抗真菌γ-硫堇蛋白Rs-afp1基因导入苹果获得转基因植株

以“皇家嘎啦”(RoyalGala)苹果(Malus domestica Borkh)为试材,在绿色组织特异表达的菠菜核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶的激活酶(Rubisco-activase)启动子(RCAP)驱动下,将抗真菌γ-硫堇蛋白(γ-thionin)Rs-afp1基因和uidA(gus)基因导入白化茎段外植体,获得了nptⅡ抗性植株.转化体经PCR和Southern     

三个韧皮部特异性启动子在转基因烟草中表达的比较研究

用共整合的luc基因校正嵌合gus基因表达活性的方法对3个韧皮部组织特异性启动子在转基因烟草中的表达进行了比较，用杨树树皮储藏蛋白基因启动子（BP）、竹节花黄斑驳病毒启动子（CP）、笋瓜韧皮部蛋白2基因启动子（SP）以及CaMV35S启动子（35SP）构建了含有启动子-gus以及35SP-luc两类嵌合报告基因的植物表达载体，并通过农杆菌介导法转化了烟草植株，GUS活性的组织化学定位结果表明，3个启动子皆驱动gus报告基因在转基因烟草的叶、叶柄和茎的韧皮部组织中特异地表达，BP和SP在烟草根部是组成型的，通过比较转基因植株的校正GUS活性，确定了3个启动子的相对活性为BP和CP的活性相近，而SP约为CP的84%，结果表明BP和SP是韧皮部组织特异性的强启动子。     

中棉光诱导基因Gacab 启动子的克隆及其功能分析

利用加接头法，从金华中棉(Gossypium arboreum)中分离获得了捕光叶绿素a／b蛋白复合体基因Gacab编码区5′上游的调控序列1009bp，命名为Gacab P，与公布的其它植物cab启动子序列比较，没有明显的同源性。将GacabP和197、504、779bp的5′端缺失体分别与gus(uid A)基因融合，构建植物表达载体。用Gacab P：：gus转化烟草(Nicotiana tabacum cv．NC89)，GUS组织化学分析发现Gacab P驱动gus基因在转基因烟草的叶片表达。在暗培养的转基因烟草叶片中Gacab P不表现活性，而光能够诱导gus基因的表达，表明Gacab P是一种光诱导型启动子。用基因枪轰击水稻愈伤组织，结果显示，Gacab P及3种不同长度的缺失体均可驱动gus基因的瞬时表达，以504bp的活性最高，瞬时表达水平明显高于35S启动子，197、779和1009bp的表达减弱，由此推测-197～-1bp为Gacab基因的基本启动子，-504～-197bp间包含正调控元件，-1009～-504bp间包含负调控元件。     

水稻rbcs基因启动子的克隆及结构功能分析

利用PCR法克隆了水稻日本晴来源的核酮糖-1、5-二磷酸羧化酶小亚基基因（rbcS）5’上游调控区，命名为Posrbcs。将Posrbcs与gus基因融合，并通过农杆菌介导转入水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性进行定性与定量分析，结果表明，Posrbcs启动子可驱动gus基因在转基因水稻植株的叶片、叶鞘、茎杆及颖壳中特异性表达，在胚乳中不表达。然后构建不同长度片断的Posrbcs的5’端缺失体，分别与gus构建融合基因，转入水稻中。对转基因植株GUS活性定量分析结果显示， Posrbcs片段愈短，GUS活性愈低；进一步的光诱导试验结果显示，光能明显提高gus基因表达活性，并且随着Posrbcs片段缩短，Posrbcs中的I box、GT1结合位点、GATA box、T box 等光诱导相关元件的缺失会造成在不同时间段的光诱导活性降低以及光诱导表达时间后移。凝胶阻滞试验证实Posrbcs序列中的这些光诱导相关元件有相应的核蛋白的结合。     

Expression Pattern of Ａ Recombinant Phloem-specific Promoter from Pumpkin in Transgenic Potato Plants

以本实验室构建的重组南瓜(Cucurbita moschata)韧皮部特异启动子dENP构建了植物表达载体pBdENP。利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA44O4介导转化马铃薯(Solanum tuberosum)品种Favorita，经过抗生素筛选，共获得转pBdENP和对照pBI121的抗卡那霉素马铃薯再生植株106株。通过PCR初步筛查，筛选出65株为转基因阳性植株。通过Southern blot对部分植株进一步分析,确证外源gus基因已经插入到转基因马铃薯植株的基因组中，插入拷贝数在1个或2个以上。对这些转基因马铃薯植株进行GUS染色结果表明, dENP和CaMV35S启动子一样均能驱动gus基因的表达，前者仅在马铃薯的韧皮部内特异表达，而CaMV35S启动子驱动的gus基因为组成型性表达。GUS酶活力测定结果进一步表明dENP和CaMV35S启动子驱动gus基因表达水平没有明显区别。以上结果证明dENP启动子驱动的外源基因在马铃薯中也具有韧皮部特异而高效表达的特征，从而可用于马铃薯抗病、抗蚜虫转基因研究。     

