白斑综合征病毒江苏分离株变异区和缺失区基因的序列比较

为了解白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)在养殖克氏原螯虾(Procambarus clarkii)中的感染流行情况和分子流行病学特征,以及探讨不同病毒株间的遗传进化差异,2008年7月至2010年6月在江苏各主要克氏原螯虾养殖产区共采集了83份样品,应用环介导等温扩增技术(LAMP)检测42份样品为病毒感染阳性,阳性率达50.6%。在此基础上考虑地理和时间因素选取了兴化、盱眙等地的6份样品,PCR扩增、克隆了样品中所携带病毒的变异区和缺失区基因并对其进行了测序。分析结果显示,在变异区除兴化毒株为1 829 bp之外,其余各分离株间差异微小,均在1 440 bp左右;而在缺失区各毒株大小均为384 bp,且核苷酸序列完全一致。随后将各分离株序列与GenBank已公布的毒株做进一步的序列比较分析,结果表明在江苏境内流行的兴化毒株与其余毒株间存在明显差异,在遗传上相距较远,并且推测WSSV变异区和缺失区可能是各自独立进化变异的;同时,缺失变小的病毒基因组更易于适应宿主和环境的变化。     

2017年中国部分地区白斑综合征病毒高变异区的序列分析

白斑综合征病毒(WSSV)自暴发以来给全球范围内的对虾养殖产业带来了巨大的损失。为了解我国凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖区WSSV的流行变异情况,选取2017年中国部分地区的42个WSSV阳性样本,对ORF14/15、ORF23/24、ORF75、ORF94和ORF125共5个可变区进行PCR特异性扩增,分析其序列的缺失变异和重复单元(Ru)中单核苷酸多态性的变化。研究结果显示,在ORF14/15的扩增中共出现4种缺失片段;ORF23/24只出现11945bp的缺失片段;ORF75扩增中,总RUs数目为3、4、9,其中45bp的RUs在12、27、80位点发生多核苷酸多态性;ORF94的RUs数目为6,其各重复单元在48位发生单核苷酸多态性;ORF125的RUs数目为4、6、7不等,其各重复单元分别在20、27、50、53、61位发生碱基突变。研究结果表明,2017年样本中,WSSV在中国大部分地区均出现一定程度的缺失变异,其中部分可变区表现出缺失情况的稳定性,某些可变区的重复单元数目及SNP表现出地区的差异性以及不稳定性。     

中国对虾几个产卵场群体携带白斑综合征病毒状况调查

白斑综合征可以导致养殖对虾短时间内大面积死亡,是迄今为止对虾养殖业面临的最大挑战。本试验采用巢式PCR法对2001年采自黄渤海的中国对虾几个产卵场群体进行白斑综合征病毒检测,旨在较全面地了解黄渤海野生中国对虾携带病毒状况。各群体的阳性检出率分别为：朝鲜半岛南海岸群体55％;渤海湾群体35％;辽东湾群体94．7％;海州湾群体47．4％。结果显示,中国对虾几个产卵场群体均不同程度地携带白斑综合征病毒。辽东湾产卵场群体阳性检出率明显高于其他群体,推测人工孵化苗种放流、海湾的地理和水质条件与中国对虾的WSSV感染率相关。而中国对虾野生群体携带病毒对于对虾养殖业的影响是不容忽视的,笔者认为,只有从无特异病原(SPF)及抗特异病原(SPR)对虾养殖群体的建立着手才能从根本上避免由于对虾携带病毒而可能导致的病毒性疾病的暴发。同时,应该重视海区污染的治理,减少病毒病暴发的诱因。本试验建立了快速检测WSSV的PCR方法,1pg病毒核酸仍可检测到,为白斑综合征病毒病的防治及早期诊断提供了有效的手段。     

