猪传染性胃肠炎病毒S蛋白C和D抗原位点在大肠杆菌中的串联表达

使用大肠杆菌偏好性密码子人工合成了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白C和D抗原位点多肽基因序列。依次将C和D抗原位点多肽基因序列克隆至表达载体p ET-32a中。将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western Blot分析。结果显示,在分子量25 k Da处有1条明显的蛋白表达条带,且能被TGEV阳性血清识别。本研究为TGEV的血清学检测方法的建立提供了必要的物质基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段在多表达系统中的表达及初步应用

本研究分别用巴斯德毕赤酵母、杆状病毒和大肠杆菌表达系统中表达的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH-98株纤突蛋白(S)基因5'端含有B和C抗原位点的片段,利用Dot-ELISA方法对表达蛋白进行了抗原性比较分析,初步建立了以巴斯德毕赤酵母系统表达的重组蛋白为包被抗原的TGEV Dot-ELISA检测方法。结果表明:两种真核系统中表达的重组蛋白的抗原性相对更强。抗原最佳包被量为50 ng,抗体稀释度1∶100,最适封闭液为10 mg/L牛血清白蛋白,血清反应时间为60 min;酶标二抗的工作浓度为1∶1 000,反应时间为30 min,底物在室温显色时间为5 min。本研究建立的Dot-ELISA方法对猪呼吸道冠状病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒阳性血清的检测结果均为阴性,特异性良好。与Svanova TGEV/PRCV抗体诊断试剂盒比较,此方法的特异性和符合率分别为90%和87%。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段克隆序列分析及原核表达

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白可诱导中和抗体，是主要保护性抗原，N端抗原位点B和C在猪呼吸道冠状病毒(PRCV)中缺失。体外扩增TGEVS基因B、C抗原位点357bp片段(TS)。核苷酸序列与氨基酸同源性分析表明该片段较为保守。将TS克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中，转化大肠杆菌中。经IPTG诱导后，SDS—PAGE分析目的蛋白与谷胱苷肽硫转移酶(GST，大小约为26ku)融合后大小约为40ku，目的蛋白分子量约为13．2ku，优化表达条件后表达量达37．9％。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段在杆状病毒中的表达

应用RT-PCR方法扩增了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH-98株S基因5′端含有B、C抗原位点的片段。将该片段亚克隆至杆状病毒转移载体pMelBac B中。重组质粒经纯化,与线性化的杆状病毒共转染Sf9昆虫细胞,经4轮蚀斑筛选,获得了纯化的重组病毒,最终实现了在昆虫细胞内的蛋白表达。经Dot-ELISA进行抗原性分析,结果表明重组蛋白具有抗原性。本研究猪传染性胃肠炎血清学诊断方法的建立提供了必要的物质基础。     

猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)作为抗原免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后,通过聚乙二醇方法进行融合,利用有限稀释法在HAT培养基上筛选杂交瘤细胞,共获得12株既能稳定生长并可以分泌特异性抗TGEV的单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为8D2、4H4、5D6、7H10、4C3、9G1、3A2、8G1、5G6、2D7、4D6、6B10。间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光结果表明,获得的12株单抗能特异性识别TGEV,通过间接ELISA做病原检测,显示12株单抗与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒(PrV)不发生交叉反应。经抗体亚类鉴定,该12株单克隆抗体均为IgG2b。12株抗TGEV的单抗制备成功,为猪传染性胃肠炎病原特性研究和病原快速检测提供了物质基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点序列的克隆与原核表达

将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S基因A抗原位点目的片段克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21（DE3）,用IPTG诱导,进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,确定目的蛋白的原核表达情况和免疫特异性。结果显示,目的片段的大小为534bp,序列分析表明,该基因与其他TGEV相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测可见分子质量约43 ku的融合蛋白条带,表明,该蛋白具有良好的反应原性。     