三倍体毛白杨PtDRG02基因启动子的瞬时表达分析

本研究利用PCR技术从三倍体毛白杨（（Populus tomentosaxP．bolleana）xP．tomentosa）基因组DNA中扩增获得抗病相关PtDRG02基因的一个启动子区（包括其下游5’端非编码区序列）,命名为Ptp01。以β-葡萄糖苷酸酶（舢）基因为报告基因,构建了PtDRG02基因启动子植物表达载体Ptp01／gus。以根癌农杆菌EHA105及LBA4404感受态细胞为受体,转化植物表达载体Ptp01／gus进行瞬时表达,并对启动子进行了功能活性分析,结果表明该启动子能够驱动gus报告基因在毛白杨叶片组织中表达,但表达强度弱于花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子。     

Prd29A启动子在小麦中的诱导表达活性及大肠杆菌海藻糖合成酶基因的转化

以gus基因为报告基因，通过瞬时表达测定了Prd29A诱导型启动子在小麦愈伤组织中的诱导表达活性。结果表明，Prd29A-gus基因的表达水平可在不同浓度NaCl盐的胁迫条件下得到显著提高。由此证实，Prd29A启动子在小麦中具有较强的诱导表达活性。在此基础上，将Prd29A诱导型启动子驱动下的大肠杆菌海藻糖合成酶基因（otsA）采用花粉管途径导入目的小麦品系，经PCR筛选、Southern鉴定及转化后代海藻糖含量的测定，获得了一批otsA转基因植株及株系，为进一步选育耐盐抗旱的转基因小麦新品系奠定了基础．     

Leafy启动子控制下5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶基因(CP4EPSPS)的表达增强芽对草甘膦的抗性

抗草甘膦基因在转基因植物体内持续高效表达,不但增加植物代谢压力,有的甚至改变植物形态造成植物的生长发育畸形。为了减少转基因植株的代谢负担和能源浪费,从拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)基因组中克隆了Leafy组织特异性启动子替代CaMV35S启动子,用其驱动改造后加二磷酸核酮糖羧化酶(rubisco)小亚基引导肽的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶(CP4EPSPS)基因,同时调控报告基因gus的编码区构建植物表达载体p3300-Leafy-gus和p3300-Leafy-CP4EPSPS,嵌合基因经农杆菌(Agrobacterium)介导转化烟草。稳定表达后经GUS组织染色分析表明,Leafy驱动的gus表达仅局限在植物茎尖和幼叶部分,转基因植株成熟的叶片、茎部和根系均未能检测到GUS活性。草甘膦试验分析表明,Leafy驱动的CP4EPSPS的转基因植株幼芽部位有草甘膦抗性。结果表明,Leafy启动子驱动CP4EPSPS表达增强植株芽端对草甘膦的抗性。     

拟南芥低温诱导cor15a基因的启动子克隆及在转基因马铃薯中的表达

利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)品种Columbia的基因组中扩增出低温诱导基因cor15a的启动子片段并插入克隆载体。序列分析表明，克隆的启动子长900bp，与目前已经发表的启动子序列完全一致。将此启动子插入pBI121的gus基因及NOS终止子上游构成表达载体pLB，通过直接法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，并转化马铃薯(Solarium tuberosum)获得转化再生植株。再生植株PCR检测和PCR-Southern鉴定结果证明，cor15a基因启动子已经成功地转入到马铃薯植株基因组中。GUS组织染色证明拟南芥cor15a启动子在马铃薯中也同样具有低温诱导表达的能力。     

含有融合标记基因和LoxP／FRT位点的植物表达载体构建及应用

本研究利用化学合成法合成了包含pCAMBIA0390左右边界T-DNA和LoxP／FRT（LF）位点的DNA片段Ⅰ,利用SacⅡ和SphⅠ酶切位点,去除了pCAMBIA0390左右边界T—DNA和多克隆位点之间的序列,然后连接DNA片段Ⅰ和载体片段,构建了植物表达载体pGM323-LF-enTP。随后,再合成含有适合在单予叶植物中表达的由玉米Ubi-1启动子驱动的融合标记基因（Bar：：gus）和水稻actin-1启动子驱动的助抗虫蛋白基因（Cry1A6）表达元件的DNA片段Ⅳ,在pGM323～LF—enTP的基础上,利用5以Ⅰ和PstⅠ位点构建了同时含有LF位点、Bar：：gus以及Cry1Ab基因表达元件的表达载体pGM626-LF—ABt。利用含有pGM626-LF—ABt的农杆菌遗传转化烟草和玉米,以草丁膦作为抗性筛选剂,非转化细胞得到了有效抑制,快速获得了转基W植株,利用GUS组织化学检测和RT—PCR分析了转基因植株中标记基因的表达,结果表明pGM626-LF—ABt可以用于农杆菌介导的单、双子叶植物遗传转化。本研究为培育安全抗虫转基因植物奠定了基础。     