中国对虾杂交优势对自然感染白斑综合征病毒的抗病力分析

中国对虾杂交优势对自然感染白斑综合征病毒的抗病力分析=Analysis of the resistance of heterosis in Fenneropenaeus chinensis to natural infection with white spot syndrome virus ［刊,中］/李素红（中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛 266071),张天时,孟宪红,孔杰//水产学报,—2007,31(1).-68～75 一个包括42个全同胞家系的中国对虾选育群体,荧光标记后每个家系各取40尾健康个体混养,自然发病并确认感染白斑综合征病毒(white spot-syndrome virus,WSSV)。发病1周后将所有个体取出,统计各家系的存活率,并对活体利用巢式聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)进行WSSV检测。对存活率进行分析,结果显示：4个家系的存活率在60％以上,7个家系的存活率在20％以下;存活率与第一次扩增阳性率、第二次扩增阳性率呈不显著负相关。第一次扩增阳性率与第二次扩增阳性率呈极显著正相关。结合两次扩增的阳性率分析得出：青岛野生群体内自交产生的一个家系和韩国群体养殖家系与乳山野生群体杂交产生的一个家系在抗病力上显著优于其它家系;经独立样本t检验表明,群体间交配组合的存活率差异不显著,因此家系选育可能是进行抗WSSV品种选育的重要途径。多重比较结果发现：韩国群体养殖家系(♂)与乳山野生群体(♀)杂交后代的存活率(56.20%±8.75%) 显著高于韩国群体养殖家系自交后代(22.50%±2.50%) (P<0.05),说明该杂交后代在抗WSSV方面有一定程度的杂种优势。而韩国群体养殖家系 (♂)和乳山野生群体(♀)的杂交后代所表现的杂种优势(26.95)与其反交后代(3.85)差异显著。图3表5参15 关键词：中国对虾; 巢式PCR; 白斑综合征病毒 E-mail:kongjie@sina.com     

白斑综合征病毒的体外增殖研究

用10-1～10-6浓度白斑综合征病毒(WSSV)梯度稀释液感染原代培养的中国对虾血细胞，利用相差显微镜连续5d定时观察了血细胞的死亡情况；用10-3浓度病毒液感染培养的血细胞不同时间和10-1～10-8浓度病毒液感染培养的血细胞10d，通过WSSV的混合单抗和过氧化物酶(HRP)联二抗进行免疫吸附检测被感染血细胞内的病毒。结果显示，10-1～10-2浓度病毒液感染的血细胞明显缩小，有死亡现象，可见细胞碎片，细胞数目逐渐减少，细胞碎片聚集成堆；10-3～10-4浓度的病毒液感染的血细胞明显缩小，细胞聚集成堆，但无明显死亡，较10-2浓度病毒液感染的血细胞出现细胞病变时间明显延长；10-5～10-6浓度病毒液感染的血细胞在5d内无明显的细胞病变。血细胞在接种10-3浓度病毒液后，细胞内病毒量在第7d达到最大值。10-1～10-8浓度的病毒液感染血细胞10d后，被感染细胞内的病毒量增加。     

卤虫携带白斑综合征病毒的研究

卤虫是是,蟹苗种培育的关键动物性饵料,查清其能否携带白斑综合征病毒,对培育健康苗种至关重要。2002年7月至10月,自盐田中取野生卤虫,经暂养后选20尾抱卵雌虫,每尾置1个烧杯中,投喂单胞藻,产卵后取出亲体;20d后,每个烧杯中取5尾子一代个体,利用巢式体外DNA扩增技术对亲体和子一代成体进行WSSV病毒检测,检测结果显示：卤虫中可扩增出特异性的,与引物设计吻合的DNA片段;DNA测序分析表明,扩增片段的DNA序列与白斑综合征病毒序列一致;野生卤虫携带白斑综合征病毒的阳性率为58%,实验条件下野生卤虫后代的阳性率为43%,同一家系中,亲代与子代携带病毒的情况不完全一致,不能确实白斑综合征病毒可否通过繁殖,在卤虫世代间进行垂直传播,研究结果表明：卤虫很可能是白斑综合征病毒的携带者,苗种培育和养殖期间投喂卤虫可能造成虾,蟹感染白斑综合征病毒,卤虫检疫是培育健康苗种的关键措施。     

抗白斑综合征病毒(WSSV)感染途径研究进展

白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV),是引起养殖对虾大规模死亡的病原。在过去的10年中,各国学者不断地寻找预防和控制WSSV感染的方法及途径。本文主要介绍了中和抗体与噬菌体展示单链抗体、免疫增强剂、重组蛋白疫苗和灭活疫苗、遗传育种、RNAi等几种方法的研究现状,为进一步开发抗WSSV药物和饵料,更有效地防治WSSV及相关科研提供参考。     

白斑综合征病毒(WSSV)提取物中43 kDa蛋白来源的MALDI-TOF分析

将纯化的WSSV粒子蛋白经SDS-PAGE分离后,对图谱中出现的43kDa蛋白进行质谱分析,发现该蛋白不是WSSV基因组编码,是来自其宿主的蛋白成分,与肌动蛋白有很高的同源性。提示该蛋白的有无及含量多少与纯化病毒粒子的状态有很大关系,可以作为纯化WSSV完整性的参考指标。     

防治对虾白斑综合征病毒(WSSV)的主要措施

对虾白斑综合征病毒(wh ite spot syndrom e virus,W SSV)是迄今为止危害最为严重的一种对虾病毒,发病对虾3~10 d死亡率可达到100%[1]。该病毒自1992年爆发以来,已在世界范围内传播开来,每年给对虾养殖业造成巨大经济损失,至今仍未得到完全控制,成为目前对虾养殖业可持续发展的     

