全国部分地区H9亚型禽流感病毒分子流行病学和遗传变异分析

旨在了解2020—2021年间全国部分地区H9亚型禽流感病毒(H9-AIV)的分子流行病学和遗传变异情况,因此从全国部分地区采集到10 336份临床样本进行了H9-AIV包括核酸检测、病毒分离、HA基因测序和遗传变异等方面的分析。病原核酸检测结果显示,AIV-H9阳性率为16.1%(1 665/10 336),白羽肉鸡中的检出率最高,商品肉鸡检出率高于蛋鸡。本研究获得920株H9-AIV分离株,其中464个代表性毒株的遗传进化分析显示,所有分离株全部位于h9.2.4.5分支,且均为典型低致病性AIV,与WJ57毒株核苷酸和氨基酸同源性分别为92.2%～99.9%和89.6%～99.8%;结合关键氨基酸位点分析,这些分离株逐步向哺乳动物适应性和气溶胶传播方向发生变异。以上数据表明,H9-AIV分离株进一步增强了对哺乳动物的感染力且传播力不断加强,因此持续监控其检出和变异对家禽健康养殖、人类健康至关重要。     

H9N2亚型禽流感病毒流行病学及其疫苗的研究进展

禽流感(avian influenza AI)是由A型流感病毒引起的一种高度接触性传染病。H9N2是A型流感病毒的1个亚型,其谱系复杂,流行范围广,已经成为我国AI的主要亚型。尽管我国自1998年就开始进行H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的防疫,但目前其疫苗株与流行株的抗原性已经出现了较大的差异。带毒野禽的迁徙不仅使H9N2AIV防控难度加大,而且使AI的流行不断复杂化;活禽交易市场为AIV重排以及跨种传播提供了有利的条件。此外,H9N2AIV感染谱在不断扩大,不仅感染哺乳动物,甚至已经感染了人群;因此,有必要重新认识H9N2AIV的兽医学和公共卫生学意义。现就H9N2AIV近年在我国的流行情况及其疫苗的研究进展作一综述。     

我国部分地区H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传进化分析

于2008～2013年从江苏、山东、河南、河北等地分离鉴定出45株H9N2亚型禽流感病毒,采用PCR扩增分离株HA基因,并进行HA基因测序、核苷酸同源性分析及遗传进化分析.同源性比较结果显示:45个毒株的HA基因与我国现有疫苗株的HA基因核苷酸同源性为89.1％～94.4％,其中与HP株和F98株的HA基因核苷酸同源性分别为91.3％～94.4％和89.1％～92.0％.遗传进化分析结果显示,分离株的HA基因均属于欧亚谱系A/DK/HK/Y280/97-like分支亚系,证明当前我国大部分地区的H9N2亚型禽流感病毒在同源疫苗的免疫选择压力下,其HA基因与现有疫苗株相比已发生了较大的遗传漂变.     

2017年我国部分地区h9.4.2.5分支H9N2亚型禽流感病毒全基因序列分析

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)h9.4.2.5分支近年在我国广泛流行,为了解其分子特征及变异特点和进化规律,对从2017年我国不同地区分离到的10株H9N2亚型AIV进行了全基因序列测定及分析。结果表明:10株H9N2亚型AIVHA裂解位点均没有连续的碱性氨基酸插入,属于低致病性。遗传进化分析表明:10个分离株的HA基因均属于h9.4.2.5分支,NA基因均处于Y280-like分支;6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、NS、M)与H5、H7亚型高致病性AIV处于同一分支,有可能发生不同程度的基因重配。     

3株H9N2亚型禽流感病毒HA基因变异分析

对近10年来在同一地区分离到的3株H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因进行扩增和序列分析,探讨H9N2亚型流感病毒变异情况.3个毒株的HA基因全长1 683bp,编码560个氨基酸;其裂解位点均为R-S-S-R,属于低致病力毒株;推导的HA基因氨基酸序列均含7个相同的潜在糖基化位点,受体结合位点为禽源性流感病毒特异性序列,左侧臂氨基酸均为NGQQG,右侧臂均为GTSKA.3个分离株与参考株核苷酸与氨基酸同源率均较高,仅有一些非关键位点突变.它们均属欧亚种系,与A/Duck/Hong Kong/Y280/97代表株亲源关系较近.研究结果从分子水平上证明H9N2亚型禽流感病毒近年来未发生较大变异.     