RT-PCR检测和区分猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒的研究

根据猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪呼吸道冠状病毒（PRCV）的基因组核苷酸序列，在S基因（纤突蛋白基因）5′端保守区设计了一对引物P3／P4，该对引物在TGEV扩增跨幅约为2.4kb；而PRCV由于在此区域存在一约0.6kb碱基缺失，扩增跨幅约为1.8kb。用引物P3／P4对TGEV Miller株、Purdue株和PRCV AR310株分别进行RT－PCR，根据RT－PCR扩增片段大小可以直接区分TGEV和PRCV。用引物P3／P4与引物P1／P2作Nested-PCR,提高了该RT－PCR的特异性和敏感性，建立的RT－PCR可为临床上诊断TGEV及调查我国是否存在PRCV感染提供可靠的鉴别手段。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B、C位点的克隆及原核表达载体的构建

参考GenBank上公布的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S基因B、C抗原位点序列,应用Primer6．0设计一对含酶切住点的引物,用于RT—PCR扩增B、C抗原位点目的片段,将扩增产物连接于peasy—T克隆载体上,构建克隆载体,用EcoRⅠ和XhoⅠ对表达载体PET-32a（＋）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（＋）多克隆位点上,连接、转化至BL21（DE3）,构建B、C位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。所扩增的目的片段的大小为357bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEVS基因B、C抗原位点的原核表达载体。TGEVS基因B、C抗原位点原核表达载体的成功构建,为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。     

多重RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒

为了检测、区分猪传染性胃肠炎(TGE)和猪流行性腹泻(PED)，建立了同时检测这2种疾病痛原体的多重PCR方法。参考GenBank登录的TGEV和PEDV纤突蛋白S基因序列，经DNAsis 2．0比较分析。分别筛选出TGEV、PEDVS基因相对保守区。以TGEV TH-98株(GenBank登陆号为AF494337)和PEDV CV777株(GenBank登陆号为NC003436)为参考模板，利用软件Primer3设计合成了2对寡核苷酸引物，以ST细胞培养的TGEV和PEDV毒株核酸为模板。利用所设计的2对引物进行多重RT-PCR扩增，结果同时得到与试验设计相符的499bp(TGEV)和199bp(PEDV)的扩增条带。而对其他3种猪病原的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明。建立的多重RT-PCR方法可检测出10pgTGEV RNA和100pg PEDV RNA。     

猪传染性胃肠炎病毒反向遗传研究进展

从猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的分子生物学特性、TGEV的反向遗传系统的建立及其在TGEV研究中的应用等角度对国外TGEV反向遗传研究进展作一综述。TGEV全长基因组反向遗传系统的成功建立,极大推动了TGEV的复制机制、基因功能及作为疫苗开发的表达载体的研究。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段在巴斯德毕赤酵母KM71中的表达

猪传染性胃肠炎(TGE)是猪的一种急性、高度接触性传染病,各种年龄及品种的猪对本病均易感,其中2周龄以下仔猪的死亡率可达100％.该病病原为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV).TGEV S蛋白(或称E2蛋白)形成病毒粒子表面的突起,携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇.S蛋白含有4个抗原位点,从氨基末端开始依次定为C、B、D和A,4个抗原位点都位于S蛋白N端543个氨基酸残基之内[1-2].本试验在巴斯德毕赤酵母KM71中表达了TGEV S蛋白B、C抗原位点片段,为建立TGE血清学检测方法提供必要的物质基础.     

用固定细胞阻断酶联免疫吸附试验鉴别诊断猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒的感染

用固定细胞阻断酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）对来自丹麦猪的１８０份血清进行了猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）和猪呼吸道冠状病毒（ＰＲＣＶ）感染的鉴别诊断，共检出了ＰＲＣＶ抗体阳性血清１０７份（５９．４％），ＴＧＥＶ抗体阳性血清０份。同时也检测了一些来自国内不同ＴＧＥＶ感染类型的猪场血清。该鉴别诊断方法在我国的建立和应用为从ＰＲＣＶ阳性国家进口猪的ＴＧＥ的检疫提供了一条有效途径。     

