甘蔗乙烯受体Sc-ERS启动子的克隆与序列分析

【目的】克隆甘蔗乙烯受体Sc-ERS基因启动子序列,分析Sc-ERS基因启动子序列的作用元件。【方法】采用基于热不对称交错式PCR原理的染色体步移技术,从甘蔗ROC22基因组DNA中克隆Sc-ERS基因启动子序列,利用启动子预测软件PlantCARE和PLACE在线工具对Sc-ERS启动子序列的作用元件进行预测。【结果】克隆获得Sc-ERS启动子序列1410 bp, 该序列与玉米ERS25、ERS14核苷酸同源性分别为82%和80%。PlantCARE 在线分析结果表明,该序列具有启动子基本作用元件TATA-BOX和CAAT-BOX,还含有参与光响应元件、干旱诱导MYB 结合位点、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件、胚乳表达顺式调控元件、热胁迫响应元件等。【结论】从甘蔗基因组DNA中克隆获得乙烯受体Sc-ERS基因上游1410 bp的启动子序列,该序列含有多个特异性调控元件,推测Sc-ERS基因的表达可能受生理周期、激素、干旱、光照等因素调控。     

甘蔗乙烯受体Sc-ERS启动子的克隆与序列分析

【目的】克隆甘蔗乙烯受体Sc-ERS基因启动子序列,分析Sc-ERS基因启动子序列的作用元件。【方法】采用基于热不对称交错式PCR原理的染色体步移技术,从甘蔗ROC22基因组DNA中克隆Sc-ERS基因启动子序列,利用启动子预测软件PlantCARE和PLACE在线工具对Se-ERS启动子序列的作用元件进行预测。【结果】克隆获得sc．ERS启动子序列1410bp,该序列与玉米ERS25、ERS14核苷酸同源性分别为82％和80％。PlantCARE在线分析结果表明,该序列具有启动子基本作用元件TATA．BOX和CAAT—BOX,还含有参与光响应元件、干旱诱导MYB结合位点、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件、胚乳表达顺式调控元件、热胁迫响应元件等。【结论】从甘蔗基因组DNA中克隆获得乙烯受体Sc-ERS基因上游1410bp的启动子序列,该序列含有多个特异性调控元件,推测sc．ERS;~因的表达可能受生理周期、激素、干旱、光照等因素调控。     

棉花乙烯受体基因的电子克隆及生物信息学分析

[目的]电子克隆并分析棉花乙烯受体基因（Ethylene Receptor,ETR）。[方法]利用生物信息学方法,以毛果杨的ETR基因家族序列为基础,电子克隆棉花乙烯受体基因开放阅读框,并对序列进行氨基酸组成、功能域、二级结构、疏水性、信号肽及系统进化等预测分析。[结果]通过电子拼接,共获得该基因家族的2个棉花ETR基因GhETR1和GhETR2。2个基因开放阅读框长度分别为2 289 bp和2 226 bp,编码含762和741个氨基酸残基的肽链。经生物信息学分析发现,两基因分属于ETR2和ETR1亚家族。N端有典型的跨膜区,含有ETR蛋白的保守域GAF、H isKA、HATPase-c和REC。GhETR1与毛果杨XP_002315717、XP_002311669相似性较高,GhETR2与毛果杨XP_002299688、XP_002327419相似性较高。[结论]该研究结果为进一步研究棉花GhETR基因在棉纤维发育中的作用奠定了基础。     