我国部分地区禽流感病毒流行株的分子流行病学调查

为了解近年来禽流感病毒在我国部分地区家禽中的流行情况,深入阐明我国禽流感病毒流行株的HA和NP基因的进化关系及遗传进化过程,本研究采用RT-PCR方法,对我国广西、河北、湖南、河南、山东等地采集的病料进行检测,并对其中19株H5N1阳性分离株进行HA和NP基因测序,将测定的序列与参照序列对比,运用DNAStar软件对核苷酸序列进行同源性和遗传进化分析。结果表明,分离的禽流感流行株因地域的不同、时间的差异、宿主的不同,禽流感病毒HA基因核苷酸序列的同源性在96.0%⁹9.7%之间,推导的氨基酸序列的同源性在95.8%99.7%之间,推导的氨基酸序列的同源性在95.8%⁹9.6%之间;禽流感病毒NP基因核苷酸序列的同源性在68.2%99.6%之间;禽流感病毒NP基因核苷酸序列的同源性在68.2%⁹9.7%之间,推导的氨基酸序列的同源性在65.5%99.7%之间,推导的氨基酸序列的同源性在65.5%⁹9.8%之间。各分离株在遗传进化树上并不集中处于一个分枝中,而是处于遗传进化树的不同位置,说明我国禽流感病毒可能已经发生部分变异,这些禽流感病毒起源于不同的种系,但可能具有共同的祖先。     

2011年－2014年我国部分省区 H9N2亚型禽流感病毒HA 基因序列分析

本研究于2011年－2014年在我国部分省区鸡群中鉴定出49株 H9N2亚型禽流感病毒,并对所有毒株的 HA 基因进行克隆、测序及序列分析。结果表明,49个毒株的 HA 基因开放阅读框全长均为1683 bp,编码560个氨基酸。所有分离株均属于以 HK/Y280/97株为代表的 H9．4．2谱系,并明显分成2个亚分支(H9．4．2．5和 H9．4．2．6)。分离株 HA 基因核苷酸同源性在87．1％~100％之间,与疫苗株 SH/F/98株、GD/SS/94株和 SD/6/96株核苷酸同源性在89．4％~92．5％之间。对 HA 基因的推导氨基酸序列分析表明,所有分离株裂解位点附近没有连续的碱性氨基酸插入,符合低致病力毒株特征,受体结合位点为PWTN?LY 形式,受体结合位点左沿为 NGLM/QGL 形式,右沿均为 GTSKA 形式。在49个分离株中共发现10个潜在糖基化位点,但只有6个糖基化位点保守。研究表明,近年来 H9N2亚型禽流感在我国多个地区流行,2013年以后流行毒株趋势以 H9．4．2．5为主,但病毒基因仍在不断发生变异,因此需要继续加强对H9N2亚型禽流感分子流行病学的监控。     

鸽源H5N1亚型禽流感病毒株的全基因克隆及序列分析

根据已知禽流感病毒(AIV)的8个基因序列设计合成11对特异引物,通过反转录-聚合酶链式反应技术,分别成功扩增出鸽源H5N1亚型的全基因序列,将其分别克隆到pMD18-T载体后进行序列测定.同时将8个基因片段与GenBank发表的相应序列进行比较,绘制各基因的进化树.结果表明所克隆到的8个片段均包含相应病毒基因的完整开放阅读框架,长度分别为1 730、1 371、1 542、2 322、2 330、2 233、1 020、884 bp核苷酸,分别编码568、450、499、757、759、716、351、230个氨基酸.该毒株有7个潜在糖基化位点;在HA裂解位点附近有6个碱性氨基酸序列插入,符合高致病力禽流感病毒的特点,该毒株与参考毒株的序列比较分析结果表明分离株基因具有多样性.     