分泌抗猪流行性腹泻病毒中国变异株S蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

以纯化的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)中国变异株(CH/ZMDZY/11)S蛋白N端高变区(22-380aa)重组蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠,以纯化CH/ZMDZY/11全病毒及带His标签的重组蛋白分别为筛选抗原,利用淋巴瘤杂交技术获得了一株稳定分泌抗S蛋白特异性单克隆抗体细胞株,命名为2D1。该株杂交瘤细胞诱生小鼠产生的腹水抗体效价为1∶3 200,免疫球蛋白类型为IgM。ELISA检测该单抗与PEDV流行株及PEDV CV777疫苗株全病毒的反应显著差异,可区分流行毒株和疫苗毒株;但该单抗用于Western blot不能区分PEDV流行株和疫苗株。ELISA及Western blot试验结果显示,该单抗有较好的PEDV特异性,可用于检测PEDV。     

毕赤酵母分泌表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白抗原位点的高密度发酵

本研究首先通过摇瓶培养方法,确定了表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白B和C抗原位点片段的毕赤酵母在BSM培养基中生长所需的最佳配方为甘油45 g/L、氨水单次补加量0.12%、甲醇流加量1.00%。然后采用分批补料培养方法对毕赤酵母GS115/pPIC9-TY进行高密度发酵,发酵液上清中蛋白的表达量为60.18 mg/L。本发酵工艺可实现酵母工程菌的高密度表达发酵,为下一步大规模化制备重组蛋白奠定了基础。     

传染性支气管炎病毒S1蛋白基因的克隆与原核表达

根据GenBank中IBV基因序列,设计合成一对引物,成功地从IBV H52基因组中扩增了S1基因。经测序证实该序列全长1 685 bp,编码538个氨基酸。为便于表达,对其进行弃信号肽克隆,然后定向连接到表达载体中获得重组表达质粒pGEX-S1,转入受体菌,经诱导成功的表达了重组蛋白GST-S1。SDS-PAGE显示,该蛋白约为80 kD,占菌体总蛋白的8%,West-blot表明,其具有良好的免疫学活性。IBV S1基因的克隆和表达,为研究病原与细胞相互作用、开发基因工程疫苗奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒样颗粒在杆状病毒表达系统中的体外组装

利用RT-PCR方法扩增TGEV M、sM和N结构蛋白基因,分别将M、sM和N基因克隆入杆状病毒供体质粒pFastBacTMDual,获得转移质粒pFastBacTM Dual-M、pFastBacTM Dual-sM和pFastBacTM Dual-N,将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,经抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-M、Bacmid-sM和Bacmid-N,在Cellfection作用下,将杆状病毒重组质粒转染昆虫细胞sf9,获得重组杆状病毒rBac-M、rBac-sM和rBac-N。通过间接免疫荧光试验检测显示,重组蛋白在杆状病毒感染的sf9细胞中获得正确表达。将重组杆状病毒按照以下感染组合进行TGEV VLPs组装的研究:rBac-M、rBac-sM、rBac-N单独感染sf9细胞,rBac-M+rBac-N、rBac-M+rBac-sM联合感染sf9细胞。结果表明,rBac-M、rBac-M+rBac-sM、rBac-M+rBac-N感染的昆虫细胞可见类病毒样粒子,rBac-sM、rBac-N单独感染sf9细胞未见形成明显的病毒样颗粒。试验结果为进一步研究TGEV结构蛋白在病毒装配过程中的作用提供了理论依据。     

