胡萝卜atp8基因的克隆表达及细胞质雄性不育的相关性研究

摘 要：线粒体基因重组而形成的异常开放阅读框的表达导致了植物的细胞质雄性不育现象,在这种现象的研究中具有重要的意义。本研究分离克隆了胡萝卜细胞质雄性不育相关的线粒体基因片段,并利用半定量RT-PCR和Real-time PCR技术研究了该基因在不育系和相应保持系中的表达情况。结果表明,与不育系相比,胡萝卜保持系atp8基因序列在30 bp-170 bp之间核苷酸突变很多,且在154 bp-162 bp发生了缺失。Blast分析发现保持系atp8基因与胡萝卜nad6基因的同源性高达100%。表达分析表明,atp8基因在不育系花蕾的前五个时期表达量都明显低于相应的保持系,而在盛花期的表达量与保持系趋于一致。推测atp8基因的异常表达与胡萝卜细胞质雄性不育有着密切关系。     

大葱雄性不育系及保持系atp6基因的克隆及表达分析

为进一步研究atp6基因与大葱细胞质雄性不育的关系,以章丘大葱不育系和保持系作为本研究的实验材料,利用同源克隆的方法获得大葱atp6基因序列,并对其在蛋白质二级结构和生长发育各时期atp6基因表达量进行了比较。结果表明:不育系与保持系atp6基因开放阅读框第171碱基处存在一个A/T多态性位点,这一多态性位点使蛋白质二级结构的比例发生了轻微变化,但并未改变ATP6蛋白跨膜结构。利用实时荧光定量聚合酶链反应检测atp6基因苗期、抽薹期、开花期以及开花后期在根系和叶/花蕾中的表达水平,结果表明:在植株整个发育过程中,根系atp6基因表达量表现出先升高后降低的趋势,在开花期达到最大值,保持系是不育系的1.14倍;叶/花atp6基因表达量在整个生育期逐渐降低,苗期最高,保持系是不育系的1.96倍。     

一个甘蓝型油菜细胞质雄性不育相关基因克隆和表达分析

利用甘蓝型油菜与播娘蒿融合杂种中的不育株与甘蓝型油菜杂交、回交,得到细胞质雄性不育系NJ65A。根据pol和nap雄性不育高度相关的基因orf224和orf222设计兼并引物,从NJ65A植株中克隆得到一个长度为675bp的基因,命名为orf224-NJ65A。该基因编码224个氨基酸,氨基酸序列与orf224、orf222和orf220序列相似性分别为：70％、53％、60％。RT—PCR表达分析表明：orf224-NJ65A在所检测的组织中都有表达,但在花、花蕾和茎中的表达量较大。推测orf224-NJ65A与细胞质雄性不育有关。     

烟草花蕾中内源激素含量与雄性不育性的关系初探

采用高效液相色谱法测定了烟草细胞质雄性不育系及其相应保持系花蕾发育过程中IAA,GA3,ZT及ABA4种内源激素含量的动态变化。结果表明,从小花蕾→中花蕾→大花蕾,烟草雄性不育系花蕾中IAA和ZT含量都比相应保持系的高;而不育系花蕾中GA3和ABA含量都比保持系的低。据此认为烟草花蕾内源激素含量的变化与雄性不育的发生有密切关系。     

小麦K、V型细胞质雄性不育系线粒体基因的比较分析

细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,MS)是高等植物中普遍存在的一种母性遗传现象,跟线粒体基因密切相关。小麦K型和V型细胞质雄性不育性是由于粘果山羊草和偏凸山羊草或易变山羊草的细胞质导入普通小麦中产生的,被认为是最有利用潜力的小麦不育种质,但是其不育性产生的机理还不清楚。本研究在已知小麦K型细胞质雄性不育系和保持系线粒体基因组序列的基础上,比较分析了K型,V型不育系和保持系中33个线粒体基因和22个开放阅读框(open reading frame,orf;K型不育系特有的,被认为是K型不育系的不育候选基因)。结果表明,线粒体基因中除atp6、nad6和rps3在保持系和不育系之间有较大差异外,其它基因在保持系和不育系中都是高度保守的,其一致性达98%以上,atp6和nad6在两个不育系中也是高度一致的;22个orf中只有orf249在K型和V型不育系之间具有一定差异,其余的orf高度一致,说明小麦K型和V型不育系的线粒体基因是高度保守的,推测二者可能具有相似的不育基因或不育机理。研究结果为小麦K型和V型不育系在杂交育种中的利用奠定了一定的理论基础。     

