直接竞争ELISA检测氯霉素残留的方法建立及初步应用

用混合酸酐法合成氯霉素的CAP抗原,用过碘酸钠氧化法合成CAP酶标记抗原,用ELISA方法对合成的CAP抗原、CAP酶标记抗原进行鉴定表明其与抗CAP单克隆抗体具有特异性反应。在此基础上建立了包被二抗的直接竞争ELISA方法。特异性试验结果表明,CAP琥珀酸酯、CAP琥珀酸钠盐的交叉反应率分别为107%、106.4%;甲砜霉素、氟甲砜霉素与CAP的交叉反应率小于0.016%;与其他结构类似物间未见交叉反应。该方法对CAP的检测限可达到0.1μg/L,IC50为11.6μg/L,线性范围0.1～100μg/L,批内变异系数小于11.5%,批间变异系数小于19.6%。对猪肉、鸡肉、蜂蜜分别添加1.0、3.0、10.0、30.0μg/L CAP标准品,回收率61.0%～102.0%,变异系数为6.6%～15.8%;对猪肉、鸡肉、蜂蜜中CAP的最低检测限分别为0.48、0.42、1.20μg/kg。     

磁珠标记的氯霉素直接竞争ELISA方法的建立

采用本实验室制备的氯霉素(CAP)单克隆抗体,以包被抗原1:6 000和酶标CAP单抗1:8 000的稀释比例为工作浓度,建立CAP直接竞争ELISA(cdELISA)方法,cdELISA检测灵敏度达到0.1 μg/L.利用xMag异硫氰酸根末端磁粒标记CAP单克隆抗体制备免疫磁珠,用该免疫磁珠富集样品中的CAP.经过乙酸乙酯抽提免疫磁珠表面吸附的CAP,再通过cdELISA检测,可使CAP的检测灵敏度提高50倍,即达到0.002 μg/L.     

鸡肌肉组织中氯霉素残留ELISA检测方法的研究

本文利用活化酯法合成了氯霉素抗原 ,作为免疫原免疫新西兰大耳白兔得到氯霉素的多克隆抗体 ,建立了氯霉素间接竞争酶联免疫检测方法 ,进行了药物交叉反应性试验 ,并对鸡肌肉进行添加回收试验。结果显示抗体效价可达 1∶ 6 4 0 0 0 0 ,IC50 为 1.3ng/ ml,最低检测限达到 0 .0 5 ng/ ml,线性检测范围为 0 .1～ 36 .4 5 ng/ ml。在 0 .5、1、2 .5、5 ng/ g浓度水平添加到鸡肌肉组织中 ,测得回收率为 5 5 .4 %～ 119.0 % ,变异系数为 4 .3%～ 10 .4 %。该 EL ISA方法快速、灵敏、方便 ,满足了氯霉素残留检测的要求。     

氯霉素残留ELISA检测方法

2002年农业部第235号公告《动物源性食品中兽药最高残留限量》中明确规定氯霉素禁止使用,在动物性食品中不得检出。所以建立检测动物源性食品中痕量氯霉素残留的分析方法具有重要的意义。目前常用于氯霉素残留的检测方法有微生物法、免疫分析方法、色谱法等,比较常用的是酶联免疫法和色谱法。酶联免役法（EUSA）因其具有操作简便、快速等优点,成为畜产品中农药残留、毒素、农药、微生物检测中最重要的检测技术之一。本文旨在建立畜产品中氯霉素残留的快速检测方法,并为进一步研制开发氯霉素残留检测试剂盒奠定基础。     

兽药制剂中氯霉素的ELISA检测方法的研究

为了检测兽药制剂中氯霉素的非法添加,优化反应条件和前处理方法,建立直接竞争ELISA方法。该方法检出限为1 mg/kg,添加回收率为81.00%～112.00%,批内和批间变异系数均小于10%,与国标仪器方法检测结果一致性好。本文建立的氯霉素直接竞争ELISA方法具有较高的精确度和稳定性,操作简单,检测时间短,可满足兽药制剂中氯霉素的检测。     