抗真菌γ -硫堇蛋白Rs-afp1基因导入丰产梨获得转基因植株

梨童期长，自交不亲和，杂合程度高，进行常规杂交育种改良相当困难。而采用遗传转化手段，将期望性状引入现有品种，不会出现基因的大量重组，也避开了童期的干扰。该技术已使许多作物获得了抗病的基因工程植株。本实验通过采用光诱导绿色组织特异表达的启动子Rubisco-acfivase(RCAP)驱动，将对真菌具有广普抗性的Rs-afp1，基因导人，建立了梨农杆菌转化体系，为进一步选育抗病品种奠定基础。     

番茄果实特异表达启动子ESp1的克隆及表达

E8启动子是番茄果实成熟乙烯响应性基因E8的启动子区。这个区域中存在着一些响应乙烯以及在果实发育和成熟过程中起调节作用的顺式作用元件，调节E8基因在果实成熟过程中表达（Deikmaa et al．，1998）。本研究根据GenBank中E8基因的启动子区序列设计引物，从番茄基因组中克隆了该启动子，构建了番茄果实特异表达载体，并通过RT-PCR和gus基因检测了该表达载体的果实特异表达活性。     

水稻OsWRKY19基因启动子的分析

利用PCR技术从水稻(Oryza sativa)秀水11品种中克隆了转录因子WRKY19编码区5'上游大小为1 404 bp的调控序列，命名为OsW19p, 将它和长度为105、378、977、1 106、1 205和1 306 bp的5'端缺失体分别与gus基因融合，构建植物表达载体。用根癌农杆菌介导法将所有载体转化水稻，GUS组织化学分析和荧光测定结果表明：(1)培养基中的2,4-D强烈抑制 gus基因在愈伤组织阶段的表达；(2) gus基因在转基因植株的根、茎、叶和花中均有表达，在花粉和成熟种子中无表达，在种子萌发时胚有表达，在苗期种子根和不定根及它们的侧根均有表达但根尖无表达，成熟期根部只有侧根有表达；(3)除p105以外OsW19p (p1404)和其它5个不同长度的缺失体均可驱动gus基因在转基因苗叶片中的表达，p1205活性最高，p977和p1306的活性减弱,由此推测-1404～-1306 bp和-1205～-977 bp间包含正调控元件，-1306～-1205 bp和-977～-378 bp间包含负调控元件。     

基因枪法转化棉花胚性愈伤组织获得转基因植株

以川棉（Gossypium hirsumm，)239胚性愈伤组织为受体，用基因枪轰击法导入外源基因，获得了经Gus组织染色和PCR扩增鉴定的转基因植株。以gus基因瞬时表达蓝点数为评价指标，考察了影响基因枪转化棉花胚性愈伤组织的几个因素，结果表明：使用碱裂解法提取和PEG法纯化的质粒DNA，优于试剂盒大量提取的DNA；当轰击压力为10．7MPa时，轰击距离6或9cm较好；轰前经1-2周培养的愈伤组织较佳。实验还表明，玉米的Ubi启动子在棉花胚性愈伤组织中有启动活性。轰击后直接用100mg/L的卡那霉素进行筛选优于梯度筛选。     

一个新的马铃薯patatin classⅠ基因的cDNA在烟草中的表达及其酶活性

摘要：将马铃薯(Solanum tuberosum )块茎特异蛋白patatin classⅠ基因cDNA与CaMV 35S启动子融合，构建了植物表达载体pBSSP。用电激法将表达载体导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404，然后转化烟草(Nicotiana tabacum )叶片获得再生植株。经PCR、PCR-Southern、Northern杂交和蛋白质检测，证明patatin classⅠ基因cDNA已整合到烟草基因组中并在转基因植株中转录和表达。酯酰水解酶（lipid acylhydrolase, LAH）活性分析显示，转基因烟草植株的叶片中LAH活性明显提高。     

