转小麦 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥植株的主要抗旱性研究

核氧还蛋白（nucleoredoxin,NRX）可通过还原目标蛋白的二硫键来调控其生物活性,在植物的生长发育和抗逆境胁迫中发挥着重要作用。蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）、h型硫氧还蛋白（h-type thioredoxin,TRXh）和蛋白磷酸酶2A催化亚基（protein phosphatase 2A catalytic subunit,PP2Ac）是小麦核氧还蛋白TaNRX1的互作蛋白。为了明确TaNRX1互作蛋白的抗旱性功能,本研究在拟南芥中过表达了小麦 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因,对野生型和转基因拟南芥的表型和抗旱相关生理指标进行了鉴定。结果表明,干旱胁迫处理后,转 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥的根长、存活率、脯氨酸含量均大于野生型,离体叶片失水率、丙二醛（MAD）含量均小于野生型。二氨基联苯胺（diaminobenzidine,DAB）对H₂O₂组织定位染色结果表明,干旱胁迫处理后,转 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥的H₂O₂含量均低于野生型。上述结果说明,TaNRX1的互作蛋白基因 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D增强了拟南芥对于干旱胁迫的抵抗能力。本研究可为小麦抗旱育种提供候选基因和理论基础。     

小麦 TaPLC1基因与耐热的相关性研究

小麦磷酸肌醇特异性磷脂酶C（phosphoinositide-specific PLC,简称PI-PLC）在小麦抗逆过程中具有重要作用。为研究 TaPLC1基因与小麦耐热性的关系,选用热敏感型品种中国春(CS)和耐热型品种TAM107,在一叶一心期用PI-PLC抑制剂U73122处理,在两叶一心期进行40 ℃热胁迫处理,对小麦植株的部分生理指标（MDA、SOD、叶绿素和可溶性糖含量）及 TaPLC1基因的表达模式进行测定。结果表明,在两个品种中,抑制剂处理较未处理的幼苗叶片MDA、SOD及可溶性糖含量均升高,叶绿素含量下降,中国春的变化幅度大于TAM107。 TaPLC1基因在两个品种中呈现不同的表达模式,但表达量均在热胁迫30 min达到最大值。随着热处理时间的延长,未经抑制剂处理的TAM107叶片中 TaPLC1的表达量变化幅度明显大于处理叶片,抑制剂处理的TAM107对热胁迫响应不显著;而未经抑制剂处理的中国春叶片中 TaPLC1的表达量变化幅度与抑制剂处理的叶片差异不显著,均在一定程度上响应热胁迫;未经抑制剂处理的叶片,TAM107中 TaPLC1表达量的变化幅度明显大于中国春。热胁迫后,中国春幼苗出现明显萎蔫现象,TAM107轻微萎蔫,停止热胁迫后,全部幼苗萎蔫逐渐恢复,而抑制剂处理的幼苗叶尖开始枯萎变黄,热胁迫处理4 h后第5天表型较为明显,品种之间枯萎变黄程度无明显差异。以上结果说明,抑制 TaPLC1基因的表达后,幼苗对热胁迫的敏感性增强,TAM107和中国春的耐热性可能与 TaPLC1的表达有关。     

新疆小麦品种 Glu A3和 Glu B3位点等位变异的分布

为给新疆小麦品质育种提供理论依据,利用 GluA3、 GluB3位点上的17个STS标记检测了185份新疆冬、春小麦品种 GluA3和 GluB3位点的等位变异。结果表明,新疆小麦品种以 GluA3c、 GluB3a和 GluB3j亚基为主,其分布频率分别为64.86%、22.70%和17.84%。新疆冬、春小麦品种在 GluA3位点上均以 GluA3c亚基为主,分布频率分别为63.30%和67.11%;在 GluB3位点上,新疆冬、春小麦品种分别以 GluB3j和 GluB3a为主,分布频率分别为22.02%和26.32%。新疆冬、春小麦农家品种亚基类型较少,冬小麦农家品种仅有5种类型（以 GluA3c和 GluB3i为主）,春小麦农家品种有10种类型（以 GluA3c和 GluB3d为主）。引进品种和自育品种亚基类型丰富,冬小麦引进品种以 GluA3c和 GluB3i为主,分布频率为12.84%和6.42%;春小麦引进品种以 GluA3c和 GluB3j为主,分布频率为17.11%和6.58%。冬小麦自育品种以 GluA3c和 GluB3j亚基类型为主,分布频率为45.87%和18.35%;春小麦自育品种以 GluA3c和 GluB3a亚基类型为主,分布频率为36.84%和18.42%。     

