大肠埃希菌不耐热肠毒素研究进展

大肠埃希菌不耐热肠毒素(LT)是产毒性大肠埃希菌产生的一种能导致人畜腹泻的毒素,由六聚体蛋白形成AB5型结构.A亚基具有ADP核糖基转移酶活性,而B亚基为五聚体,主要与表达于真核细胞表面的神经节苷脂GM1结合.LT具有很强的免疫原性和黏膜免疫佐剂活性.为了将其毒性与佐剂活性分开,研究者构建了一系列无毒或减毒的突变体.证明突变体具有佐剂活性,并发现没有毒性的AB复合物以及酶活性在佐剂活性中发挥的作用是分开的.野生型LT、LT突变体以及B亚基与外源抗原共同免疫机体后,对机体免疫系统具有调节作用.     

牦牛大肠埃希氏菌的肠毒素试验

从自然病死牦牛体内分离出3株大肠埃希氏,用改良Mundell产毒液体培养基分别培养,培养物经高速离心,过滤,使用滤液做兔回肠结扎试验,乳鼠灌胃试验和大鼠回肠环袢试验.结果表明3株大肠埃希氏菌均产生肠毒素,阐明了牦牛腹泻的病因.     

产肠毒素大肠埃希菌主要黏附素的研究进展

产肠毒素大肠埃希菌的主要黏附素抗原有K88、K99、987P和F41,在发病学和免疫学上扮演着重要的作用.文章就其理化特性、生物学特性、分子生物学特性及主要检测方法进行综述.     

大肠埃希菌热敏性肠毒素B亚基研究进展

产肠毒素大肠埃希菌(EnterotoxigenicE.coil,ETEC)是引起幼畜、婴幼儿及旅游者腹泻的重要病原之一。ETEC产生两类肠毒素,一种是对热敏感的热敏性肠毒素(heat-labile enterotoxin,LT),另一种是对热不敏感的耐热性肠毒素(heat-stable enterotoxin,ST)。LT不仅是ETEC主要的毒力因子,而且还是一种重要的黏膜佐剂,它由A、B亚基组成,由于LT A具有毒性作用,限制了LT作为黏膜免疫佐剂的应用;而LT B无毒且具有黏膜佐剂活性,使其成为备受关注的佐剂之一。近年来对LT B的结构、介导的免疫调节分子机制、突变体及其佐剂作用已进行了较为深入的研究,为充分利用LT B的黏膜免疫佐剂功能奠定了基础。     

不耐热性肠毒素的黏膜免疫佐剂效应及其应用

黏膜免疫和黏膜免疫佐剂是近年来发展起来的新的免疫理论和新型技术，已成为医学界和免疫学界的研究热点。人们发现，虽然绝大多数病原微生物的感染始发于黏膜部位(呼吸道、消化道、尿道和生殖道)，但是在动物和人群中暴发传染病的数量都相对较低，部分原因就在于感染局部和全身免疫系统会产生多种免疫球蛋白来抵抗感染。不耐热性肠毒     

产肠毒素大肠埃希菌STa-K99融合蛋白重组腺病毒载体的构建及表达

为构建产肠毒素大肠埃希菌(ETEC) STa-K99融合蛋白重组腺病毒载体Ad STa-K99,通过PCR技术分别克隆了STa及K99基因,并与腺病毒穿梭质粒连接构建了穿梭质粒pAd5 STa-K99,将pAd5STa-K99和骨架质粒(含GFP基因)分别用Pac Ⅰ酶切线性化,利用LipofectamineTM LTX&-PLUS共转染293细胞进行同源重组包装重组腺病毒,通过PCR及Western blot对重组腺病毒进行鉴定.结果显示,重组腺病毒Ad5 STa-K99构建正确并表达融合蛋白,且表达的融合蛋白能够被抗体所识别,为研制由ETEC引起的新生动物腹泻重组腺病毒载体疫苗奠定了基础.     

