饲料产品及饲料添加剂中沙门氏菌的检测

目的：检测饲料及饲料添加剂中沙门氏菌的污染情况。方法：利用PCR技术对动物源性饲料产品、植物性饲料产品、微生态制剂以及酶制剂等共计207批样品进行了沙门氏菌的检测。结果：共检出沙门氏菌8株，其中动物源性饲料检出率为11．4％，微生态制剂原料检出率为11．1％，微生态制剂检出率为10％，酶制剂检出率为8．3％，配合饲料检出率为1．25％，植物源性饲料和饲料粉尘检出率为0。结论：沙门氏菌在饲料产品及饲料添加剂中的污染情况不容忽视。     

鸡白痢沙门菌套式PCR检测方法的建立及初步应用

为了建立一种快速、高效和简便的鸡白痢沙门菌套式PCR检测方法,根据沙门菌侵袭蛋白基因invA的高度保守区域,利用Primmer 5.0软件设计2对特异性的套式引物,以提取的沙门菌DNA为模板克隆invA基因,将其连入T载体并计算拷贝数作为套式PCR的模板,在对反应条件进行优化的基础上,建立最佳的套式PCR反应条件,确定其上、下游引物用量分别为0.3μL,套式PCR的第1次退火温度为57.4℃,第2次为53.5℃。应用该方法对已构建好的不同浓度的标准阳性质粒作为模板进行检测,其灵敏度为102拷贝数/20μL,远高于常规PCR的106拷贝数/20μL。用建立的套式PCR方法对从新疆石河子某鸡场采集的25样品进行检测,与传统的诊断方法比较符合率达95.00%。建立的鸡白痢沙门菌套式PCR检测方法具有快速、可行、特异性强、准确率高等特点,为鸡沙门菌病的早期诊断和研究提供了技术支撑。     

PCR技术检测饲料中沙门氏菌的应用研究

用聚合酶反映(PCR)技术检测饲料中沙门氏菌。对已知被沙门氏菌污染的动物饲料的培养物均能检出阳性,说明此方法对检测饲料中沙门氏菌具有特异性高、灵敏、快速等特点,适用于快速和准确地检测饲料中沙门氏菌的需要。     

饲料中志贺氏菌的PCR快速检测方法的建立

为建立饲料中快速检测志贺氏菌的有效方法,本研究根据志贺氏菌(Shigella)侵袭性质粒抗原H基因(invasion plasmid antigen H,ipaH)设计了一对引物,PCR扩增片段长度为386bp。通过对引物的特异性检测发现,4株志贺氏菌的PCR结果均为阳性,12株非志贺氏菌的检测结果均未扩增出特异性片段。PCR对志贺氏菌纯培养物的检测灵敏度达120cfu/ml,检测快速、便捷。该方法操作简单、检验周期短、特异性和灵敏度高,能够快速地实现对饲料中志贺氏菌的检测和监控。     

EMA与PCR结合检测沙门氏菌方法的研究

为了建立一种快速区分样品中沙门氏菌的死细菌与活细菌的检测方法,将叠氮溴化乙锭（EMA）与PCR技术相结合。以沙门氏茵的invA为靶基因,以沙门氏菌的纯培养细胞做模板进行扩增,并进行灵敏度、特异性、曝光时间及EMA浓度试验。结果显示,灵敏度为14CFU／mL,最佳曝光时间为2min,当EMA的浓度小于18μg／mL时．EMA对活菌靶基因的扩增没有明显的抑制,而终浓度为1μg／mL的EMA,能有效抑制lxlosCFU／mL沙门氏菌死菌的扩增。EMA—PCR能有效降低沙门氏菌检测过程中的假阳性。     

白鱼粉饲料中沙门菌的检测

沙门菌是饲料中常见的肠道杆菌,能够引起食源性动物败血症,从而间接危害人类的健康,是一种重要的人畜共患病原菌.试验依据常规分离鉴定技术,通过细菌的分离、生化反应和血清学鉴定,对白鱼粉饲料样品中是否含有沙门菌作出了准确的检测,排除了饲料由于污染而可能导致的危害.结果显示,其中一份样品已受到沙门菌污染,不能作为饲料使用.     

PCR扩增invA基因特异性检测沙门氏菌

建立了扩增invA基因检测沙门氏菌的PCR方法。对收集的50个血清型123株沙门氏菌及7种27株非沙门氏菌进行PCR,2％琼脂糖电泳检查,结果所有沙门氏菌都扩增出了300bp的特异性产物,非沙门氏菌都未扩增出此目的条带。产物的特异性由slot blot杂交进一步证实。通过电泳判定结果,该法可检出扩增体系中10pg染色体DNA及10~2cfu的纽波特沙门氏菌50029。为下步克隆而设计的两个酶切点（Bam HI,Eco RI）对引物的特异性没有影响。本研究为沙门氏菌的检测提供了简洁、敏感、特异的新方法,同时为克隆invA基因做属特异性探针打下了基础。     

鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立

根据鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌的rfbS基因在第237和第598位碱基的不同，设计和合成了等位基因特异性PCR引物，建立了快速检测鸡白痢沙门菌的PCR方法，并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示，该PCR方法能够特异性地鉴定鸡白痢沙门菌，检测灵敏度达100PgDNA。对35个经常规方法鉴定的鸡白痢沙门菌分离株应用等位基因特异性PCR方法进行鉴定，鉴定出33株鸡白痢沙门菌，符合率为94．3％。表明，建立的等位基因特异性PCR方法能够准确而快速地鉴定鸡白痢沙门菌。     

应用复合PCR方法检测沙门菌的研究

参照文献报道的沙门菌Repeat se和hisJ基因片段的引物序列，设计并合成了2对引物，对沙门菌属和非沙门菌属的标准菌株及分离菌株进行了复合PCR扩增反应。结果，沙门菌PCR产物均出现199bp与495bp的特异性DNA扩增条带．而非沙门菌均未出现扩增条带，证明这2对引物具有沙门菌属特异性。将提取的沙门菌DNA做梯度稀释，测定该复合PCR体系的敏感度。结果表明，此体系可检出10^3CFU／mL菌液提取的DNA模板。应用上述方法，对进境鱼粉阳性样品进行了检测，均出现阳性结果。本研究表明，复合PCR是一种特异、敏感、快速的沙门菌检测方法，可应用于口岸系统鱼粉、肉骨粉的日常检测。     

沙门菌19个毒力岛标志性基因的PCR检测

建立沙门菌19个毒力岛标志性基因检测方法,了解沙门菌中毒力岛的分布情况。通过比对验证挑选出45个毒力基因作为19个毒力岛标志性基因,建立PCR检测方法,并对伤寒、肠炎、鼠伤寒及贝坎道夫沙门菌进行分布情况研究。19个毒力岛上45个标志性基因分别在伤寒、肠炎、鼠伤寒及贝坎道夫沙门菌得到验证,PCR扩增产物与预期扩增产物一致,电泳条带典型,无非特异扩增条带及杂带出现。45个标志性基因在伤寒、肠炎、鼠伤寒及贝坎道夫沙门菌检出率分别为75.56%、75.56%、66.67%和42.22%。本研究建立的45个毒力岛标志性基因检测方法具有结果准确、简单快速、费用低廉等优点,适用于沙门菌毒力岛研究及不同来源的沙门菌致病性风险评估。     

畜禽饲料中沙门氏菌的检测

2005年3～9月,对318份畜禽饲料样品进行沙门氏菌实验室检测,通过预增菌、选择性增菌和选择性分离培养及生化试验、血清学鉴定等检验,结果有4份样品检出沙门氏菌,检出阳性率为1.26%,其中3份是猪浓缩饲料、1份是鱼粉.     

荧光定量PCR快速检测食品中沙门氏菌方法的建立及初步应用

根据编码鼠伤寒沙门氏菌肠毒素stn基因的核苷酸序列设计1对引物和荧光探针，通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索，建立了检测沙门氏菌的核酸荧光定量PCR方法。对该方法的特异性与敏感性研究结果显示，该方法检测沙门氏菌结果均为阳性，而非沙门氏菌均为阴性；对带有沙门氏菌肠毒素stn基因的阳性质粒的检测敏感性为4个／μL。用该方法对人工污染沙门氏菌的鲜猪肉和鲜鸡蛋进行检测，当检样中沙门氏菌初始含菌量分别为1CFU／g（鲜猪肉）和1CFU／g（鲜鸡蛋），经过12h的增菌后，检测结果均为阳性。该方法具有简便、快速、特异性强、敏感性高等特点。此研究为食品中沙门氏菌快速检测试剂盒的研制打下了良好的基础。     

The detection and determination of potential virulence of Salmonella spp. using PCR method

The aim of this study was to prove that PCR is a very useful method to identify Salmonella strains and to determine their virulence factors by amplification of characteristic genetic markers. Investigations included 5 strains of Salmonella which were obtained from pure cultures and 1 Salmonella strain from the mixed culture. Genotypic analysis of 6 examined strains revealed the 163-bp fragment of chromosomal DNA, which is the DNA rep. ori. gene, encoding the particular genus. In all of these strains 215-bp, 203-bp and 204-bp chromosomal DNA fragments were identified as representing the stn, stpA and spaO genes that confirmed their virulence. These amplification products were identified in both pure and mixed culture from pork. Sensitive and rapid PCR method may be used not only for identification of Salmonella strains and for determination of their virulence factors but also for routine microbiological diagnostic of food pathogens.     

牛种布鲁杆菌PCR检测方法的研究

为了弥补血清学和微生物学方法检测和诊断布鲁菌病的种种不足,建立用布鲁菌BCSP31聚合酶链反应（PCR）快速检测布鲁菌病原的方法。根据编码牛种布鲁菌31 000外膜蛋白基因序列设计的一对特异性引物,扩增出预期350bp的基因片段。结果,此方法具有较高的特异性和敏感性,DNA最低检测量为0.42pg。结果表明,布鲁菌病原...     