小麦TaPYL8基因的克隆与抗旱功能分析

脱落酸(ABA)信号通路在植物对干旱胁迫的响应中扮演着至关重要的角色;作为ABA受体,PYL家族蛋白在ABA信号转导中发挥核心作用。小麦TaPYL8是PYL家族的成员。为了明确TaPYL8是否参与小麦干旱胁迫响应,本研究分析了TaPYL8的表达模式,创建过表达TaPYL8拟南芥,并探讨了干旱对拟南芥生理生化及胁迫相关基因表达的影响。结果表明,TaPYL8表达量在干旱胁迫、外源ABA及PEG6000处理后上调。干旱胁迫下,过表达TaPYL8增强了拟南芥的存活率,降低了叶片失水率和MDA含量,提高了SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性及AtSOD、AtP5CS1、AtABF3等胁迫相关基因的表达量。推测TaPYL8通过促进胁迫相关基因表达增强植物抗旱能力。     

Glu A1和 Glu D1位点高分子量谷蛋白亚基共同缺失对弱筋小麦品质的影响

为了研究高分子量谷蛋白亚基(HMWGS)缺失对小麦品质的影响,以 GluA1和 GluD1位点HMWGS共同缺失材料2GS041410作供体亲本,以弱筋小麦品种扬麦13和扬麦18作轮回亲本进行回交,构建不同遗传背景的BC¹F³和BC²F³群体,测定受体、供体亲本的品质,以及回交群体BC¹F³和BC²F³中 GluA1和 GluD1位点HMWGS共同缺失纯合单株及两位点均正常表达纯合单株的品质。结果表明,供体2GS041410具有较低的SDS沉降值、较短的面团形成时间和稳定时间;在BC¹F³和BC²F³中, GluA1和 GluD1位点HMWGS共同缺失对蛋白含量影响不显著,但可显著或极显著降低SDS沉降值和水溶剂保持力(SRC)。 GluA1和 GluD1位点HMWGS双缺失在弱筋小麦品质育种中具有一定的应用价值。     

小麦丙氨酸-乙醛酸转氨酶基因（ TaAGT2）的克隆、生物信息学预测及表达分析

光呼吸是植物细胞H_2O_2的重要来源,也是维持细胞氧化还原的重要成分,影响植物对生物和非生物逆境的应答,因此,挖掘与光呼吸有关的基因对提高植物的抗逆性具有重要意义。本研究以耐旱小麦品种青麦6号转录组数据为基础,通过RACE技术克隆得到小麦 AGT2基因的全长cDNA,将其命名为 TaAGT2,并对其进行了生物信息学预测及表达模式分析。结果表明, TaAGT2开放阅读框长1 434bp,编码477个氨基酸。该蛋白属于亲水性稳定蛋白,定位于线粒体中,二级结构以α-螺旋(42.14%)和无规则卷曲(32.91%)为主。 TaAGT2基因包含AAT-I基因族保守区域,与二穗短柄草 AGT2的相似性高达97%。通过qRT-PCR对基因 TaAGT2在不同组织中(根、茎和叶)及4种非生物胁迫(低温、ABA、干旱、高盐)下的表达特性进行分析,结果表明, TaAGT2在根、茎和叶中均有表达,茎中的表达显著高于根和叶,在不同胁迫条件下上调表达,表明该基因可能参与调控植物的抗逆反应。     

陕西小麦 Glu A3和 Glu B3位点等位变异的检测和分析

低分子量谷蛋白亚基（LMWGS）与小麦品质密切相关。为了给陕西小麦的品质改良提供参考依据,采用STS分子标记,检测了175份陕西小麦品种（系） GluA3和 GluB3位点的等位变异组成。结果表明,陕西小麦 GluA3位点存在4种等位变异,即 GluA3a、 GluA3b、 GluA3c和 GluA3d,分别占12.6%、1.7%、58.3%和27.4%; GluB3位点存在8种等位变异,即 GluB3a、 GluB3b、 GluB3d、 GluB3e、 GluB3f、 GluB3g、 GluB3i和 GluB3j,分别占4.6%、2.9%、45.7%、0.6%、2.9%、8.5%、4.0%和30.8%。在陕西不同地区小麦之间,两个位点等位变异的种类、组合及其分布比例存在差异,这可能与地区间不同的自然地理环境、饮食习惯、育种目标及亲本选择有关。     

