DDRT-PCR与反向Northern杂交技术结合分离马铃薯mRNA差异表达片段*

mRNA差异显示(DDRT-PCR)[1]技术因其简便、快速和灵敏度高的特点,已在动植物分子生物学研究领域得到广泛应用.     

mRNA差异显示技术研究进展

分离和鉴定差异表达基因是分子生物学研究领域的热点之一。DDRT-PCR是目前该领域中最受青睐的技术。它有简便、灵敏和RNA用量少、且可同时比较多组样品等优点，但也存在假阳性率高、所得的差异片段较短等不足。针对这些缺陷，人们在引物的设计、DDRT和PCR参数的优化、差异显示凝胶的选择、阳性克隆的鉴定等环节进行了改进，并与其它生物技术结合，发展了该技术，如代表性差异分析、荧光mRNA差异显示和单个植入前胚胎mRNA差异显示技术，使该技术日臻完善。结合本研究室近年来的研究工作，对DDRT-PCR技术的原理、优越性、主要缺陷、技术改进及应用前景等方面进行简要综述。     

结球白菜结球莲座期和包心期叶片mRNA差异表达研究*

以结球白菜北京桔红心(Brassica campestris L.ssp.pekincnsis)为材料，选用4种G、C含量高的锚定引物和3种随机引物。在结球白菜莲座期和包心期叶片的mRNA差异显示电泳图谱中，选择23个差异cDNA片段进行反向Northern检验，从中得到两个在包心期表达量增加比较明显的阳性cDNA片段。核苷酸序列同源性分析发现，它们分别与编码转录延伸因子eEF-1和谷胱甘肽转移酶的序列高度同源，同源性分别为99％和85％，为探索结球白菜由莲座期至包心期发育过程中叶片基因表达的变化进行了初步研究。     

桃蔗糖酶基因的克隆和差异表达

以桃（Prunus persica)基因组DNA为模板,通过PCR方法得到含0.75kb的特异性条带,将其克隆到加T尾pBluescrips SK载体上,筛选到重组克隆,用限制性内切酶酶切鉴定至少可分为两组,一组是插入片段无HindⅢ位点,一组是据入片段有HindⅢ位点。对两组pPIN02和pPIN04克隆插入片段两端进行核苷酸序列分析表明,pPIN02和pPIN04插入片段全长744个碱基,编码248个氨基酸,核苷酸和氨基酸同源性分别为70．7％和75．9％。与其它植物蔗糖酶氨基酸序列同源性约为60％－72％。RNA点杂交表明pPIN02和pPIN04在果实都能表达,但表达模式有所不同。     

水杨酸诱导下人参培养物差异表达基因片段的克隆

本研究以人参愈伤悬浮细胞为材料,在其生长的第28天添加1×10^-3mg／L水杨酸,测定水杨酸添加后,过氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶等3种酶在72h内的变化及皂苷含量,结果表明：水杨酸添加后对过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶的活力影响最大,分别在24h和48h达到最大峰值,在18h开始影响多酚氧化酶的活力,培养物生长的第28天添加水杨酸可以明显提高人参愈伤组织中皂苷的合成。确定添加水杨酸后24h提取总RNA,进行cDNA-RDA分析,筛选差异片段。确定差异基因并在GenBank中注册,注册号为FE900130。为探讨水杨酸作为诱导子对人参次生代谢的影响奠定基础。     

玉米耐旱自交系在干旱条件下的mRNA差异表达

用16%PEG-6000对玉米耐旱自交系“81565”进行模拟干旱处理,用DD-PCR技术研究干旱与正常浇水对照的mRNA差异表达,发现3个干旱条件下差异表达的特异片段MD1、MD2和MD3。MD1和MD2在干旱条件下减量表达,MD3为干旱诱导表达。序列分析和同源性比对表明,MD1与玉米叶绿体基因组中编码参与RNA转录本Ⅱ型内含子剪切的成熟酶的matK基因有93%的相似性,MD2与极端耐旱的Sporobolus stapfianus的丝氨酸/苏氨酸2C型蛋白磷酸酶基因PP2C的相似性达99%,MD3与属天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶类的水稻metacaspase基因有99%的相似性。根据各自序列相似同源基因的功能推测,MD1、MD2和MD3三个片段可能与“81565”的耐旱机制有关。     

葡萄银染mRNA差异显示分析体系的建立及优化

mRNA差异显示(mRNA differential display)技术是筛选差异表达基因有效的方法之一（Peng and Agthui,1992)。本研究以中国葡萄属野生种的葡萄叶片为材料,采用改进的SDS／酚法(张今今等,2003)提取叶片总RNA,采用优化后的银染差显体系,比较葡萄白粉病病原菌诱导前后6个不同时期的样品,获得了数量适宜、差异显著和重复性好的差异表达cDNA片段。     

玉米幼苗胚根和胚芽基因表达的差异及差异条带的克隆

本实验以１２个３’锚锭引物和１０个５’随机引物构成引物组合，运用ｍＲＮＡ差异显示方法比较玉米品种“农大３１３８”萌发４８ｈ胚芽和胚根的基因表达差异。结果表明，在１２０个引物组合中有４０个引物组合可以扩增出差异条带，其中以ＡＧ、ＧＡ、ＧＧ、ＡＴ结尾的锚锭引物扩增效果较好。对经反向Ｎｏｒｔｈｅｒｎ验证的６个片段克隆测序，并在Ｇｅｎｅｂａｎｋ中进行同源性比较，发现２个在胚芽和胚根中表达量都很高的ｃＤＮＡ     