农杆菌介导的水稻双基因共转化初步研究

利用农杆菌介导法将分别位于不同质粒上的gus基因和nptⅡ基因按照1︰1和1︰3的浸染浓度混合共转化粳稻品种鄂宜105和中花12种子胚诱导的愈伤组织,结果从43棵经潮霉素反复筛选的再生植株中获得21棵共转化植株。经PCR分析表明2个基因的共转化率分别为47.37%和60.00%。Southern Blot和Western Blot检测发现gus基因已经整合到水稻基因组中并且表达。遗传分析证实外源基因在T1中大多以孟德尔方式进行遗传。分析了影响转化率的几个因素如浸染菌量比例和品种之间的关系以期进一步提高共转化的效率。     

小金海棠Fe（II）转运蛋白基因在拟南芥突变体中的功能互补研究

MxIrt1基因是从小金海棠（Malus xiaojinensis Cheng et Jiang）中克隆得到的Fe（II）转运蛋白基因，具有“ZIP基因家族”的保守功能域，推测该基因与苹果中铁的转运吸收有关。本研究构建MxIrt1基因的植物表达载体pCWIrt，通过农杆菌介导转化拟南芥IRT1突变体irt1-1。GUS染色以及Southern杂交检测结果显示，MxIrt1基因已经整合到拟南芥基因组中。在缺铁胁迫条件下，转基因植株提高了突变体irt1-1的耐缺铁能力，表明MxIrt1基因参与了铁的吸收。     

激发子隐地蛋白基因介导的烟草抗病性研究

摘要：从隐地疫霉（Phytophthora cryptogea）中克隆cryptogein（Crypt）激发子基因。针对病原菌侵染和Crypt基因的特点，选用能在根、茎、叶等的表皮细胞中特异性表达的、弱组成型并受病原菌诱导的水稻(Oryza sativa )苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）的启动子；同时为了使表达的cryptogein蛋白能分泌到细胞外，更好地与植物细胞膜受体互作，在Crypt基因前还融合了病程相关蛋白PR1b的信号肽; 然后将此融合基因构建于植物表达载体CHF3中。通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefancens)介导的叶盘转化法转入烟草(Nicotiana tabacum )。经卡那霉素抗性筛选获22株再生植株，PCR检测都为阳性，部分植株的Southern杂交结果表明,Crypt基因已以低拷贝（1～2个）整合到烟草基因组中。抗病性测定结果表明,转化植株对烟草黑胫病菌(P. parasitica var. nicotianae )、赤星病菌(Alternaria alternata )和野火病菌(Pseudomonas syringae pv. tabaci )的抗性均有提高。     

大白菜BrWRKY33基因上游调控序列的克隆及其功能研究

根据大白菜EST和基因组序列,利用PCR技术从大白菜品种龙白二号（Brassica rapa subp.pekinensis cv.LongbaiⅡ）基因组中克隆转录因子基因BrWRKY33起始密码子上游大小1755bp的调控序列。然后,构建5＇端缺失突变体,与gus基因融合,构建植物表达载体。将载体转化拟南芥（Arabidopsis thaliana）哥伦比亚生态型（Columbia ecotype）,进行植物组织GUS化学染色分析。结果表明,BrWRKY33密码子上游-1755～-315区域存在的多个W-box元件可能与该基因表达的负调控相关,-315bp区域含有BrWRKY33基因转录必需的基本元件。对接种软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora subsp.carotovora）后不同时期的植株进行染色,发现该病原菌侵染使转基因植株gus基因表达量增加,表明BrWRKY33基因在植物对软腐病抗性反应中具有一定的作用。     

一个水稻鞘叶特异表达启动子的克隆及功能鉴定

目前在基因工程中应用最广的为组成型启动子,但是组成型启动子驱动外源基因在各组织中持续恒定的表达可能引起植物发育迟缓等问题,因此克隆来源于作物本身的组织特异型启动子逐渐受到重视。根据本实验室基因芯片数据库找到一个在水稻绿色组织特异表达的基因(TIGR Locus:LOC_Os06g21110),用 PCR 技术从水稻明恢 63(Oryza sativa L ssp. indica)基因组中克隆得到其上游启动子命名为GSP (green-tissue specific promoter),长度为1 951 bp。将GSP与带有β-glucuronidas(gus)报告基因的的植物表达载体连接,经农杆菌(Agrobacterium)介导转化水稻中花11 (O. sativa L ssp. japonica)成熟种子胚诱导的愈伤组织,获得转基因水稻阳性植株,通过组织化学染色法证明,GSP是一个叶鞘和叶片特异表达启动子。对其进行5’端缺失分析,构建了7个缺失载体,通过验证缺失载体的表达谱,证明592 bp长度的启动子就足以维持鞘叶特异表达模式,初步鉴定出了该启动子的核心功能区域。本研究所克隆出的GSP 启动子是一个未曾报道过的鞘叶特异表达启动子,基因工程中利用此类启动子可以在改良水稻性状的同时减少对水稻生理方面的副作用,有良好的应用价值。