TaGW2-6A等位变异对青海省小麦育成品种千粒重的影响

已有研究表明, TaGW2-6A基因的等位变异与小麦千粒重呈正相关关系。为了明确TaGW2-6A基因的优异等位变异,以青海省育成的64份小麦品种为材料,测定了3个环境下千粒重表型数据,鉴定了 TaGW2-6A基因的等位变异,并评价了 TaGW2-6A基因各等位变异对千粒重的影响。结果表明,64份小麦品种中,Hap-6A-A单倍型材料有40份,Hap-6A-G单倍型材料有24份;在3个环境下,Hap-6A-G单倍型平均千粒重显著高于Hap-6A-A单倍型。说明在青海小麦育成品种中,单倍型Hap-6A-G是优异等位变异,可用于小麦高产品种的选育。     

干旱和复水条件下小麦叶片 TaNCED1表达与ABA积累的关系

NCED基因是ABA生物合成过程中的关键限速酶。为给小麦耐旱性研究及耐旱新品种选育提供理论依据,本研究以8个抗旱性不同的小麦品种为材料,研究干旱胁迫和复水过程中小麦叶片 TaNCED1表达水平和ABA含量对水分变化的响应。结果表明,在干旱胁迫过程中, TaNCED1的表达水平和ABA的积累呈现先增后降的变化趋势,品种间 TaNCED1的表达水平存在明显差异。济麦22、郑麦366等5个品种 TaNCED1的表达水平呈现明显的单峰曲线,而鲁麦21、临旱2号等3个品种呈现明显的双峰曲线,而且不同材料间 TaNCED1表达量达到最高值的时间也存在差异。在复水过程中,除临旱2号外,其余7个小麦材料的 TaNCED1表达均表现为先快速下降,之后缓慢上升的"V"字形变化趋势。整个水分胁迫和复水处理过程中,ABA含量的变化较为平缓,除临旱2号外, TaNCED1的相对表达量与ABA相对含量之间均都符合y=aln(x)+b的对数关系,且品种之间 TaNCED1对ABA的影响程度存在较明显的差异。分析认为,可以将 TaNCED1作为重要的水分胁迫响应基因应用于小麦抗旱育种和抗旱理论研究。     

基因枪介导的转 TaGAPDH8基因小麦的获得与鉴定

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)是参与糖酵解和糖异生途径的关键酶之一,在维持细胞能量供应和植物抗逆性方面具有重要作用。本研究以耐旱型小麦品种长武134及干旱敏感型小麦品种郑引1号为材料,利用基因枪法将 TaGAPDH8基因分别转化这两种小麦的幼胚愈伤组织,经潮霉素筛选和PCR鉴定,最终得到4个下调表达的长武134株系(CW134-3、CW134-6、CW134-12、CW134-13)和8个上调表达的郑引1号株系(ZY1-1、ZY1-3、ZY1-4、ZY1-9、ZY1-10、ZY1-14、ZY1-15、ZY1-17)。对生长于大田的T_2代转基因植株在乳熟期的生长状况进行了测定,获得了与对照相比有明显表型差异的植株。用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术测定了T_3代小麦株系中 TaGAPDH8的表达量,结果表明,4个长武134株系中 TaGAPDH8基因的表达量分别为对照的0.53、0.75、0.21和0.78倍,而8个郑引1号株系中目的基因的表达量分别为对照的3.02、1.22、2.15、1.36、4.02、1.87、1.48和1.97倍。本研究获得了与对照存在明显表型差异的T_2代及稳定遗传目的基因的T_3代小麦株系,为后续的试验提供了研究材料和基础。     

不同发育特性小麦品种春化基因 VRN2的序列分析

为了明确小麦春化基因VRN2与春化发育表现型的关系,以6个不同春化发育特性的普通小麦品种为试验材料,采用PCR技术对春化基因VRN2的CCT保守区中43个氨基酸序列进行了分析。结果表明,不同品种间ZCCT-A1的CCT功能域的序列存在差异,肥麦有R35W突变,另外5个品种均有R39C突变;ZCCT-A2均存在R16C突变;B和D基因组中均未发现突变。这表明VRN2基因编码区的等位变异主要出现在A基因组上,而B和D基因组中的VRN2基因在目前大面积主栽品种中均为显性。     