甘蓝细胞质雄性不育相关基因orf138的分子特性分析

为了研究甘蓝雄性不育机制,根据萝卜CMS相关基因orf138的序列信息,设计特异引物,并在甘蓝不同类型不育系和保持系中鉴定PCR产物的稳定性。随后利用Tail-PCR技术,扩增获得此基因的侧翼序列并进行了生物信息学分析。结果表明在甘蓝不育型材料中,能够稳定扩增出300 bp左右的单一条带,而在其他细胞质不育类型和可育材料中均未扩出条带,经多次验证结果稳定可靠。甘蓝中orf138的上下游侧翼序列有效碱基1789 bp,通过生物信息学分析,获得包括起始密码和终止密码的orf138的完整序列共417 bp。同源性比对结果显示：与甘蓝型油菜﹑白菜和萝卜的orf138片段具有高度保守性。分析侧翼序列表明甘蓝orf138的3’端是由ORF83、trnfM、ORF125等基因片段构成的一个复杂序列。获得了甘蓝OguCMS特异的分子鉴定标记,明确了orf138在甘蓝线粒体中的位置,以上结果为甘蓝雄性不育的进一步研究奠定良好的基础。     

高粱雄性不育系、保持系正负极向过氧化物酶同工酶的电泳比较

对高粱雄性不育系、保持系不同生长发育阶段叶片中的正、负极向过氧化物酶同工酶进行了检测。结果表明,叶片中正极向过氧化物酶同工酶谱两者基本相同,说明正极向过氧化物酶在不同生长发育时期是稳定的。负极区域中,在叶片发育过程中有2条酶带消失,证明在这个区域中遗传信息出现顺序表达现象。花粉粒发育过程中,不育系的正极向过氧化物酶带始终多于保持系。作者认为,不育细胞质基因可影响编码过氧化物酶的核基因的表达,引起雄性不育。不育细胞质基因可能也同时具有调节基因的功能,表现为具有解除阻遏的作用,使不育系花粉粒发育过程中部分过氧化物酶基因得以表达;而保持系不具有这种解除阻遏的细胞质不育基因,使部分基因仍处于阻遏状态,造成保持系中过氧化物酶同工酶谱带少于不育系的现象。不育细胞质基因的这种调控作用,同样有可能影响核基因遗传功能的正常发挥,引起核质之间的不协调而导致雄性不育。     

小麦雄性不育系保持系过氧化物酶同工酶的比较研究

从小麦雄性不育系、保持系的10个不同组织、器官中共检测出8种过氧化物酶,在叶、芽鞘、根、节、节间、穗轴、叶鞘和芒中,不育系和保持系的过氧化物酶基本相同,说明这种酶由细胞核编码,但在花粉粒发育的3个不同时期,不育系与保持系间的过氧化物酶有明显差异,表现为不育系中的过氧化物酶同工酶多于保持系,这可能是由于不育系中细胞质不育基因对核基因的表达有调控作用,这种调控作用表现为不育细胞质基因的去阻遏作用,即不育细胞质基因可以去除细胞核中编码过氧化物酶基因的阻遏作用,使不育系中有更多的过氧化物酶基因得以表达,造成不育系中过氧化物酶同工酶多于保持系的现象.     

大白菜新型细胞质雄性不育生理生化机制的研究

以大白菜新型细胞质雄性不育系及其保持系为材料,对花蕾发育全过程中氨基酸、可溶性糖、蛋白质含量及同工酶谱带进行了动态比较研究。结果表明:不育系花药中可溶性糖、可溶性蛋白质含量低于其相应的保持系;其游离氨基酸总量和保持系无明显差异,但不育系的脯氨酸含量显著低于其相应的保持系;不育系花药中MDH,AAT,EST,POD,COD和PPO同工酶谱带与保持系相比存在明显差异。认为不育系花药中结构物质、营养物质、能量物质的亏损,同工酶表达的差异与小孢子败育密切相关。     

水稻滇Ⅰ型和BT型细胞质雄性不育系的PCR标记鉴别

中国用于杂交粳稻生产的细胞质雄性不育系仅有滇Ⅰ型和BT型,它们的不育系产生的花粉都为染败型,而且具有相同的恢保关系、同为配子体不育。因此,基于花粉败育特点和恢保关系等常规技术无法鉴别这两种不育系。本研究利用线粒体特异引物LD24对27个滇Ⅰ型不育系和9个BT型不育系进行PCR扩增,结果显示滇Ⅰ型不育系无扩增片段,BT型不育系具有1个605 bp的片段。该片段的DNA序列与水稻LD型雄性不育细胞质线粒体基因组的一个604 bp片段相似性达99%,该片段包括一个位于rps1基因下游的一段230 bp序列及rps1与orf187基因间隔区上游的一个374 bp序列。本研究的结果说明利用LD24标记的PCR产物可以有效地鉴别水稻滇Ⅰ型和BT型雄性不育细胞质。     

