家蚕杆状病毒载体构建及外源基因的表达

本文介绍了杆状病毒载体构建方法,分析了影响外源基因表达效率的因素,概述了近年来家蚕杆状病毒栽体在蚕体内表达外源基因产物所取得的成绩,并指出了这一系统存在的问题,提出了改进意见.     

家蚕内分泌学研究进展

家蚕内分泌学的研究从家蚕内分泌器官的实验形态学开始,到激素物质鉴定、化学结构测定、作用机理的阐明,近年进一步深入到激素的生物合成和前体加工、激素与激素载体和受体蛋白的基因分离、克隆、鉴定,并且有些研究成果已有效地应用在蚕茧生产实践上。对这一发展迅速的蚕业科技上的新兴学科,本刊原主编管守盂教授一直极为关注,一年前就亲自约请朱江同志撰写专文,并作了指点,临终前还关心此事。但未及完稿,他就辞离人世。现在发表本文,除向读者介绍这一领城的研究概况外,也以此纪念为本刊的成长与发展倾注了巨大心力的原主编管守孟教授。     

家蚕Polh+ Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的构建

为利用杆状病毒的强启动子——多角体启动子而构建的重组杆状病毒一般是多角体缺失型(polh-)病毒。为了解决家蚕生物反应器规模化生产中病毒必需经皮接种而效率低下的问题,在建立家蚕Bac-to-Bac快速表达系统的基础上,构建了能形成多角体的家蚕Polh+ Bac-to-Bac表达系统。通过该系统能够产生表达外源目的基因的重组病毒,获得的该重组病毒能在培养细胞内表达,也能通过经口添食感染表达。利用EGFP报告基因分析了该系统的表达效果,构建的重组病毒不仅有效表达了EGFP蛋白,还在细胞核中形成了大量多角体。该系统较好解决了重组病毒必需经皮接种感染的缺陷,提高了生产效率,拓宽了杆状病毒在生物杀虫剂、基因治疗等领域的应用前景。     

基于DNA载体的RNAi抑制家蚕核型多角体病毒复制

基于DNA载体的RNA i技术可以较长时间高效地抑制基因的活性。利用家蚕核型多角体病毒ie-1基因启动子,构建了在细胞内能转录形成与ie-1基因+19~+446区域互补同源的发夹状dsRNA的RNA i DNA载体。研究结果表明,该载体DNA在体外、体内均能较好地抑制家蚕核型多角体病毒在细胞中的复制。     

家蚕壳聚糖的研究进展

家蚕壳聚糖作为一种生物活性物质,有着相当广泛的用途.本文从壳聚糖的性质、制备方法着手,着重讨论了壳聚糖在蚕桑生产、医药、食品、农业、环保等领域中的应用与研究进展.     

半胱氨酸蛋白酶基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

为了探讨杆状病毒的致病机理、改善杆状病毒表达系统的表达效率 ,将来源于家蚕核型多角体病毒ZJ8株的半胱氨酸蛋白酶 (cystenineprotease,CP)基因克隆到转移载体pVL 1393上 ,获得重组转移载体pVL cp ,与线性化的Bm BacPAK6病毒DNA共转染家蚕Bm 5贴壁细胞。通过蓝白斑筛选、纯化后得到的重组病毒经PCR鉴定证明 ,cp基因已被正确导入 ,注射感染家蚕 5龄幼虫 12 0h后表达产物活性达到最高。对表达产物进行SDS PAGE及酶活力分析 ,检测到半胱氨酸蛋白酶在家蚕生物反应器中的表达 ,其表达量约为 16 0 0U/mL。     

RNAi抑制动物病毒的增殖

本文介绍了RNAi的发现及作用机理,总结了RNAi抑制A型流感病毒、口蹄疫病毒、登革热病毒和猪瘟病毒复制的机理,并讨论RNAi基础上抗病毒治疗的可能性。虽然RNAi的应用还有一定的局限性,但仍然被认为是对抗病毒感染最有效的方法之一,并具有非常光明的前景。     

昆虫杆状病毒复制的分子生物学

雷林１号桉在贫瘠丘陵地４种造林密度的林分，经６年的试验结果表明；雷林１号桉林木的生长、产量与造林密度存在着密切相亲，其中林木胸径、单株产量及保存率与造林密度呈负相关，单位面积生物量、蓄积量与密度呈正相关，４种密度中０．５ｍ×１．０ｍ密度的林分单位面积生物量最大，为其他密度林分的２．４倍－５．７倍，适于经营短伐期薪材林；１．０ｍ×２．０ｍ的造林密度的小径木占３０％，中径木占６４％，适于经营短轮伐期薪     