芒果乙烯受体ETR1和ERS1基因的克隆及序列分析

[目的]克隆芒果乙烯受体ETR1和ERS1基因(MiETR1和MiERS1),并进行生物信息学分析,为研究乙烯受体在芒果成熟和衰老过程中的调控机制提供理论参考.[方法]以芒果为材料,应用RACE技术扩增MiETR1和MiERS1基因的cDNA序列,并应用生物信息学方法对其编码的氨基酸序列进行预测分析.[结果]克隆获得的MiETR1基因cDNA序列全长2570 bp,开放阅读框(ORF)2220 bp,编码739个氨基酸;MiERS1基因的cDNA序列全长2171 bp,ORF 1890 bp,编码629个氨基酸;GenBank登录号分别为KY002681和KY002682.MiETR1和MiERS1蛋白均为含跨膜结构的非分泌型疏水蛋白,属于乙烯受体ETR1家族成员,以Ser为主、Thr为辅的磷酸化修饰调控乙烯信号转导,均含有3个典型的模块,即GAF结构域、HisKA结构域和HATPase_c结构域,MiERS1蛋白较MiETR1缺少REC结构域.不同物种ETR1和ERS1蛋白的氨基酸序列具有高度保守性,MiETR1和MiERS1均与甜橙(Citrus sinensis)和克莱门柚(Cit-rus clementina)的ETR1和ERS1蛋白亲缘关系较近,但二者分别聚在两个不同的分支上,表明两个蛋白存在一定的遗传分化.[结论]乙烯受体基因在芒果成熟和衰老过程中发挥调控作用.     

果子狸苦味受体Tas2R2基因的克隆与序列分析

采用PCR和克隆测序方法首次从果子狸基因组中获得一全长为1 037 bp的苦味受体Tas 2R2基因DNA序列.该序列含有完整的1个外显子(无内含子),大小为915 bp,编码304个氨基酸残基.其蛋白质等电点为9.84,分子量为34.87 ku.高级结构预测显示果子狸Tas2R2蛋白由4个胞外区、7个跨膜区和4个胞内区组成,该蛋白上含有N糖基化位点、丝氨酸磷酸化位点、色氨酸磷酸化位点各3个和酪氨酸磷酸化位点1个.亲水性/疏水性分析表明,果子狸Tas2R2蛋白质为疏水性蛋白,其亲水性区段所占比例较小.种间同源性比较显示,果子狸Tas 2R2基因与猫、犬、大熊猫、牛、马、黑猩猩和小鼠的eDNA序列同源性分别为93.0％、89.4％、89.9％、85.4％、85.9％、84.6％、72.2％;氨基酸序列同源性分别为88.8％、81.1％、83.2％、75.9％、77.8％、75.5％、61.3％.果子狸、猫、犬、大熊猫、牛、马、黑猩猩和小鼠的Tas 2R2基因编码序列构建的进化树表明果子狸与猫的亲缘关系最近.     

甘蔗丝氨酸/苏氨酸激酶基因的克隆及序列分析

以福农28甘蔗品种为实验材料,电子克隆设计引物,克隆得到了甘蔗丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase,STK)基因的cDNA片段。采用RACE技术克隆获得了甘蔗叶STK基因cDNA的5'及3'端序列,长度分别为750和1000bp。5'、3'端序列与中间片段重叠延伸后总片段长为1133 bp,其中5'UTR为54 bp,3'UTR为254 bp,包含完整的ORF为825 bp,共编码274个氨基酸。开放阅读框架查询器(Open Reading Frame Finder)确定其为丝氨酸/苏氨酸激酶,通过预测(//cn.expasy.org/tools)该蛋白质分子质量为29.9052 ku,理论等电点为6.36。将其基因序列与NCBI中其他植物的STK进行比对,与高粱、玉米、水稻、短柄草和大麦的相似性分别为97%、94%、89%、89%和88%。     

猪IRGC基因的克隆与序列分析

[目的]对猪IRGC基因进行序列分析,为进一步研究其功能奠定基础。[方法]采用EST信息和测序相结合的方法分离了猪IR-GC基因,并与人、牛、犬和猩猩IRGC基因进行序列相似性分析。[结果]获得了1 558 bp的cDNA序列,其登录号为EU703776,与人、牛、犬和猩猩IRGC基因的序列分别有86%、90%、91%和84%的相似性。序列分析表明,该基因编码的464个氨基酸与人、牛、犬和猩猩的相似性分别达到了90%、93%、95%和90%。[结论]成功提取了猪IRGC基因,其具有人、牛、犬和猩猩类似的结构和功能。     