产肠毒素大肠埃希茵主要黏附素的研究进展

产肠毒素大肠埃希茵的主要黏附素抗原有K88、K99、987P和F41，在发病学和免疫学上扮演着重要的作用。文章就其理化特性、生物学特性、分子生物学特性及主要检测方法进行综述。     

大肠埃希菌耐药机制研究进展

长期以来,人们对大肠埃希菌病的防治以药物控制为主要手段,但是随着抗菌药的长期大量使用,导致了大肠埃希菌耐药性的产生,给大肠埃希菌病的防治带来严重的障碍,通过对大肠埃希菌耐药性的现状、作用机理、主要特点、对人类的危害和防治策略等方面的研究,进一步提出对大肠埃希菌耐药性的展望,为消除大肠埃希菌的耐药性,更好地防治大肠埃希菌病提供科学依据。     

鸡致病性大肠杆菌肠毒素(LT)的鉴定及其基因的克隆

鸡致病性大肠杆菌分离株O78经家兔肠袢结扎试验(RILT)证实,该菌株产生热敏性肠毒素(LT)。用PCR技术从该菌株中扩增出1.2kb的LT基因,然后将纯化的PCR产物克隆到pGEM-T载体中,转化至受体菌JM109中。用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选得到阳性重组菌株,提取质粒用SphI和SalI双酶切鉴定,结果证实,构建的克隆质粒pXCLT1含有LT基因。     

电针对大肠杆菌热敏肠毒素致肠水、钠分泌的拮抗作用

新生仔猪下痢是严重危害养猪业的常见病、多发病,而肠致病性大肠杆菌产生的肠毒素特别是热敏肠毒素(Heat-Labileenterotoxin,LT)则是导致幼畜腹泻的直接致病因子。在兽医临床上,由于广泛使用抗菌药物治疗仔猪下痢,大肠杆菌对这些药物普遍地产生了耐药性,致使临床疗效越来越差。针灸疗法是我国传统医学的宝贵遗产,已有不少文献报道了针灸对哺乳仔猪下痢良好的防治效果,但有关针灸防治仔猪下痢机理的研究则相对滞后。为此,本试验应用兔回肠结扎实验动物模型观察了电针刺激对大肠杆菌热敏肠毒素致肠水、钠分泌的拮抗作用,以便为针灸防治…     

大肠杆菌热敏毒素研究概况

本文在分析大肠杆菌热敏毒素（LT）生物学特性及其分子学水平研究的基础上，从蛋白质和基因水平阐述了猪源LT与人源LT的亲缘关系，评述了LT在研制人畜大肠杆菌腹泻疫苗中的应用价值，也通过对与LT具有相似蛋白和基因结构的霍乱毒素CT的分析，表明二者具有相同的进化起源，认为通过定点诱变的LT能够取代CT用作幽门螺杆菌疫苗的粘膜免疫佐剂。     

Expression of Putative Escherichia coli Heat-labile Enterotoxin (LT) Receptors on Intestinal Brush Borders from Pigs of Different Ages

Many strains of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) that cause diarrhoea in young piglets secrete a heat-labile enterotoxin (LTp) that binds to specific glycoconjugates on porcine intestinal epithelial cells. Binding of LTp to an appropriate glycoconjugate facilitates the uptake and trafficking of the toxin into the cell, where it stimulates intracellular changes that promote fluid secretion and diarrhoea. The objective of the current study was to identify the LTp-binding glycoconjugates on porcine intestinal epithelial cells, the natural target cells for LTp. We found that LTp binds, in an age-correlated manner, to an acidic glycosphingolipid (GSL) that co-migrated with GM1 on thin-layer chromatography (TLC), a small acidic GSL that appears to be a sulphatide, a neutral GSL that co-migrated with neolactotetraglycosylceramide (nLc4) on TLC, and two glycoproteins (36 and 205 kDa). Of these potential LTp receptors, the GM1-co-migrating GSL was detected most intensely in young animals, while the other four LTp-binding glycoconjugates were detected most intensely in older pigs (54 weeks). Since ETEC primarily cause disease in young piglets, the GM1-co-migrating GSL is the most likely candidate for a functional LTp receptor.     