氯霉素间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法的建立

以人工合成的氯霉素－牛血清白蛋白（ＣＡＰ－ＢＳＡ）为包被抗原,氯霉素（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ,ＣＡＰ）为竞争的半抗原,两者与一定量的抗ＣＡＰ单抗（ＣＡＰ－ＭｃＡｂ）反应。实验结果表明,理想的包被抗原浓度为１．２５μｇ／ｍｌ,抗ＣＡＰ－ＭｃＡｂ工作浓度为１：１２０００,酶标二抗工作浓度为 １： ５０００,可测最适范围为 １ｎｇ／ｍｌ－１００ｎｇ／ｍｌ,最小检测量为０．１ｎｇ／ｍｌ,批内和批间变异系数分别为３． ６２％和 ５． １９％。得到回归方程 ｙ ＝１．２７３０－ ０．６７４５ｘ（ｒ２＝ ０． ９７７９）和标准曲线,从而建立了快速定量测定 ＣＡＰ含量的间接竞争酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）。整个测定时间为６小时。     

间接竞争ELISA检测兔肉中氯霉素残留方法的确定

建立了快速定量测定氯霉素(CAP)含量的间接竞争酶联免疫吸附试验方法。游离氯霉素与氯霉素辣根过氧化物酶标记物(HRP)在同一系统中竞争数量有限的氯霉素抗体结合位点,氯霉素酶标记物与氯霉素抗体结合的数量反比于游离氯霉素的数量。氯霉素浓度在0.2～20μg·ml-1范围内具有良好的线性关系回归方程为y=0.8327-0.5260x,r2=0.9862;测定低限为20ng·ml-1;方法平均回收率为83.5%,符合目前国际上氯霉素残留量检测的要求。     

孔雀石绿间接竞争ELISA检测方法的建立

采用无色孔雀石绿(Leucomalachite green,LMG)单克隆抗体建立了水产品中孔雀石绿(Malachite green,MG)残留的间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法。结果表明,LMG-McAb最佳稀释倍数为1∶80 000,包被抗原最佳质量浓度为0.80μg/mL;竞争反应时的LMG理想稀释液为40%乙腈水溶液;标准曲线呈线性相关,相关系数R2=0.9823,最适检测范围1 ng/mL~256 ng/mL,最低检测限为1.29 ng/mL,批内和批间变异系数分别为4.307%和4.566%;鳗鱼肉样的平均添加回收率为90%~110%;该检测方法与隐性结晶紫、孔雀石绿、结晶紫的交叉反应(CR%)分别为40.67%、13.50%和5.89%,与其他抗生素无交叉反应。     

氯霉素间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法的建立

以人工合成的氯霉素－牛血清白蛋白（CAP－BSA）为包被抗原，氯霉素（CAP）为竞争半抗原，两者与一定量的抗CAP－McAb反应。结果表明，理想的包被抗原质量浓度为1．25mg/L，抗CAP－McAb稀释倍数为1∶12000，酶标二抗稀释倍数为1∶5000，最适检测范围为1－100μg/L，最小检测为0．1μg/L，批内和批间变异系数分别为3．62％和5．19％。得到回归方程（y=1.2730-0.6745x,r^2＝0．9779）和标准曲线，从而建立了快速定量测定CAP含量的间接竞争酶联免疫吸附试验（ciELISA）。     

H3亚型猪流感病毒抗原捕捉ELISA检测方法的建立

为快速检测H3亚型猪流感病毒(SIV),本研究将一株H3N2亚型SIV特异性单克隆抗体(MAb)进行纯化,建立了以多抗作为包被抗体,MAb作为检测抗体的H3亚型SIV抗原捕捉ELISA (AC-ELISA)方法.并对该方法的特异性和敏感性进行了分析,其敏感性是血凝试验的4倍,与猪繁殖与综合征病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒以及H1、H5、H9亚型SIV均没有明显的交叉性反应,批间和批内重复试验变异系数均小于10％.应用建立的AC-ELISA方法对84份H3亚型SIV实验室感染样品进行检测与鸡胚滴定病毒结果符合率达90.47％.本实验建立的AC-ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,可用于H3亚型SIV的临床检测.     