新疆小麦籽粒SOD活性及TaSOD-A1位点等位变异的分布

为了解新疆小麦品种(系)籽粒超氧化物歧化酶(SOD)的活性及TaSOD-A1位点等位变异的分布,用两个功能标记SODA1和SODA11对117份新疆小麦品种(系)的 TaSOD-A1位点(基因ID为TraesCS5A01G290800)进行等位变异检测,并结合SOD活性检测结果,分析 TaSOD-A1位点不同等位变异与SOD活性的相关性。结果表明,含有 TaSOD-A1a等位变异材料的籽粒SOD活性显著高于含有 TaSOD-A1b等位变异材料的籽粒,二者占比分别为50.4%和49.6%;新疆冬小麦品种(系)中, TaSOD-A1a等位变异的分布频率高低依次为引进品种(系)>自育品种(系)>地方品种;新疆春小麦品种(系)中,只有3份材料含有 TaSOD-A1a等位变异,早期品种(系)中未发现含有 TaSOD-A1a等位变异的材料。新疆冬小麦品种(系)的籽粒SOD活性平均值显著高于新疆春小麦品种(系),且新疆冬小麦引进品种(系)中含有 TaSOD-A1a等位变异材料的籽粒SOD活性平均值也显著高于含有 TaSOD-A1b等位变异材料的籽粒SOD活性。     

小麦抗条锈基因Yr1和Yr2分子检测体系研究

为建立小麦抗条锈病基因分子检测体系,分别以Yr1和Yr2紧密连锁的标记为检测标记,以Sull-1、CYR29、CYR32、CYR33和V26/CM42为小麦条锈菌鉴别菌株,构建Yr1和Yr2分子检测体系,并对181份小麦高代系材料进行了抗病鉴定和Yr1和Yr2基因分析。结果表明,gwm372和gwm382可作为Yr1的检测标记;wmc364可作为Yr2的检测标记;5个鉴别菌株对Yr1和Yr2具有较好的区分能力。Yr1和Yr2基因在181份小麦高代系材料中比例较低,表明这两个基因在我国小麦抗病育种过程中丢失严重。     

玉米Opaque-2基因在毕赤酵母中的表达

从玉米自交系辽2345授粉后18 d的胚乳中提取总RNA,经反转录后得到第一链cDNA,利用Opaque-2基因的特异引物克隆出该基因的全编码区,将该编码区的全序列以正确的阅读框架利用Infusion同源重组的方法亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9的α因子下游,并置于AOXⅠ启动子控制下,利用pPIC9表达载体上的特异引物进行PCR鉴定,鉴定后的重组质粒用Bgl Ⅱ酶切线性化后,电转化导入甲醇型毕赤酵母菌株GS₁15中,利用MM、MD和菌落PCR的方法筛选出Mut⁺表型,得到的重组子以甲醇诱导表达蛋白。经SDS-PAGE结果显示,Opaque-2蛋白得到表达,其相对分子质量（Mr）约为47 KD。     

冬小麦miR398前体的克隆及其在低温条件下对靶基因CSD1表达的调控

miR398是受逆境胁迫负调控的miRNA,其靶基因CSD编码超氧化物歧化酶(SOD),使植物抵御活性氧(ROS)的毒害。为进一步了解低温胁迫下miR398的调控机制,从东农冬麦1号中克隆小麦miR398前体,构建过表达载体并转化拟南芥,用Real-time PCR检测T0代植株中小麦miR398及其靶基因CSD1在低温胁迫下的表达量。结果表明,随着低温胁迫时间的延长,miR398表达下调、CSD1基因表达上调,认为小麦miR398能响应低温胁迫、负调控CSD1基因表达,间接提高了拟南芥的抗寒性。     

小麦 TaSABP2基因的克隆及表达分析

为挖掘小麦抗逆基因,进一步解析小麦抗逆机制,采用电子克隆结合RT-PCR的方法,从小麦叶片中分离出 TaSABP2基因;利用生物信息学手段分析其序列特征;运用实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)技术检测其在不同条件下的表达情况。结果表明,小麦 TaSABP2基因的cDNA全长为878 bp,包含一个长度为807 bp的开放阅读框,编码268个氨基酸。 TaSABP2基因的编码蛋白包含Abhydrolase及PLN02211两个结构域及一个酶活性中心(VVLVGHSLGG),属于Abhydrolase超家族的成员。其蛋白二级结构由四种形式构成,包括40.3%的α-螺旋、16.42%的延伸链、4.48%的β转角、38.81%的无规则卷曲。通过与其他植物的氨基酸序列进行多重序列比对,发现功能区域的氨基酸序列较为保守。qRT-PCR结果表明, TaSABP2基因的表达具有较强的组织特异性,植物激素ABA和BR处理及干旱和盐胁迫处理,均能诱导该基因的表达量迅速增加。以上结果表明, TaSABP2基因在小麦抵抗逆境胁迫过程中起到一定作用。     