四棱豆纤维连接蛋白基因部分序列克隆与分析

利用已报道的FNDC基因序列的保守区域设计引物,用所设计的引物扩增四棱豆FNDC基因的部分序列,将序列提交GenBank,获1个登录号FJ176925.通过对该序列的同源性比较分析发现,该序列与目前数据库中山豆根YP_001511236序列具有明显的同源性.该序列在112～651 bp片段上包括了1个开放性阅读框,起始密码子为ATG,终止密码子为TGA.将ORF处的氨基酸序列继续进行生物信息学的分析,对其进行的1级结构分析和2级结构分析中,表明该序列是一个酸性蛋白,亲水性较弱,疏水性较强,信号肽序列为第23位～第45位,亚细胞定位最大可能性为定位于细胞外.含有N型糖基化位点,蛋白激酶C磷酸化位点,酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,C-末端锚定微体信号,纤维素结合结构域.主要以α-螺旋,不规则盘绕和延伸链为该蛋白最大量的结构元件,β-折叠散布于整个蛋白质中.     

番鸭IFN-α基因的克隆与序列分析

从经免疫的番鸭外周血分离淋巴细胞，经PHA刺激培养后提取总RNA，采用RT－PCR的方法，按照GenBank中序列号为X84764鸭I型IFN（DIFN1）基因设计引物，成功扩增出番鸭IFN基因，命名为MDIFN－α，包含编码MDIFN－α成熟蛋白全部核苷酸序列。DIFN1开放阅读框架（ORF）有576个核苷酸，编码191个氨基酸，其中切除信号肽的IFN－α为成熟DIFN1，共有486个核苷酸组成，编码161个氨基酸。MDIFN－α（含有不完整的信号肽）与X84764的核苷酸同源性为97．7％，推导氨基酸同源性为95．7％，结果显示，MDIFN－α可能为鸭I型IFN一个新的亚型。     

蓝狐褪黑激素受体1A基因的克隆及序列分析

根据已知的蓝狐MTNR1A基因部分序列和狗的MTNR1A基因序列,借助Primer5.0引物设计软件,结合PCR引物设计优化条件,设计、合成引物。用基于PCR的96孔板筛选方法从蓝狐脾脏cDNA文库中分离获得阳性克隆,其序列与已知的蓝狐MTNR1A基因部分序列有100%的同源性,与已报道的狗、马、猕猴等动物的MTNR1A的cDNA分别有98%、88%、85%以上的同源性,推测该cDNA为MTNR1A的cDNA。蓝狐MTNR1AcDNA的获得,为进一步研究Mel配体-受体间的相互作用和生物功能提供了条件。     

中国实验小型猪朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已发表的猪朊蛋白基因（PRNP）序列设计特异性引物，进行PCR直接扩增，得到了中国实验小型猪（CEMP）的朊蛋白基因（PRNP），将其克隆到pGEM-TEasy载体中。序列分析表明上述CEMP的PRNP基因ORF区全长为774bp，编码257个氨基酸的前体蛋白，分子质量约为28．3ku，其PRNP序列与已发表的猪PRNP序列（L07623）差异微小，仅在第4位氨基酸残基处有变异（Ser→Asn）；绘制CEMP与其他15种属动物朊蛋白的氨基酸序列进化树发现，CEMP与多种哺乳动物朊蛋白的氨基酸序列遗传距离比较接近，与水貂最近。而与禽类朊蛋白氨基酸的遗传距离较远。     

三化螟蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的克隆和序列分析

利用RACE技术,根据已有的三化螟转录组数据,设计特异引物对三化螟的蜕皮激素受体(EcR)和超气门蛋白(USP)基因进行克隆,获得了三化螟EcR和USP基因的全长序列。EcR基因全长2857bp,氨基酸序列包括545个氨基酸。USP基因全长共2082bp,氨基酸序列包括408个氨基酸。序列比对后发现,三化螟EcR和USP基因的氨基酸序列与已报道的鳞翅目昆虫EcR和USP基因的氨基酸序列具有很高的同源性,其中与二化螟的相似性分别达到94%和97%。序列分析表明,三化螟EcR和USP序列具有昆虫EcR和USP基因的特征结构:DNA结合域和2个锌指结构。     