沙门菌PCR快速检测试剂盒的研制与应用

为建立一种简单、快速、灵敏、准确的沙门菌检测方法，根据沙门菌fimY保守基因序列设计合成了1对引物，建立了快速检测沙门菌的PCR方法，并对反应条件进行优化，组装成快速检测试剂盒。结果显示，所有沙门菌均扩增出526bp的特异性条带，而非沙门菌均未扩增出任何条带。检测灵敏度达93CFU，还可检出含3CFU的样品用BP预增菌的菌液或用MM增菌后的菌液，而且稳定性良好，冷冻至少能保存12个月。采用直接菌体加入法、热裂解法、反复冻融法、CTAB碱裂解法和柱式试剂盒提取法分别提取核酸模板，结果CTAB法效果最好，但操作烦琐，而直接菌体加入法和热裂解法可以达到和柱式试剂盒提取法相同的效果，且操作简便、快速、经济、效果好。通过对临床样品的检测，证实该试剂盒具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性高等优点，值得推广应用。     

Rapid PCR detection of Salmonella in horse faecal samples

A rapid polymerase chain reaction (PCR) assay was developed for detecting Salmonella in faeces of horses and assessed on samples from horses admitted to a veterinary hospital. Direct detection was achieved by amplification of part of ompC after extraction of DNA from faeces using a spin column method to reduce the amount of inhibitory substances in samples. An internal positive control was included to detect false negative results. While the sensitivity of the PCR assay was less than culture when assessed on faeces inoculated with Salmonella, its sensitivity on faecal samples obtained from horses was much greater than culture. Salmonella DNA was detected in 40% of faecal samples using the PCR assay while Salmonella were cultured from only 2% of the samples. The PCR assay has potential for use in either routine diagnosis or for detection of the carrier status in animals.     

饲料香味剂中香味成分检测方法研究

研究通过检测条件摸索优化和样品前处理方法摸索筛选,建立气相色谱法测定饲料香味剂中香味成分乳酸乙酯、乙基麦芽酚、乙基香兰素的含量。样品用丙酮提取,极性毛细管色谱柱分离,气相色谱-火焰离子化检测器检测,外标法定量。3个组分在0.02~5.0 mg/ml浓度范围内均具有良好的线性关系,相关系数均大于0.999 9,平均回收率在94.1%~98.7%,相对标准偏差RSD在1.8%~2.4%。该方法准确可靠,操作简便,使用仪器设备普及率高,易于推广,在饲料添加剂质量检测中具有实际应用价值。     

Validation of an open-formula, diagnostic real-time PCR method for 20-h detection of Salmonella in animal feeds

A comparative study of a 20-h, non-commercial, open-formula PCR method and the standard culture-based method NMKL 187, for detection of Salmonella, was performed according to the validation protocol from the Nordic organisation for validation of alternative microbiological methods (NordVal) on 81 artificially or naturally contaminated animal feed samples. The PCR method is based on culture enrichment in buffered peptone water for 16 ± 2 h followed by a magnetic beads based semi automated DNA extraction and real-time PCR analysis, including an internal amplification control. The limit of detection (LOD50) was found to be 7.19 and 7.24 CFU/sample for the PCR method and NMKL187, respectively. A very good correlation between results obtained by the two methods was found (Cohen's kappa=0.92). The relative accuracy, relative sensitivity and relative specificity were found to be 97.5%, 102.0% and 96.6%, respectively. This method is the fastest open PCR based analysis protocol for detection of Salmonella in feed samples. Implementing rapid methods such as the one validated in this study can speed up Salmonella testing of feed for food-producing animals.     

貂圆环病毒PCR检测方法的建立

根据本实验室获得的貂圆环病毒Cap基因序列设计了1对特异性引物,建立了PCR检测方法。利用该方法对猪细小病毒、貂肠炎病毒、犬细小病毒、猪圆环病毒、貂阿留申病毒,大肠杆菌等病原核酸进行扩增,均无条带出现,表明该方法具有较高的特异性;敏感性实验表明,该方法最低能检测到病毒核酸量为10μg/L。利用所建立的PCR方法检测采自大连的72份样品,结果阳性率为59.7%,表明貂圆环病毒在大连水貂养殖场的感染率较高。     

动物源性食品中沙门氏菌快速检测技术的应用研究

采用自动酶标免疫测试仪(m in i-VIDAS)与PCR技术,对上海地区的174份鸡蛋、580份原料牛奶、253份猪肉、248份牛肉和58份虾仁样品进行了沙门氏菌检测。与国标法对比,M in i-VIDAS的敏感性和特异性达100%和98.8%,PCR法的敏感性和特异性均为100%。同时上述动物源性食品中均检出沙门氏菌,说明存在被沙门氏菌污染的可能,应引起足够重视。