棉花育性相关基因GhPG2的克隆与表达分析

多聚半乳糖醛酸酶家族是一个细胞壁水解酶,在许多高等植物的花粉中都具有高水平外切多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性,可能在花粉成熟和花粉管伸长中发挥重要作用。利用已报道与恢复基因连锁的分子标记STS679筛选陆地棉Y18恢复系核基因组BAC文库,获得一个阳性克隆Z55E7,对该克隆测序获得6个基因,其中一个为编码多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)基因,暂被命名为GhPG2。在棉花细胞质雄性不育系、保持系和恢复系中对该基因进行序列和表达分析,以便进一步了解该基因与棉花细胞质雄性不育的关系。从BAC克隆中分离到GhPG2基因,对其进行序列分析,以半定量RT-PCR和实时定量PCR分析该GhPG2基因在棉花恢复系、保持系和不育系各个组织中的表达模式。分离到GhPG2基因的基因组序列为1 518 bp,其开放阅读框序列为1 239 bp,共编码412个氨基酸,包含PG基因家族的4个保守结构域。系统进化树分析表明,GhPG2基因与其他物种花粉表达的PG基因同属C分支。表达分析表明, 该基因在恢复系和保持系的花药、花瓣和VI级花蕾中高表达,而不育系的相应组织该基因表达量明显降低。GhPG2基因归类于花粉表达的一类PG基因。实验结果暗示GhPG2基因可能与棉花正常的花器官发育相关。     

大豆细胞质雄性不育系MADS-box基因的分离分析

采用cDNA-AFLP差异显示技术对大豆细胞质雄性不育系NJCMS2A与其保持系NJCMS2B间基因差异表达进行研究,结果从NJCMS2A花蕾中分离到一个差异表达片段,对该差异片段进行克隆、测序和序列比对分析,Blast检索结果显示它与大豆基因组中Gm13上g29510.1 cDNA片段的同源性达98.7%,与大豆中一个MADS-box基因的同源性达98%,氨基酸序列比对结果表明它与大豆中一个MADS-box蛋白有96%的同源性,与豌豆中MADS-box M7蛋白有83%的同源性,与苦瓜中MADS-box2蛋白有88%的同源性,与海岛棉典型的MADS-box基因编码的AGAMOUS蛋白保守区有83%的同源性,进一步对其氨基酸序列进行结构和功能预测显示该差异片段具有MADS-box转录因子的典型结构域K-box,证明其编码蛋白为一MADS-box转录因子,半定量RT-PCR分析结果显示其在NJCMS2A花蕾中表达量很高,而在NJCMS2B花蕾中表达量很低,推测该差异片段可能与大豆细胞质雄性不育有关。     

Development of two new molecular markers specific to cytoplasmic male sterility in tuber mustard (<Emphasis Type="Italic">Brassica juncea</Emphasis> var. <Emphasis Type="Italic">tumida</Emphasis> Tsen et Lee)

A novel and stable cytoplasmic male sterility CMS line of tuber mustard has been bred by subsequent backcrosses for 10 years. Two specific markers atpA and orf220 were cloned and partially characterized in our previous study (Zhang et al. 2003). In this study, two new molecular markers, orf256 and orf305/orf324, have been isolated and identified. The orf256 gene size was found to be 825 bp in CMS line and a 1,357 bp in its maintainer line. Sequence analysis indicated that the orf256 gene was an entire coding sequence and downstream of the cox1 gene. Interestingly, the 906 bp fragment, which contains part of the sequence of orf222, nad5 and orf139 genes, was found to be inserted from the 451st bp of 5′-flank of the 1,357 bp fragment. In the same way, the orf324 gene was isolated from CMS line and orf305 gene from its maintainer line. Both of them are entire coding sequences, upstream from nad3 and rps12 gene, and co-transcribed with the nad3 and rps12 genes. In addition, two molecular markers, orf256 and orf324/orf305, have been successfully converted into the SCAR markers. Subsequently, ORF256, ORF324, ORF305 protein and ORF256-M-431 fragment are predicated to contain signal peptide sequences, and ORF220 was predicated to contain signal anchor sequence. RFLP analysis results revealed that all of the molecular markers exhibited polymorphisms. Northern blot analysis indicated that the expression level of these genes in CMS line is higher than that of the maintainer line. In the mass, all of these genes are expressed lower in the leaf than that of floral organs between the CMS line and its maintainer line. The difference in expression pattern of different mitochondrial specific marker genes suggests that the abundance of mitochondrial proteins is differentially regulated in the organ/tissue development in tuber mustard. Results of this study also provide some novel and useful clues to explore the biological function of these specific marker genes in the tuber mustard.     