低温条件下小麦返白系叶片中H2O2累积的原因初探

为了研究低温处理下小麦叶色阶段性白化品种返白系与对照品种矮变1号叶片的H_2O_2含量是否存在差异,并初步分析导致差异的原因,采用DAB组织染色法检测返白系和矮变1号在4℃低温处理90 d、25℃下恢复培养10 d时叶片H_2O_2含量的动态变化,测定4℃低温处理下返白系和矮变1号中表征光合电子传递效率的荧光参数F_v/F_m和qP,并采用qRT-PCR方法分析返白系和矮变1号中几个光合电子传递体基因及质体H_2O_2清除相关基因的表达模式。结果显示,低温处理下,矮变1号叶片中H_2O_2含量变化不大,返白系叶片中H_2O_2会大量累积;低温处理下,返白系叶片的叶绿素荧光参数F_v/F_m、qP都明显低于矮变1号。同时,低温下返白系光合电子传递链中部分电子传递体亚基基因petD、petN、ndhB和ndhK,以及质体H_2O_2清除相关基因 APX4和 HO1的表达量低于矮变1号。这些结果表明,低温处理下,相较于矮变1号,返白系叶片中会累积大量的H_2O_2。返白系质体中光合电子传递受阻引起电子泄露,同时质体中清除活性氧的能力下降,可能是导致返白系叶片中积累大量H_2O_2的原因。     

小麦品种东农冬麦2号根中TaEXPA7部分同源基因的克隆及表达特性分析

膨胀素(expansin)是植物生长发育过程中诱导细胞壁松弛和伸展的蛋白,包括EXPA、EXPB、EXLA、EXLB四个基因家族,对植物根系的形成及快速发育具有重要作用。本试验以寒地冬小麦品种东农冬麦2号两叶一心期的根为材料,克隆了TaEXPA7基因的3个CDS全长,其氨基酸序列同源性较高,仅信号肽处有两个氨基酸不同,其核酸序列长度均为777bp,编码258个氨基酸,分别命名为TaEXPA7-A、TaEXPA7-B、TaEXPA7-D,且分别定位于2AL、2BL、2DL染色体。蛋白均含有DPBB-1和Pollen-allerg-1两个保守结构域,分子量为27 670.74Da,等电点为8.09,均为疏水性蛋白;与节节麦、二穗短柄草的相似性分别为99%和92%。采用两叶一心期的根进行qRT-PCR分析发现,TaEXPA7-A/B/D三个基因在根尖中的表达量均较高,伸长区和成熟区次之;对冬小麦根进行低温、干旱和激素处理后,这三个基因均下调表达,并且TaEXPA7-B基因的相对表达量较高,TaEXPA7-D的相对表达量较低。由此可见,多倍体小麦不同染色体上的基因在应对不同环境胁迫时,表达以及应答模式存在差异,并且在不同的环境胁迫下,发挥主导作用的染色体也存在差异;此外,该基因在根中的表达可能与低温、干旱以及外源激素的胁迫有一定的关系,可能是促进根系生长的重要基因。     

小麦TaDHN2基因及其启动子的克隆与功能研究

为给深入研究Ta DHN2基因在小麦抗旱机制中的作用机理奠定基础,并为进一步丰富小麦DHN基因研究内容提供参考,本研究通过筛选石麦15基因组BAC文库和BAC克隆测序方法克隆了Ta DHN2基因及其启动子,并对Ta DHN2基因序列特征、表达模式和启动子功能等进行了分析和探讨。结果表明,Ta DHN2基因含有1个88 bp的内含子,开放读码框长为696 bp,编码1个含有231个氨基酸的脱水素蛋白。Ta DHN2蛋白具有Y-segment、S-segment和K-segment结构域,属于YSK2类型脱水素蛋白。此外,该蛋白含有明显的核定位信号序列S-segment和基序RRKK。Ta DHN2基因受渗透胁迫诱导表达,在根和叶中表达模式类似,叶中表达量显著高于根中。Ta DHN2基因启动子序列长为2 025 bp,预测含有9个脱水响应顺式元件。在转基因拟南芥中,Ta DHN2基因启动子能够启动GUS基因表达,并在渗透胁迫下诱导GUS基因上调表达。以上结果说明,Ta DHN2基因为脱水响应基因,其启动子为渗透胁迫强诱导启动子。