猪传染性胃肠炎病毒Nsp2与宿主细胞蛋白PSMD11相互作用的研究

为确定猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）非结构蛋白2（nonstructural protein 2,Nsp2）与宿主细胞蛋白26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基11（PSMD11）之间是否存在相互作用,本研究利用RT-PCR方法扩增猪源PSMD11基因,并构建其真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11,经测序和双酶切验证正确后,转染猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）,通过Western blotting和间接免疫荧光试验（IFA）检测真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11是否能在IPEC-J2中表达。利用免疫共沉淀（Co-IP）试验检测TGEV Nsp2和宿主细胞PSMD11蛋白之间的相互作用,并通过激光共聚焦显微镜观察TGEV Nsp2与PSMD11在宿主细胞中的共定位情况。结果显示,本研究成功扩增了猪源PSMD11基因,大小约为1 474 bp,基因序列经测序比对与标准序列完全一致。构建的真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11能在IPEC-J2细胞中成功表达PSMD11蛋白;Co-IP结果表明,PSMD11与Nsp2之间存在相互作用;共定位试验结果显示,PSMD11与Nsp2的相互作用发生在细胞质中,且细胞中PSMD11蛋白的表达位置并未因Nsp2的表达而发生改变。本研究结果为进一步研究TGEV Nsp2在病毒感染过程中所发挥的重要作用提供新的线索。     

猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二重PCR检测方法的建立

通过对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因和猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因进行序列分析,本试验利用DNAStar软件分别设计2对特异性引物,扩增片段长度分别为299和437 bp,建立一种针对TGEV和PEDV感染的二重PCR鉴别诊断方法.该方法能同时检测到TGEV和PEDV,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等均无扩增,其检测TGEV、PEDV的极限为10⁴ 拷贝/μL;用该方法对临床收集的68份疑似病毒性腹泻仔猪粪便和肠道组织样本进行检测,结果表明本试验建立的二重PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查.     

猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒一步法双重RT-PCR检测方法的建立与应用

本研究旨在建立一种用于临床腹泻病例中猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）快速检测的一步法双重RT-PCR方法。根据GenBank中收录的PEDV和TGEV的基因序列,分别设计两对特性引物,经最佳反应条件的优化和选择,结果显示,该一步法双重RT-PCR检测方法能同时特异性扩增PEDV和TGEV,该方法可检测到稀释度1×10^-5的疫苗毒。应用本方法检测2015年度实验室收集的疑似样品,PEDV阳性率为100%。本研究建立的方法快速、敏感性高、特异性强,可用于临床PEDV和TGEV的快速检测及流行病学调查。     

猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立及临床应用

根据Gen Bank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的N基因,针对其保守序列,设计并合成1对引物,可特异性扩增长度为590 bp目的条带,成功建立了检测TGEV的RT-PCR方法。以等量同一浓度的同一TGEV阳性病毒液进行重复性试验,其3次扩增特异性条带大小均为590 bp。以猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV),猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(RV)进行特异性试验,其结果显示仅TGEV扩增得到预期特异性目的条带。以TGEV阳性病毒液提取的c DNA用紫外分析仪确定核酸质量浓度为1 g/L后,用dd H2O按10倍稀释,稀释度为10-1~10-5,其均能扩增出590 bp特异性条带。在猪传染性胃肠炎高发季节的2013年9月至2014年1月对四川成都、德阳、绵阳、遂宁、南充各地猪场送检的疑似猪传染性胃肠炎感染病猪的临床样品15份,进行检测,其猪传染性胃肠炎阳性率为100%。并且对四川成都、德阳、绵阳、遂宁、南充各地猪场保育舍随机采集的1~10周龄仔猪临床样品500份,进行检测,其1~2周龄仔猪传染性胃肠炎阳性率为17%,病死率为100%,3~4周龄仔猪传染性胃肠炎阳性率为14%,病死率为78.6%,5~6周龄仔猪传染性胃肠炎阳性率为9%,病死率为44.4%,7~8周龄仔猪传染性胃肠炎阳性率为4%,病死率为25%,9~10周龄仔猪传染性胃肠炎阳性率为1%,病死率为0%。从地区来看,在这500份样品中,成都、德阳、绵阳、遂宁、南充地区此病的阳性率分别为15%,6%,10%,6%,8%。以上结果显示所建立的TGEV RT-PCR检测方法,重复性好,特异性强,敏感性高,可用于该病的临床诊断。