野鸭源H6N1亚型禽流感病毒全基因的克隆及序列分析

扩增、克隆H6N1亚型禽流感病毒(AIV) A/ mallard/ Sanjiang/275/2007(M-275)的全基因序列,进行序列分析,并探讨该病毒的进化特点.设计特异性引物,扩增克隆2007年从三江自然保护区野鸭身上分离到的H6N1亚型AIV,测序后进行序列分析.同源性分析发现,M-275与H6亚型和N1亚型AIV同源性最高,说明M-275为H6N1亚型.其裂解位点为PQIETR↓G,无连续碱性氨基酸的插入,说明M-275属于典型的低致病性毒株.通过序列比对,M-275的HA基因与2000年以后北美以及中国地区分离到的H6亚型AIV同源性在97％以上,与HA基因同源性最高的毒株为A/northern pintail/Alaska/44202-143/2006 (H6N1)和A/northern pintail/Alaska/44204-158/2006(H6N4),与NA基因的核苷酸同源性最高的毒株是A/mallard/ON/499/2005(H5N1),推测M-275的NA基因片段来自于该病毒谱系.进化分析结果显示,HA基因与美国、日本、中国等国家和地区流行的N1、H2、N4、N8和N9等亚型毒株处于同一分支;NA基因与美国、日本等国家和地区流行的H2、H5、H6、H11、H3等亚型毒株处于同一分支;PB1基因与美国、日本等国家和地区流行的毒株处于同一分支;而PB2、NP、M以及NS基因则与日本、韩国、香港和中国地区的病毒株处于同一分支;PA同中国地区和澳大利亚、马来西亚、瑞典等国家的毒株处于同一分支.M-275毒株基因组构成来源复杂,NA基因和NP基因分别与野鸭源的H5N1和HIN1等毒株同源性很高,表明H6亚型禽流感病毒也在不断的发生重排,值得深入研究.     

鹅源H5N1亚型禽流感病毒株HA基因的克隆与序列分析

本研究对1株鹅源H5N1亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因进行了扩增、克隆及序列测定。结果表明：所扩增的片段长1707bp，包含完整的开放阅读框架，编码568个氨基酸。该毒株裂解位点的氨基酸序列为RRRKKR，具有高致病性的分子特征；该毒株有6个潜在糖基化位点；受体结合位点的氨基酸分别为YWIHELY，其左侧壁氨基酸为SGVSSA，右侧壁为NGQSGR。该毒株与国内外一些参考毒株的HA基因序列比较，核苷酸同源率为76.8％～98．1％，氨基酸同源率为85．7％～97．4％，属于欧亚种系。     

一株H9亚型禽流感病毒HA基因的遗传变异分析

对2006年采集的1份禽流感病鸡组织进行RNA抽提后,采用A型流感病毒通用引物进行禽流感病毒HA基因的扩增,并进行T载体克隆及测序,获得了一株H9亚型禽流感病毒的HA序列。序列分析表明,此血凝素基因的ORF由1683个核苷酸组成,编码560个氨基酸,属A／Chicken／Beijing／1／94系。将其在GenBank中Blasl后发现,其与1株珍珠鸡H9N2病毒（A／Guineafowl／Hongkong／NT101／03）和1株鸡H9N2病毒（A／Chicken／Hongkong／AP45／03）的同源性和分值最高,同源性可达97％,较中国2006年前的分离株进化相对稳定,核苷酸的变异不大。切割位点的序列为-PARSSRGLF-,仍属于低致病力毒株。但Gln226Leu的变异,使其成为一种潜在的可感染人的禽源毒株。     

H5N1亚型禽流感病毒核蛋白基因的克隆及分子进化分析

用RT-PCR法,以1株h5N1亚型禽流感病毒RNA为模板,扩增了NP全基因cDNA.将cDNA克隆于pMD18-T载体,并对其进行测序.测序结果表明所克隆的1542个核苷酸的片段包含了核蛋白完整阅读框架,其中编码区为1497个核苷酸,编码498个氨基酸.将其序列与6株A型流感病毒NP基因序列进行比较,各毒株之间NP基因核苷酸序列同源性为92.5%～95.9%,编码的氨基酸同源性为97.0%～98.4%.本研究通过分子进化分析揭示了各毒株间的亲源关系.     