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人瘦素蛋白

瘦素(leptin)蛋白由肥胖基因编码,对人体能量代谢等多种生理过程起着重要的调节作用。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人瘦素蛋白基因(lep)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,并转化E.coli DH10Bac,获得重组杆粒Bacmid-lep,然后转染家蚕BmN细胞,获得重组杆状病毒。用SDS-PAGE和Western blotting方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞检测到大小约22 kD的蛋白条带,与预期的人瘦素蛋白分子质量相符。给家蚕5龄起蚕注射重组病毒液后的4～5 d出现发病症状,RT-PCR检测发病家蚕的血液中有lep基因转录,并通过SDS-PAGE和Western blotting检测到大小为22 kD的人瘦素蛋白的表达。研究结果表明,利用Bac-to-Bac表达系统能够获得含有人瘦素蛋白基因的重组杆状病毒,并且目的蛋白能在家蚕细胞及幼虫体内表达。     

表达短ie-1 dsRNA的转化细胞对家蚕核型多角体病毒的抑制作用

为了利用RNAi技术提高家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)的抗性,根据BmNPV复制必需基因ie-1设计其相应的dsRNA,构建带有ie-1 dsRNA表达盒的转基因载体piggyantiIE-Neo,结果显示:表达短ie-1 dsRNA的稳定转化Bm细胞,对BmNPV的增殖表现出抑制作用,但在病毒感染后期,由于病毒恢复增殖导致RNAi的效果被掩盖。通过反向PCR分析外源DNA片段插入基因组位点,结果显示:在转化细胞中,外源DNA可通过随机整合或按照piggyBac特定的转座位点TTAA插入细胞基因组。     

利用生物信息学方法预测家蚕核型多角体病毒基因组编码的miRNA

microRNAs(miRNAs)是长度为18～25 nt的非蛋白质编码小RNA分子,可以通过抑制有关基因mRNA的翻译从而调控机体的生长发育、疾病发生等过程。在很多病毒中发现有miRNA的存在,这些miRNA可能在病毒基因的表达以及与宿主的相互作用中发挥作用。利用vMir软件预测家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组可能编码的miRNA前体序列,对BmNPV基因组扫描分析后,得到7条能形成发夹结构的可能是miRNA的候选前体序列。以BmNPV添食感染5龄起蚕,72 h后取幼虫血淋巴提取总RNA,对这7条序列进行反转录PCR验证,其中扩增出的5条序列在BmNPV基因组中有相同的序列,推测这5条序列为BmNPV基因组编码的miRNA前体序列。进一步分析5条miRNA前体序列的发夹结构,并用反转录PCR的方法验证其成熟体序列,结果在5条miRNA前体序列共扩增出6条在BmNPV基因组中有相同序列的成熟体序列,它们分别位于不同的ORF之间,是BmNPV基因组编码的miRNA。利用在线靶基因预测程序RNAhybrid和RNA22预测到6条miRNA在BmNPV中的13个可能的靶基因,其中有6个靶基因是病毒的结构蛋白基因,2个为晚期表达因子基因,5个为未知功能基因。推测这些BmNPV基因组编码的miRNA可能与病毒感染宿主有关。     

柞蚕核型多角体病毒和家蚕核型多角体病毒的同义密码子使用模式分析

基因组中的基因和基因密码子组成不同使柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)与家蚕核型多角体病毒(BmNPV)间不能交叉感染。通过计算有效密码子数(ENc)、相对同义密码子使用度(RSCU)、GC含量、GC3s含量、密码子适应指数(CAI),比较分析ApNPV和BmNPV同义密码子使用模式差异。ApNPV和BmNPV的密码子偏好性均较弱,但二者的ENc值和GC含量差异显著;除碱基组成外,还存在其它因素影响密码子使用模式,但各影响因素的贡献率均较低,在基于密码子使用频率的对应分析中BmNPV的第1、第2向量轴贡献率均低于ApNPV;ApNPV的基因表达水平与GC含量、GC3s含量以及ENc值极显著相关(r分别为0.418、0.735、-0.628,P=0.000),而BmNPV的基因表达水平只与GC3s含量呈弱相关(r=0.214,P=0.010)。分析结果显示,ApNPV和BmNPV的密码子偏好性虽均较弱,但同义密码使用模式及其影响因素存在差异。     