氟喹诺酮类药物多残留间接竞争ELISA检测方法的建立

为建立同时检测多种氟喹诺酮药物的免疫学分析方法,本研究以碳二亚胺(EDC)二步法合成环丙沙星人工抗原,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,建立氟喹诺酮类药物多残留检测方法.标准曲线在PBS中的线性检测范围为0.2 ng/mL～376 ng/mL,半数抑制浓度(IC50)为8 ng/mL,检测限(LOD)为0.1 ng/mL;抗体对恩诺沙星、诺氟沙星和培氟沙星均能特异性识别,IC50值分别为7.3 ng/mL、10.6 ng/mL、和13.2 ng/mL;标准品稀释液中NaOH和甲醇的最高容忍度分别为10％和30％;牛奶基质中添加5 ng/mL、20 ng/mL和50 ng/mL的标准品,环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星和培氟沙星的回收率分别为93％～108％、96％～110％、92.5％～104％和93％～102％.     

氯霉素残留检测阻断ELISA试剂盒的研制及性能测定

在建立氯霉素单克隆抗体（CAP mAb）杂交瘤细胞株和阻断ELISA方法的基础上．研制出CAP残留快速检测试剂盒（CAP-kit），并对其性能进行了测定。结果表明，CAP-kit的标准曲线呈典型的S型，符合4参数logit曲线拟合，相关系数R^2=0．9953，检测范围为1．0μg/L～128．0μg/L，灵敏度为0．85μg／L，半数抑制浓度（IC50）为7．54μg/L，检测限为1．0μg/L；牛奶样、猪肉样的平均添加回收率为88．3％、82．5％，平均批内和批间变异系数均〈15％；CAP-kit与氯霉素琥珀酸钠的交叉反应（CR％）为150％，与其它酰胺醇类和抗菌素药物无交叉反应；试剂盒在4℃可保存6个月。     

酶联免疫法测定鸡肝中氯霉素残留

运用酶联免疫检测试剂盒测定鸡肝中氯霉素的残留量.氯霉素标准液浓度在 0.025～2 μg/mL范围内线性良好,r=0.995 1,鸡肝中最低检测限为0.10 μg/kg.空白添加阳性样品浓度为0.1、0.5和1.0 μg/kg时,回收率分别为86.9%、89.1%和80.0%,板内变异系数<14.6%,板间变异系数<12.0%;本方法操作简单快捷、灵敏准确、方便实用,可作为鸡肝中氯霉素残留检测的快速筛选方法.     

单抗竞争ELISA检测猪沙门氏菌感染方法的建立与应用

以猪霍乱沙门氏菌作为包被抗原 ,利用沙门氏菌O7单克隆抗体酶结合物建立了竞争ELISA方法检测猪霍乱沙门氏菌抗体。经过研究确定抗原包被浓度为 2×1 0 8CFU/ml,血清检测稀释度为 1∶1 6,酶标抗体浓度为 1∶70 0 ,包被液为碳酸盐缓冲液 ( 0 .0 5MpH9.6)。应用单抗竞争ELISA和平板凝集试验 (PAT)同时对 5 0 6份血清进行猪霍乱抗体检测 ,PAT的检出率为 3 .60 % ,ELISA检出率为 5 .75 % ,两者符合率达 96.4%。试验结果表明 ,ELISA方法敏感性高 ,特异性强 ,稳定性和重复性好 ,操作简便。本方法的建立在猪群沙门氏菌感染的检疫、实验室诊断的标准化及流行病学调查方面具有应用价值。     

牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA检测方法的标准化研究

用纯化牛病毒性腹泻病毒免疫蛋鸡制备出的卵黄抗体作为包被抗体,采用自制的单抗为一抗,建立牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA方法。通过试验确定,抗牛病毒性腹泻病毒卵黄抗体最佳包被浓度为1:50;McAb最适稀释浓度为1:10,HRP-羊抗鼠IgG工作浓度为1:800。通过引入牛病毒性腹泻病毒质控血清进行质控检验,该方法所得检测结果均在质量控制范围内,达到预定标准化要求。标准化的抗原捕获ELISA方法具有特异、灵敏、可靠、方便、快捷等特点,可广泛应用推广,为我国牛病毒性腹泻病毒监测提供了行之有效的技术手段。     