不同源性H5亚型禽流感病毒株HA基因序列分析

本研究对1株鹅源和一株鸽源的H5N1亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因进行扩增、克隆和序列分析。结果表明，所扩增的片段长均为1707bp，包含完整的开放阅读框架，编码568个氨基酸；该毒株有7个潜在糖基化位点；在HA裂解位点附近有6个碱性氨基酸序列插入。两毒株间核苷酸与氨基酸的同源性均为96．7％。该毒株与参考毒株的序列比较分析结果表明：核苷酸同源率分别为95．3％～99％；氨基酸同源率分别为95．1％～99.3％。     

2013—2014年H7亚型禽流感病毒遗传进化分析

对2013—2014年15株不同来源的H7亚型禽流感病毒国内分离株进行了基因组测序与遗传进化分析。结果显示,15株H7亚型禽流感病毒具有遗传多样性,可分为2种亚型:13株为H7N9亚型,2株为H7N3亚型。HA蛋白裂解位点附近氨基酸分析显示所有H7亚型流感分离株均为低致病性毒株。基因组遗传进化分析显示,13株H7N9亚型禽流感病毒均与2013年人源分离株同源性较高,但具有2种遗传学特性,13株病毒的PB2、PA、HA、NP、NA、M和NS基因高度同源,而PB1基因来源于2个不同分支。2株H7N3亚型流感病毒与国内鸭源分离株同源性较高。15株H7亚型禽流感病毒PB2蛋白均未出现627K、701N等与哺乳动物适应性相关的氨基酸变异。13株H7N9亚型禽流感病毒HA裂解位点附近氨基酸(EIPKGR/GL)与人源H7N9病毒一致,且HA蛋白和M2蛋白分别具有与哺乳动物适应性和金刚烷胺耐药性相关的标志性变异,而2株H7N3亚型禽流感病毒未出现上述氨基酸变异。     

H5N1亚型禽流感病毒新疆株NS基因的克隆和序列分析

根据已发表的H5N1禽流感病毒NS基因全序列设计了1对引物，对4株禽流感病毒新疆株的NS基因进行了RT—PCR扩增，并将其克隆到pMD18-T载体上，分别获得了全长为817、851、854、854bp的全基因序列。序列分析结果表明，新疆毒株间的核苷酸同源性为97．8％～98．9%，氨基酸同源性为96．5％～98．7％，与广东、香港和东南亚等不同地区的11个毒株比较，同源性为90．0％～99．4％；与来自野禽、猪等不同种类的11个流感毒株比较，同源性为81．4％～99．3％。系统进化树分析表明，新疆株独立分支。     

我国与周边国家H5N1亚型禽流感病毒血凝素演变分析

基于2008~2012年我国及周边国家禽流感病毒血凝素(HA)核酸在线BLAST,及MEGA5.1Bate4选取病案样本比对等方法,对我国与周边国家(地区)H5N1亚型禽流感病毒血凝素演变进行了研究。结果显示,各样本均具有与禽受体特异性结合的特性,但部分样本在对病毒受体结合特异性有影响的位点发生氨基酸替换,2010年和2011年我国家禽和人样本HA抗原表位关键位点氨基酸与参考疫苗有较大变异,部分样本与中国香港和越南野鸟样本抗原匹配较高;回顾性分析表明,我国人和家禽在面临原有病毒株感染的同时增加了感染境外来源病毒株和中国香港、青海野鸟毒株的风险,应加强对H5N1亚型禽流感病毒变异和境外毒株向我国境内传播的监测,及时研制新的疫苗以应对新毒株类型。     