甘蔗转化酶抑制子(SoInvInh1)基因克隆和表达分析

采用cDNA末端快速克隆(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术,以甘蔗未成熟茎cDNA为模板克隆转化酶抑制子,命名为SoInvInh1,GenBank登录号KF575175。SoInvInh1基因的cDNA序列全长为678bp,3′-UTR长146bp。开放阅读框长531bp,编码176个氨基酸,预测分子质量和等电点分别为18.09ku和8.52。SoInvInh1不含内含子序列。预测该蛋白N端具有1个信号肽和跨膜结构,19—172位氨基酸是PMEI蛋白的保守结构域。不同物种间InvInh蛋白氨基酸序列同源性较低,但都具有4个保守的Cys位点。荧光定量PCR分析表明在甘蔗茎、叶、花序和花序轴中都能检测到SoInvInh1基因表达。在甘蔗生长的不同时期,SoInvInh1在叶中表达无明显规律。而在工艺成熟期和生理成熟前期SoInvInh1整体上表现为幼茎中基因表达量高,而老茎中基因表达量低,表明茎中该基因可能与酸性转化酶活性相关。     

猪源新城疫病毒SP13株的F基因克隆及序列分析

采用RT-PCR方法对猪源新城疫病毒(NDV)SP13株的F基因进行了扩增与克隆,并测定出F基因的核苷酸全序列,推导出氨基酸序列.F基因全长为1662 bp,单一的开放阅读框,编码553个氨基酸的长肽,裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,与弱毒株在这一区域的序列(112G-R/K-Q-G/S-R-L117)相符;F蛋白有6个潜在的糖基化位点和13个Cys残基位点,其疏水构型有3个强疏水区.通过同源率、系统发育、致病性、疏水性和抗原性等比较分析的结果表明,SP13与LaSota、Clone 30株不但同源性达到99.9%,而且在致病性、疏水性和抗原性等方面也极为相似.     

新城疫病毒河北分离株F基因的克隆与序列分析

通过RT-PCR技术扩增和克隆2003—2007年由河北省分离到的、具有一定代表性的鸡新城疫病毒分离株F基因,与GeneBank中已发表的NDV不同基因型代表株F基因相应核苷酸片段及其氨基酸序列进行比较,构建系统发育进化树并确定分离株的毒力强弱及所属基因型。结果显示,分离株在该区段没有碱基缺失和插入,但有多处点突变分散存在。分离株F基因核苷酸序列与国内外已发表毒株相应序列核苷酸同源性为80.5%~98.5%,推导的氨基酸序列同源性为77.5%~97.7%。表明目前河北新城疫的流行以基因Ⅶ型为主,同时兼有传统的基因Ⅵ型和基因Ⅱ型。     

豚鼠ESR2基因新的可变剪接体克隆及序列分析

[目的]对豚鼠雌激素受体2(ESR2)基因进行克隆及序列分析,并预测分析其编码的蛋白序列,为提高豚鼠产仔性能及其育种打下基础.[方法]根据GenBank已公布的豚鼠ESR2基因序列(登录号XM003472337)设计引物,以豚鼠卵巢组织总RNA为模板,RT-PCR扩增ESR2基因编码区序列(CDS),利用生物信息学分析其编码蛋白氨基酸的组成及理化性质、二级结构及与相关物种的同源性.[结果]克隆获得的豚鼠ESR2基因CDS长度为1650bp,编码549个氨基酸,比参照序列(XM 003472337)少54个碱基,是ESR基因新的可变剪接体,且第7外显子缺失;蛋白质二级结构预测结果表明,豚鼠ESR2成熟肽包含α螺旋、β折叠和无规卷曲3种二级结构元件,由于缺失18个氨基酸导致蛋白质结构发生变异;同源性分析结果显示,豚鼠与长尾龙猫、奥氏更格卢鼠、马、达马拉鼹鼠、裸鼢鼠、鼠狐猴、八齿鼠、猪和人的ESR2基因序列同源性分别为91%、87%、86%、91%、92%、86%、88%、92%和86%.[结论]克隆获得的豚鼠ESR2基因为新的可变剪接体,可作为研究豚鼠产仔性能及豚鼠育种重要的候选基因之一.     