犬细小病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

利用本实验室建立的昆虫细胞/杆状病毒表达系统表达犬细小病毒病毒样颗粒（CPV-VLPs）,采用硫酸铵沉淀、蔗糖密度梯度离心对表达的CPV-VLPs进行纯化,用电子显微镜、SDS-PAGE及Western-blotting方法检测纯化效果。以纯化的CPV-VLPs作为包被抗原建立CPV间接ELISA检测方法,对各反应条件进行优化并分析其特异性、敏感性、重复性。结果显示,CPV-VLPs经过纯化后纯度可达到95%以上;优化的ELISA最佳工作条件为：纯化抗原包被浓度为5.0mg/L,4℃包被过夜;1%BSA,37℃封闭2h;待检血清1∶40稀释,37℃孵育1.5h;HRP标记的酶标二抗1∶20 000稀释,37℃孵育1h;TMB室温避光显色30min;确定的血清阴性阳性临界值D450nm值为0.264。该方法可特异性检测犬细小病毒阳性血清,与犬瘟热、犬传染性肝炎、犬冠状病毒病、狂犬病阳性血清均不发生反应。该方法的敏感性为1∶640,批内重复试验变异系数小于6%,批间重复试验变异系数小于8%。42份临床血清样本的检测结果表明,与血凝抑制试验的符合率为90.48%。     

检测犬免疫球蛋白G的夹心ELISA方法的建立

为建立犬免疫球蛋白G(Ig G)的检测方法,本研究以兔抗犬Ig G Fc段多克隆抗体为包被抗体,过氧化酶标记的兔抗犬Ig G(全分子)多克隆抗体为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA定量检测方法,并采用Protein A方法从犬血清中纯化犬Ig G作为ELISA检测标准品。该检测方法与小鼠、兔、马、牛、鸡及羊常见动物血清均无交叉反应,特异性好;最低检测下限可以达到4.8 ng/m L,敏感性较高。以本研究建立的ELISA方法检测犬细小阳性血清和阴性血清,阳性血清Ig G含量明显高于阴性血清;检测转染犬源化抗体序列重组质粒的细胞培养液上清,重组质粒在96 h表达量达到峰值。本研究为进一步建立稳定表达犬源化抗体的细胞系提供了特异性的定量检测方法。     

Comparison of competitive ELISA, indirect ELISA and standard AGID tests for detecting blue-tongue virus antibodies in cattle and sheep

The performances of a competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using a group specific monoclonal antibody against bluetongue virus, an indirect ELISA and the standard agar gel immunodiffusion (AGID) test were compared in the detection of serum antibody against bluetongue virus. Test sera consisted of 1300 bovine, 530 ovine and 160 carpine samples from bluetongue-free areas of Canada, 605 bovine and ovine field samples from the USA and Barbados and 464 samples from 79 cattle and sheep experimentally infected with 19 South African and five USA serotypes of bluetongue virus. The diagnostic specificity of the competitive ELISA, as determined for the bluetongue virus-free cattle sera was superior (99.92 per cent) to that of the indirect ELISA (99.85 per cent) and the AGID (99.0 per cent). The specificities of the competitive ELISA for sheep (99.63 per cent) and goats (100.0 per cent) sera were also higher than those of the AGID test. The performance of the ELISA tests was similar whether a gamma-ray-irradiated (2.0 Mrad) or a non-irradiated bluetongue virus antigen preparation was used. The competitive ELISA results for bovine field sera from endemic areas demonstrated a relatively low level of agreement (92.04 per cent) with AGID test results, with 9.7 per cent false negatives. The possible presence in these sera of antibody to cross-reacting antigens or to other orbiviruses, eg, epizootic haemorrhagic disease virus, which react in the AGID but not in the competitive ELISA may account for this lack of agreement.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)