大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)突变体LTR72的表达与鉴定

将重组质粒PLTR72和PLT分别转化大肠杆菌JM101，DH5α和C600，并接种于LB和CAYE-2中培养，用GM1-ELISA法检测菌体裂解液中2者的表达情况，将表达产物纯化后用SDS-PAGE等方法鉴定。结果表明，3种大肠杆菌在2种培养基中都可表达出LT突变体和LT，并可将产物分泌到大肠杆菌胞周质中，成为具有GM1结合活性的突变体蛋白，鉴定纯化后的突变体的组成形式与野生型LT相同。均是1A：5B。     

重组大肠杆菌不耐热肠毒素的表达及对小鼠胚胎稳定性的影响

为研究大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）对小鼠胚胎稳定性的影响,运用大肠杆菌表达系统制备了具有生物活性的重组大肠杆菌LT,用重组LT通过腹腔注射处理妊娠小鼠,分析了LT对小鼠胚胎稳定性的影响。首先采用PCR方法从产毒大肠杆菌菌株44815基因组中扩增LT的A、B亚基基因,将其插入到pET-20b（＋）原核表达载体pelB信号肽的下游,分别构建成LTA和LTB分泌型表达载体;将载体分别转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,在IPTG的诱导下进行表达,利用Ni-NTA琼脂糖凝胶从细菌周质释放液中提取和纯化重组LTA和LTB蛋白;利用细胞毒性试验检测重组蛋白的生物活性。然后用制备的重组LT注射妊娠6d的小鼠,连续注射3d后,统计小鼠的胚胎存活率。同时用ELISA方法检测小鼠血清中与胚胎稳定性密切相关的Th1型细胞因子（IFN-γ、IL-2）和Th2型细胞因子（IL-4、IL-10）及IL-β的表达水平。结果表明,采用分泌性表达策略实现了重组LT在大肠杆菌中的高效分泌表达,LTA和LTB的表达量分别达68、62mg/L。表达的重组LT具有明显的细胞毒性作用;用LT处理妊娠小鼠,胚胎的存活率为32%,明显低于对照组;小鼠血清中Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2的含量明显高于对照组（P〈0.01）,分别为对照组的2、3倍。同时细胞因子IL-1β为对照组的2倍（P〈0.01）,而稳定胚胎发育的Th2型细胞因子IL-4、IL-10没有明显变化（P〉0.05）。据此推测,LT可能与大肠杆菌性肠炎引起妊娠家畜流产有关,LT对胚胎稳定性的影响除与LT的直接毒性有关外,可能还与LT介导的免疫调节异常有关。     

表达Ⅰ型耐热肠毒素的重组大肠杆菌对7日龄仔猪小肠功能的影响

试验旨在研究表达Ⅰ型耐热肠毒素(STa)的重组大肠杆菌对7日龄仔猪小肠功能的影响。选取24头7日龄仔猪,随机分为4个处理组,分别为对照组、STa组、LMG194组和K88组。整个试验期间均以人工乳饲喂,预饲期4d,试验第5天进行攻毒,STa组、LMG194组及K88组分别在早晚两次口服灌喂2×109 CFU大肠杆菌LMG194-pBAD-STa、LMG194和K88,对照组灌服等量生理盐水,试验第7天早上各组灌服D-木糖并采血,屠宰并取空肠、回肠组织样品,测量仔猪血常规指标、血浆D-木糖含量及二胺氧化酶(DAO)活力,以及吸收与转运相关基因与蛋白表达量。结果显示,与对照组相比,STa组仔猪血液中中性粒细胞、中性粒细胞比率显著降低(P<0.05),淋巴细胞比率显著升高(P<0.05),LMG194组与K88组仔猪血液中中性粒细胞比率显著降低(P<0.05),淋巴细胞比率显著升高(P<0.05);STa组与K88组仔猪血浆D-木糖含量显著降低(P<0.05);STa组、LMG194组及K88组血浆DAO活力显著升高(P<0.05);STa组与LMG194组空肠AQP8、AQP10、KCNJ13和b0,+AT基因表达量均显著降低(P<0.05),K88组空肠AQP8、AQP10基因表达量显著升高(P<0.05);STa组回肠AQP8基因表达量显著降低(P<0.05),AQP10、SGLT-1基因表达量显著升高(P<0.05),LMG194组、K88组AQP8基因表达量显著升高(P<0.05),K88组AQP10、KCNJ13、b0,+AT、SGLT-1基因表达量显著降低(P<0.05);STa组、LMG194组及K88组空肠HSP70蛋白的表达量显著升高(P<0.05)。以上结果表明,表达Ⅰ型耐热肠毒素的重组大肠杆菌可导致7日龄仔猪小肠产生炎症,吸收与转运能力下降。     

