建了9个pGL3-mGHpromoter报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测系统证实插入报告基因载体中的启动子具有非常强的细胞特异性。[结论]猪生长激素特异性在垂体细胞中表达,其最小启动子位于-110bp以内,启动子区-218~-110bp和-429~-218bp间存在正向调控元件。     

转EGFP基因猪胎儿神经干细胞的体外分化

 【目的】获得转EGFP基因神经干细胞并监测其自我更新、增殖和多向分化潜能;通过用EGFP对神经干细胞进行标记和体外追踪实验,为EGFP作为示踪标记对神经干细胞进行体内移植研究奠定基础。【方法】利用神经干细胞培养技术体系,从胎龄30 d猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入神经干细胞,诱导转基因神经干细胞贴壁分化,观察其体外增殖、分化特点。采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。【结果】成功分离培养出神经干细胞,获得转EGFP基因神经干细胞,神经干细胞在表达EGFP的同时仍具有多向分化潜能。神经干细胞中Nestin表达强阳性,NogoA、DCX、CyclinD2、CD133、Hes1、Oct4、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2);能分化为脂肪细胞(表达LPL和PPARγ-D)、成骨细胞(表达Osteonectin和Osteocalcin)、肌细胞(表达myf-5、myf-6和myoD)、内皮细胞(表达CD31、CD34、CD144和eNOS)和软骨细胞(表达COL2A1)。【结论】从猪胎儿大脑组织分离神经干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因神经干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能,可以用EGFP对神经干细胞进行标记、追踪,作为示踪标记进行神经干细胞体内移植研究。     

猪类胚胎生殖细胞体外诱导分化为神经细胞的研究

【目的】探讨猪类胚胎生殖细胞向神经细胞分化的潜能。【方法】采用性腺-中肾区基质细胞与猪原始生殖细胞共培养的方法得到猪类胚胎生殖细胞,通过直接分化的方法进行神经细胞定向诱导。【结果】（1）与小鼠成纤维细胞作为饲养层相比,性腺-中肾区基质细胞作为饲养层同样能够支持猪类胚胎生殖细胞生长,二者对猪类胚胎生殖细胞的增殖能力不存在显著影响;（2）猪类胚胎生殖细胞有较强的碱性磷酸酶活性,Q-PCR结果显示多能性基因Oct4、Sox2及Nanog表达,增殖能力呈现“S”型,即生长的潜伏期、对数期及平台期,猪类胚胎生殖细胞经体外悬浮培养能够形成拟胚体;（3）经过诱导猪类胚胎生殖细胞能够分化形成表达神经干细胞、神经元及神经胶质细胞标记物的多种神经细胞类型。【结论】从早期性腺中成功分离培养得到了猪类胚胎生殖细胞,通过简单、快速的神经细胞分化的诱导体系证实了猪类胚胎生殖细胞具有体外定向分化为多种神经谱系细胞的能力。     

功能性猪α干扰素基因的表达及活性检测

[目的]检测克隆猪α干扰素基因（IFN-α基因）在毕赤酵母中的表达。[方法]经植物血凝素（PHA）诱导后,提取猪外周血淋巴细胞,并用RT-PCR方法获得IFN-α基因,将该基因与真核表达质粒pPIC9K连接,并电转入毕赤酵母GS115菌中,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE电泳检测IFN-α蛋白表达,Western-blot分析IFN-α蛋白活性。[结果]重组转化菌株经甲醇诱导后能表达相对分子质量约为19kD的蛋白质,该蛋白质能与相应抗体产生免疫反应。[结论]实现了猪功能性IFN-α基因表在毕赤酵母中表达,为进一步探讨IFN-α的生物学活性研究奠定了基础。