北京鸭血管活性肠肽基因cDNA片断的克隆及序列分析

为从北京鸭胃肠道中扩增血管活性肠肽(VIP)基因,根据鸡VIP基因(GenBank登录号X80906),设计了一对简并引物,从北京鸭腺胃、十二指肠和空肠提取总RNA,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,将从腺胃、十二指肠和空肠中扩增出的产物克隆到pGEM-Teasy载体上,导入大肠杆菌JM109,阳性克隆经双酶切鉴定后测序,将测序结果与鸡和鹅(GenBank登录号为DQ023161)的VIP基因进行同源性比较。本试验扩增到的VIP基因与已知的鸡和鹅核苷酸序列比较,同源性分别为94.61%和94.42%,氨基酸序列同源性分别为93.75%和95.71%。本试验首次成功从北京鸭腺胃、十二指肠和空肠扩增到长度为240 bp、编码VIP的基因片断(已提交GenBank,登录号DQ200173)。     

甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)克隆及其在转基因烟草中的表达特性分析

[目的]克隆甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)并分析其在转基因烟草植株中的表达特性,为研究CIN1基因功能提供参考.[方法]克隆SoCIN1基因,利用基因重组技术构建植物正义表达载体pBI121-SoCIN1,采用叶盘法经农杆菌EHA105介导将其转化烟草品种K346.经抗性筛选和PCR扩增验证后获得转SoCIN1基因烟草植株,采用半定量PCR检测叶片SoCIN1基因的表达量,并测定叶片可溶性糖含量、CIN活性及株高(以野生型烟草为对照).[结果]克隆获得的SoCIN1基因长度为1731 bp,与GenBank已公布的SoCIN1基因(JQ312298)核苷酸序列同源性达100%,并通过构建其植物正义表达载体转化烟草.PCR扩增鉴定结果表明,SoCIN1基因已整合至烟草基因组DNA.对F0和F1代进行转基因烟草连续筛选,获得4个转SoCIN1基因烟草株系(T-1、T-2、T-3和T-4).在4个株系的叶片中均检测到SoCIN1基因的表达,其中以在T-1株系叶片中SoCIN1基因表达量最高,其次是T-3株系,最低的是T-4株系.4个株系叶片的可溶性糖含量、CIN活性及株高均高于野生型烟草,其中CIN活性显著高于野生型烟草(P<0.05,下同),且T-1株系CIN活性高于其他3株系;T-1、T-2和T-3株系叶片可溶性糖含量分别显著高于野生型烟草39.68%、19.95%和31.15%;T-1、T-2、T-3和T-4株系的株高较野生型烟草分别提高了15.57%、2.90%、5.74%和5.22%,但仅T-1株系与野生型烟草存在极显著差异(P<0.01).[结论]转SoCIN1基因烟草叶片过表达SoCIN1基因,能提高烟草的CIN活性和可溶性糖含量,促进植株生长,由此推测该基因在甘蔗生长发育和蔗糖积累过程发挥作用.     

甘蔗钙依赖蛋白激酶基因克隆与序列分析

[目的]克隆甘蔗钙依赖蛋白激酶基因(ScCDPK1),为其功能解析和育种利用打下基础.[方法]根据甘蔗cDNA文库中的CDPK基因序列信息设计引物,利用RT-PCR克隆ScCDPK1基因,并采用在线生物信息学分析软件对其推导蛋白的理化性质、跨膜结构、信号肽及保守结构域等进行预测分析.[结果]克隆获得的ScCDPK1基因完整编码区大小1650 bp,编码549个氨基酸,相对分子量61.971 kD,等电点(pI)6.78,不稳定指数35.63.同源性和遗传进化树分析结果显示,ScCDPK1基因与小麦TaCPK7基因亲缘关系最近,同源性达88%;ScCDPK1蛋白与其他已知CDPK蛋白一致,具有CDPKs家族特有的4个保守区域(可变区、蛋白激酶区、自抑制区和钙离子结合区),其二级结构主要由α螺旋(42.80%)和无规则卷曲(32.97%)构成;蛋白功能分类预测结果显示,ScCDPK1蛋白是一种阳离子通道蛋白,可能参与植物胁迫应答、信号转导和翻译调控等生物反应.[结论]ScCDPK1基因编码的蛋白与其他已知CDPK蛋白一致,具有CDPKs家族特有的4个保守区域,是一种阳离子通道蛋白.