2011年我国部分地区猪瘟病毒分子流行病学研究

本研究对2011年我国部分地区养猪场采集的疑似猪瘟病料组织样本209份,分别用FQ-RT-PCR和RT-nPCR两种方法检测猪瘟病毒(CSFV)。结果FQ-RT-PCR检测出55份猪瘟阳性,RT-nPCR检测出53份阳性,2种方法符合率达96.3%。将53份阳性产物进行测序及同源性分析,显示这53份流行株均为2.1基因亚型。所分离的流行株与疫苗株(HCLV)和石门株(SM)的核苷酸同源性分别为79.4%~83.1%和79.4%~82.5%。研究结果表明,目前我国部分地区的养殖场仍有猪瘟病毒的存在,且以2.1亚型为主;流行株与疫苗株同源性仍高于77.4%,结合免疫攻毒试验,说明目前使用的猪瘟疫苗依然有效。     

H5N1亚型禽流感病毒起源及演化关系的探讨H5N1亚型禽流感病毒起源及演化关系的探讨

通过综述感染人类的H5N1亚型高致病性禽流感病毒起源及演化关系，表明感染人的A／Hongkong／97（H5N1）株及目前流行的高致病性禽流感病毒可能起源于禽源的A型流感病毒株（A／Goose／Guangdong／1／96）。自1996年以来，H5N1亚型禽流感病毒的基因型经Gs／Gd，A，B，C，D，E，V，W，）X0—X3，Y，Z和Z^＋不断的演化为目前流行的基因型Z。高致病性禽流感病毒（H5，H7和H9亚型）在禽，特别是水禽体内的重组或重配而相互传播，并随候鸟的迁徙而传播不易消灭，H5N1亚型的禽流感在不同地区的不断暴发与流行已严重威胁着养禽业的发展及人类的健康，需要进行长期监控。     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因序列的初步分析

禽流行性感冒 ,简称禽流感 (ＡｖｉａｎＩｎｆｌｕｅｎｚａ ,ＡＩ)是由正黏病毒科、流感病毒属、Ａ型流感病毒所引起的禽类的感染和/或疾病综合症 ,被国际兽疫局确定为Ｉ类烈性传染病 ,并被列入国际生物武器公约动物传染病名单。ＯＩＥ根据对家禽所造成的疾病程度 ,将禽流感划分为高致病禽流感ＨＰＡＩ和低致病禽流感ＬＰＡＩ。Ｈ9Ｎ2亚型禽流感病毒 ,属低致病力禽流感病毒。 1994～ 1999年期间 ,该亚型病毒在全球呈广泛流行趋势 ,且危害日趋严重。中国在 1994年 ,由陈伯伦等[1] 人报道 ,在广东某鸡场的蛋鸡中分离到我国第 1株Ｈ9Ｎ2亚型禽…     

一株H3亚型野鸟源禽流感病毒血凝素基因序列分析

为了解野鸟在传播禽流感病毒中的作用,贵州省动物疫病预防控制中心定期从威宁草海采集候鸟和留鸟的新鲜粪便,用RT-PCR方法检测病原核酸。监测到1份流感病毒阳性样本,对其血凝素(HA)基因进行了克隆和测序。结果发现,该病毒属于H3亚型,所获得的HA基因1794 bp,包含有完整的阅读框架,编码566个氨基酸残基,包括6个潜在的糖基化位点,遗传进化分析结果显示其属于欧亚禽源分支。另外,HA受体结合位点上的氨基酸序列具有禽源特有的保守性,分别是154A、206E、210L、241G、242Q和244G。推导的HA裂解位点有典型的低致病特征(PEKQTR/GLF)。结果表明,贵州省野鸟中存在低致病性H3亚型禽流感病毒。