哈克尼西棉细胞质雄性不育相关线粒体基因多态性分析

【目的】研究棉花细胞质雄性不育的相关线粒体基因。【方法】利用线粒体基因atp A、atp6、atp9、cob、coxⅠ、coxⅡ、coxⅢ、nad3、nad6、nad9探针,对哈克尼西棉细胞质雄性不育系S、保持系F、杂种一代H进行限制性片段长度多态性分析。【结果】atp A、coxⅢ、nad3、nad6在3个材料间具有多态性。atp A、nad6基因探针与所有酶的杂交结果均显示出多态性,且在不育系与杂种一代中表现一致,而在保持系中差异明显。atp A/Eco RⅠ在3个材料中的杂交结果均显示2条带,其中1条2.2 kb的杂交带在3个材料中相同,另一条在不育系和杂种一代中大小为3.2 kb,而在保持系中为4.8 kb;atp A/PstⅠ杂交结果中,在不育系和杂种一代中的条带大小为17.0kb,而在保持系中为10.2 kb。nad6探针与4个酶的杂交结果均为不育系和杂种一代比保持系多1~2条杂交带。coxⅢ/Eco RⅠ在3个材料中均有1条2.5 kb的杂交带,但在保持系与杂种一代中比不育系多1条1.7 kb的弱带。nad3/Bam HⅠ的杂交结果在不育系与保持系中表现一致,而在杂种一代中缺少1条9.5 kb的杂交带。【结论】推测atp A、nad6基因参与调控不育系的形成,而coxⅢ、nad3可能受到恢复系核基因的调控,在不育系育性恢复过程中发挥较为重要的作用。     

甜菜细胞质雄性不育系及保持系叶绿体DNA的RAPD分析

对细胞质雄性不育甜菜的不育系及其保持系的叶绿体DNA(ctDNA)进行了RAPD分析,结果表明：在所选的70个引物中,甜菜细胞质雄性不育系和保持系叶绿体DNA之间不存在差异性。与此同时,对叶绿体DNA的提取方法进行了改进,在不需密度梯度离心条件下即可获得高纯度的DNA;优化了甜菜叶绿体的RAPD的反应条件。     

甜菜胞质雄性不育系与保持系某些生理特性的差异

采用比较生理学的方法，对甜菜细胞质雄性不育系及其保持系生殖生长阶段的某些生理特性进行了研究。结果表明，甜菜细胞质雄性不育系的细胞色素氧化酶及ATP酶活性均表现为不育系低于其保持系；过氧化物酶和过氧化氢酶活性则表现为不育系高于其保持系，这反映线粒体内外末端氧化酶活性的高低可能与胞质雄性不育有一定关系；赤霉素含量表现为胞质雄性不育系低于其保持系。     

MiR156 and its Target Gene TBCC in Flower Development of Gossypium harknessii Cytoplasmic Male Sterile Line and its Maintainer

This study aimed to analyze the expression level and relationship between miR156 and its target gene TBCC (Tubulin binding Cofactor C) in buds of Gossypium at different developmental stage in a cytoplasmic male sterile(CMS) line and its maintainer line, to clone the full-length cDNA of the TBCC gene, and to determine the possible role of the TBCC gene in pollen development. Real-time RT-PCR showed that the expression levels of miR156 gradually increased with the development of pollen between the CMS line and the maintainer line. The expression of GhTBCC was strikingly complementary with the expression of miR156 in the maintainer line, but showed very low expression levels in the CMS line, which demonstrated that TBCC is related to male sterility. The full-length cDNA sequence of TBCC was cloned from the buds of the maintainer line, and the gene was named as GhTBCC. The CDS of GhTBCC is 1713 bp and encodes a predicted protein of 570 amino acids with a predicted molecular weight of 62.79 kDa. Conserved TBCC and CARP domains were observed in the predicted protein sequence. GhTBCC showed 81 %, 80 %, and 77 % sequence similarity to the TBCC protein sequences of Populous trichocarpa, Ricinus communis, and Arabidopsis thaliana, respectively.     

甜菜细胞质雄性不育系与其保持系线粒体DNA的RAPD分析

本文对甜菜线粒体DNA的提取方法进行了改进,在不需密度梯度离心条件下即可获得高纯度的DNA。优化了甜菜线粒体的RAPD的反应条件,对细胞质雄性不育甜菜的不育系及其保持系的线粒体DNA(mtDNA)进行了RAPD(随机扩增多态DNA,randomly amplified polymorphic DNA)分析,结果表明：甜菜细胞质雄性不育系和保持系线粒体DNA之间存在丰富的多态性。