表达耐热肠毒素的重组大肠杆菌对7日龄仔猪肠道形态结构及抗氧化功能的影响

试验旨在研究表达耐热肠毒素（STa）的重组大肠杆菌对7日龄仔猪肠道形态结构及抗氧化功能的影响。选取24头7日龄仔猪,随机分在4个日粮处理组,分别为对照组（人工乳）,STa组（人工乳+2×10⁹ CFU重组菌LMG194-pBAD-STa）,LMG194组（人工乳+2×10⁹ CFU大肠杆菌LMG194）,K88组（人工乳+2×10⁹ CFU大肠杆菌K88）。试验第5天进行攻毒,第7天屠宰取样,测量小肠黏膜的绒毛高度和隐窝深度,检测空肠、回肠、结肠及血清中的过氧化氢酶（CAT）、总一氧化氮合成酶（TNOS）与诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的活力及血清中丙二醛（MDA）与过氧化氢（H₂O₂）的含量。试验结果表明,与对照组相比,STa组仔猪各肠段绒毛高度均显著降低（P<0.05）,十二指肠隐窝深度及绒毛高度与隐窝深度的比值显著降低（P<0.05）,十二指肠、空肠、回肠绒毛表面积显著降低（P<0.05）;同时,STa组回肠、结肠CAT活力显著降低,血清、空肠、回肠和结肠中的TNOS活力显著降低（P<0.05）,STa组结肠iNOS活力显著降低（P<0.05）,STa组血清中的MDA与H₂O₂含量显著提高（P<0.05）。结果显示,表达STa的重组大肠杆菌可导致7日龄仔猪肠道结构损伤和抗氧化能力下降。     

Effects of Recombinant E. coli Expressing Heat-stable Enterotoxin on Intestinal Morphology and Antioxidant Capacity in Seven Days old Piglets

This experiment was conducted to investigate the effects of recombinant E.coli expressing heat-stable enterotoxin(STa) on intestinal absorption and barrier function, intestinal morphology and antioxidant capacity of 7 days old piglets. Twenty-four 7 days old piglets were allotted to four treatments:control group (artificial milk), STa group (artificial milk +2×10⁹ CFU E.coli LMG194-pBAD-STa), LMG194 group (artificial milk +2×10⁹ CFU E.coli LMG194), and K88 group (artificial milk +2×10⁹ CFU E.coli K88).The pigs were treated with E.coli on the 5th day and slaughtered on the 7th day. The results showed that, compared with the control group, villus height in jejunum, ileum and duodenum, crypt depth and villus height/crypt depth in duodenum, and small intestine villi surface area were significantly decreased in STa group (P<0.05). The activities of catalase (CAT) in ileum and colon, total nitric oxide synthase (TNOS) in serum, ileum, jejunum and colon, inducible nitric oxide synthase (iNOS) in colon were significantly decreased in STa group (P<0.05). STa group also had a higher levels of malondialdehyde (MDA) and hydrogen peroxide (H₂O₂) in serum (P<0.05). These results suggested that recombinant E.coli expressing STa could lead to intestinal injury and oxidative stress of 7 days old piglets.