对虾白斑综合征病毒vp28基因的表达及其与血细胞的结合

根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因vp28的序列,设计合成引物,PCR扩增得到vp28基因,成功构建重组表达载体pBAD/gIIIA-VP28并转化大肠杆菌E.coli.用L-阿拉伯糖在37℃诱导重组基因工程菌,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,显示有与预期大小31kDa相符合的目的蛋白.荧光显微镜方法分析显示,表达的VP28可与克氏原螯虾血细胞结合.结果表明,在合适的培养条件下,构建的重组表达载体pBAD/gIIIA-VP28不仅能够表达vp28 基因,而且表达的VP28具有很高的抗原结合活性.     

中国对虾对白斑综合征病毒的类免疫反应与验证

对中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)能否产生类免疫保护作用进行了初步探讨。将健康的中国对虾接种经不同辐照强度γ射线灭活的白斑综合征病毒(white wpot wyndrome virus,WSSV),连续投喂接种20 d后,对其存活个体进行抗WSSV性能测试,检验其存活情况。结果显示,至216 h实验组(射线辐照剂量分别为5 kGy、10 kGy、15 kGy和20 kGy)存活率分别为45.5%、54.2%、68%和65.4%,存活对虾的病毒携带量分别为(14.0±11.9)、(14.1±4.3)、(24.5±15.0)和(15.1±7.8)copies/ng DNA,死亡对虾病毒携带量分别为(2.1±2.0)×105、(5.2±4.4)×105、(3.8±4.4)×105和(6.2±7.7)×105copies/ng DNA,阳性对照组存活率为20%,其存活和死亡对虾病毒携带量分别为(24.7±7.4)×105copies/ng和(5.8±6.9)×105copies/ng DNA。以上结果说明,中国对虾可能存在类免疫保护作用,而且通过接种经γ射线灭活的WSSV能够提高对虾后续抗感染能力。研究结果旨为采用免疫学手段预防对虾白斑综合征提供参考。     

白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28基因在毕赤酵母中的表达

白斑综合征病毒(whitespotsyndromevirus,WSSV)是危害东南亚及北美洲沿岸养殖对虾的重要病原。近十年来,国内外对该病毒的形态结构、基因组全序列、宿主范围、传播途径、致病性和组织细胞特异性等作了大量的研究[1-7],并已确定该病毒的侵染与其囊膜蛋白vp28有关[8]。实验根据已发表的白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28基因序列[9]设计一对引物,通过PCR扩增出该囊膜蛋白的基因片段。将该片段连接到毕赤酵母表达载体pPICZ上,在大肠杆菌中筛选到含目的基因的重组质粒pPICZVP28,用电穿孔法将重组质粒转化到毕赤酵母菌株X33中,获得了转化子X33 …     

对虾白斑综合征病毒免疫防治研究进展

对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是一种引起养殖对虾爆发性死亡的病毒,由于它宿主范围广、蔓延速度快以及致死率高,已经成为对虾养殖中的第一杀手,因此有效防治WSSV爆发在水产养殖中具有重要意义并极具挑战性。本文主要介绍WSSV基因组以及结构蛋白、对虾WSSV免疫机制、对虾WSSV疫苗研究进展,以及我国对虾养殖中WSSV防治措施,认为对虾WSSV疫苗将是今后对虾大规模养殖中病害防治的一种重要手段。     

白斑综合征病毒(WSSV)3种PCR检测方法的灵敏度比较

为了探讨不同PCR检测方法的灵敏度,分别利用TaqMan实时定量PCR、世界动物卫生组织(OIE)公布的巢式PCR引物(简称OIE)、黄海水产研究所种质资源与工程育种研究室(GB)设计的引物(简称GB)及2种巢式PCR对应的一步法PCR,对具有不同白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)含量的中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)样品进行检测.结果显示,当使用已知病毒含量的标准品进行检测时,TaqMan实时定量PCR方法可以检测到l0个WSSV拷贝;OIE巢式PCR与GB巢式PCR方法分别可检测到104和103个WSSV拷贝;单独使用OIE巢式PCR的外引物和内引物扩增时,分别可检测到5×104和2.5×104个WSSV拷贝;单独使用GB巢式PCR的外引物和内引物进行一步法PCR扩增时,分别可检测到104和5×103个WSSV拷贝.使用上述PCR方法分别对44份未知WSSV含量的样品进行验证,定量PCR方法检测阳性率为84.09%,OIE巢式PCR与GB巢式PCR方法检测的阳性率分别为18.18%和27.27%;单独使用OIE巢式PCR的外引物和内引物扩增检测的阳性率均为15.91%;单独使用GB巢式PCR的外引物和内引物扩增检测的阳性率分别为18.18%和20.45%.根据以上结果,PCR方法检测WSSV的灵敏度由高到低依次为:定量PCR、巢式PCR、一步法PCR.     