家蚕核型多角体病毒及抗病育种

本文介绍了家蚕核型多角体病毒的发现、性状、复制机制以及对家蚕核型多角体病毒病的防治方法。不同的研究者用不同的材料研究了家蚕对NPV的抵抗性及其遗传规律,得到了不同的结果。我们的研究发现了高抗NPV的家蚕特优种质,探明了家蚕对BmNPV抗性的遗传规律。以306和NB为亲本,组配了近等基因系,筛选了与常染色体上抗NPV基因连锁的RAPD分子标记,并以NB为素材,育成了一批新种质。     

利用双色荧光观察分析重组家蚕杆状病毒对昆虫细胞及蚕体组织的感染

尝试将红色荧光蛋白(RFP)作为昆虫表达体系的分子标签,克隆了rfp基因的读码框,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将该基因插入家蚕核型多角体病毒(BmNPV)中,获得重组杆状病毒BmNPV-rfp。对家蚕细胞的感染表明,rfp适于在昆虫细胞中表达,在显微镜下红色荧光很明显,说明RFP可以作为杆状病毒表达的分子标签。BmNPV-rfp和另一种插入绿色荧光蛋白基因gfp的家蚕重组杆状病毒BmNPV-gfp混合感染家蚕细胞和幼虫的实验表明,二者的荧光很少在同一细胞中发生重叠,说明昆虫细胞大多只感受1次同一来源的病毒。BmNPV-rfp、BmN-PV-gfp与AcNPV混合感染Sf21细胞的结果也证明了该推断,并且还显示AcNPV可以协助BmNPV来源的病毒基因在Sf21细胞中表达以及协助病毒增殖或产生杂交病毒,但尚未明确其机制。     

家蚕滞育分子机制的研究

简述了有关家蚕滞育机制的分子生物学研究进展。家蚕的胚胎滞育是由环境条件和遗传性支配的。二化性蚕品种在胚胎中期和晚期经受高温和长光照 ,其结果是下一代胚胎滞育。不同的环境信息被神经分泌细胞“解读”和“受纳”。在特定的环境条件信息下 ,神经分泌细胞产生和分泌滞育激素 (DH)。滞育激素进入卵内 ,调节和建立滞育卵专一的内部环境。其特征是 ,滞育卵中发生有关糖原和山梨醇转换的一系列酶促反应 ,从而实现进入滞育、解除滞育等生理过程。     

家蚕浓核病毒“镇江株”基因文库的构建

家蚕DNV—DNA经限制性内切酶Sau3A部分酶解,与经BamHI酶解后的载体PWR13连接,转化E·coli,通过遗传标记筛选、酶解电泳分析,证明BmDNV基因组的绝大部分已被克隆.     

家蚕丝心蛋白轻链基因的克隆及品种间的比较

从蚕品种浙蕾×春晓的蛹中提取基因组DNA ,用PCR的方法克隆出家蚕丝心蛋白轻链基因 3’端 ,包含第 2到第 7外显子区 5 5kb的DNA片段。经测序并与蚕品种J- 139丝心蛋白轻链基因相同区域的比较表明 ,蚕品种间丝心蛋白轻链DNA序列同源性为 95 6 % ,氨基酸序列同源性为 98 8%。     

利用家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统在BmN细胞中可溶性表达PRG-1蛋白

杆状病毒Bac-to-Bac表达系统由于操作简便等优点,被广泛应用于外源蛋白的表达。利用新构建的家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac系统可溶性表达一个大分子质量的融合蛋白———piwi相关基因编码蛋白PRG-1。为了提高目的蛋白的表达量,对重组病毒感染剂量及产物收获时间进行优化,并利用GST亲和层析纯化融合蛋白。结果表明在家蚕卵巢培养细胞BmN中表达的重组GST-PRG-1是可溶性蛋白;最佳的感染条件是病毒粒子对BmN细胞的感染复数(MOI)=1,并在感染后96 h收获细胞。试验结果表明,新构建的家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统可用于大分子蛋白的可溶性表达。     

家蚕miRNA及其在抗病毒机制中的作用

miRNA广泛存在于真核生物中,并在多种生理过程中发挥着重要的作用。本文简要介绍了家蚕miRNA及其在抗病毒机制中功能作用的研究进展。开展家蚕miRNA在家蚕抗病毒作用机制的研究,不仅有助于全面了解家蚕miRNA的功能及其调控机制,而且对于促进家蚕病毒病的早期诊断、防治和抗病育种具有重要意义。