安徽省克氏原螯虾白斑综合征病毒缺失区序列分析

为了解安徽省克氏原螯虾(Procambarus clarkii)白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)缺失区ORF23/24和ORF14/15的遗传差异及其与世界各地WSSV的遗传进化关系,2016年4月—8月,在安徽省6个市采集了9个养殖克氏原螯虾样本进行WSSV套式PCR检测,扩增病毒缺失区ORF23/24和ORF14/15,将获得的序列进行比较分析。结果显示,9个样本均在第1轮PCR扩增中获得阳性结果,其ORF23/24区与中国台湾株(TW)比对,缺失5 892 bp或9 310 bp,其ORF14/15区与WSSV祖先株(TH-96-Ⅱ)比对,缺失5138 bp或5948 bp。其中8个样本中WSSV与2008至2010年在江苏的克氏原螯虾中检测到的一些毒株的ORF23/24和ORF14/15区缺失情况相同,且这些病毒ORF14/15区均缺失5 138 bp,与TW株缺失情况相同。     

对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP19的单克隆抗体制备及其定位

为了更好地研究对虾自斑综合征病毒(WSSV)蛋白VP19在WSSV感染过程巾的作用,利用VP 19的单克隆抗体直接对VP19进行了定位.从患白斑综合征的中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃丝中提取WSSV,将提纯的WSSV经十二烷基磺酸钠-聚内烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,然后洗脱提纯其病毒蛋白VP19并免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合,用间接免疫荧光技术(IFAT)和Western-Blot技术筛选出1株阳性杂交瘤细胞,将检测出的阳性杂交瘤细胞经有限稀释法克隆,研制出抗VP19的单抗,再利用免疫胶体金技术对病毒蛋白VP19进行定位,结果显示,胶体金粒子位于WSSV病毒的囊膜上,说明病毒篮白VP19位于WSSV囊膜上.[中国水产科学,2009,16(1):69-74]     

湖北地区克氏原螯虾白斑综合征病毒变异区ORF14/15、ORF23/24基因序列比较分析

试验扩增、克隆了在湖北地区采集的19份克氏原螯虾(Procambarus clarkii)白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)阳性样品的变异区ORF14/15和ORF23/24基因,通过测序比较分析了湖北各WSSV毒株与Gen Bank公布的标准毒株间在变异区ORF14/15及ORF23/24基因的差异性。结果显示,19份WSSV阳性样品中有部分样品在变异区扩增出ORF14/15、ORF23/24基因片段,变异区基因序列分析发现,与Gen Bank已公布的标准毒株相比,存在大片段缺失。在变异区ORF14/15,有3个毒株扩增出1 442 bp的片段,4个毒株扩增出630 bp的片段,基于变异区ORF14/15构建的系统进化树显示,这些毒株归属两个不同的分支。在变异区ORF23/24,有2个毒株扩增出大小为2 096 bp的片段,进化分析发现这2个毒株在变异区ORF23/24的遗传距离较近。     

对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28研究进展

对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是在水产养殖中引起对虾等甲壳类动物发生严重病害的病原体。VP28是WSSV中最重要的囊膜蛋白之一,在WSSV感染对虾的初期起着至关重要的作用。文章从基因和蛋白质结构、VP28在病毒入侵中的作用及免疫应用等方面概述了VP28的研究进展,可为WSSV的防治研究提供参考。     

中国对虾和日本对虾对白斑综合征病毒(WSSV)敏感性的比较

用10⁵拷贝、10⁴拷贝和10³拷贝3个剂量的白斑综合征病毒(WSSV)粗提液分别对中国对虾和日本对虾进行人工注射感染,比较两种对虾对WSSV敏感性的差异,以探讨日本对虾白斑综合征(WSS)低发病率的原因,为对虾的病害防治提供参考。结果显示:用10⁵拷贝、10⁴拷贝和10³拷贝的WSSV粗提液注射后,中国对虾的平均存活时间分别为54.21±0.60 h、71.26±4.26 h和75.04±5.73 h;日本对虾平均存活时间分别为77.61±4.45 h、105.84±6.36 h和168.82±13.15 h。中国对虾和日本对虾的存活时间均随着病毒剂量的降低而延长。同剂量病毒注射下,日本对虾组的存活时间均长于中国对虾组,差异显著(P<0.05)。试验结果表明,日本对虾对WSSV的抵抗力较中国对虾强。