不同杂交水稻籽粒灌浆期叶片蛋白的差异表达分析

为明确超级杂交水稻高产形成的分子机理, 以超级杂交水稻“Ⅱ优航2 号”为试验材料, 杂交水稻“汕优63”为对照, 运用双向电泳结合质谱技术, 比较分析了籽粒灌浆过程中两种不同“源”类型杂交水稻叶片蛋白的差异表达情况。结果显示, 两种不同类型水稻叶片蛋白中共有22 个蛋白点出现显著差异表达, 其中有20 个蛋白功能得到鉴定。通过对差异蛋白功能及表达丰度的分析, 相对于“汕优63”,“Ⅱ优航2 号”在灌浆期光合代谢、抗逆反应、基因转录表达、细胞生长、能量代谢等生理活动过程中表现出较大优势,是其叶片在籽粒灌浆期“源”优势的主要体现。本研究从差异蛋白水平明确了航天超级杂交稻高产形成的“源”特征,丰富了籽粒灌浆的“源、库、流”理论, 为超级杂交水稻育种提供理论依据。     

仔猪多胺代谢相关基因的克隆及断奶对其mRNA表达的影响

多胺是一类广泛分布于组织细胞内的天然低分子多价生物活性物质,在动物的消化、营养代谢以及正常生长中发挥重要作用。本实验克隆了猪(Susscrofa)的7个与多胺代谢相关的基因,分别是精氨酸脱羧酶(ADC)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、鸟氨酸转氨酶(OAT)、鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白1~3(OAZ1、OAZ2、OAZ3)及多按调控因子-1(PMF1),基因片段长度分别是1602(GenBank No.EU545649)、1422(GenBank No.EU534186)、1465(GenBank No.EU404089)、874(GenBank No.EU545195)、678(GenBank No.EU545196)、667(GenBank No.EU545197)及703bp(GenBankNo.EU534185),开放阅读框的长度分别是1380、1383、1313、681、568、559和615bp,编码的氨基酸数目分别是460、461、439、227、189、186和205。经过比对分析,猪ADC基因编码的氨基酸序列与人、小鼠的同源性分别为89.7%和87%;猪ODC与人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)和大鼠(Rattus norvegicus)的同源性分别为93.1%、89.8%和90.5%;猪OAT与人、小鼠的同源性分别为91.8%、90.5%和89.8%;猪OAZ1与人、大鼠及小鼠的同源性分别为93.4%、82.5%和83.8%;猪OAZ2与人、大鼠及小鼠的同源性分别为99.5%、98.9%和98.9%;猪OAZ3与人、小鼠和大鼠的同源性分别为90.4%、87.5%和84.2%;猪PMF1基因编码的氨基酸序列与人和小鼠的同源性为84%和70.9%。半定量RT-PCR分析表明,断乳后ADCmRNA的表达量在盲肠和直肠有所增加,其他各组织均有所降低;ODCmRNA的表达量在直肠和盲肠有较大增加,结肠、回肠和空肠的表达量均呈小幅降低;OATmRNA在肾的表达量有明显增加,十二指肠、空肠和回肠都有降低;除了胃,OAZ1mRNA在其他组织表达水平均有所增加;OAZ2mRNA的表达量在所有组织均有不同程度增加,盲肠居首;OAZ3mRNA在肠道组织的表达量均有不同程度增加;PMF1mRNA的表达量在结肠、空肠和回肠与抗酶家族相似,但断乳后有小幅降低。研究结果提示,多胺对仔猪的生长、发育、成熟、适应性和损伤后的恢复具有重要的生物学作用。     

太空诱变玉米核雄性不育材料的cDNA-AFLP分析

利用cDNA-AFLP技术对太空诱变玉米核雄性不育材料的花药进行差异表达分析,并对差异片段进行回收、克隆和测序,结合半定量RT-PCR方法,分析差异片段在可育株和不育株的表达情况。利用16对引物共回收得到9个差异序列,其中2个为来自不育株的特有片段,7个为来自可育株的特有片段。序列分析发现,来自不育株的 2个EST序列未检测到同源性较高的序列。来自可育株的4个EST序列分别与水稻上推断的查尔酮合成酶、脂酰CoA脱氢酶、蛋白激酶PK12、甘氨酸脱羧酶具有较高的同源性。这些物质可能参与小孢子发育过程中的物质代谢、能量代谢及信号传导等。半定量RT-PCR分析表明,与查尔酮合成酶同源性较高的Z3片断在可育花药发育的早期有较高的表达。而与甘氨酸脱羧酶同源性较高的片断Z8在可育花药发育的中间阶段呈增量表达。这可能与花药发育过程有较高的能量和物质需求有关。     

棉花纤维起始期基因表达的cDNA-AFLP分析

摘要：利用cDNA-AFLP差异显示技术比较了棉花(Gossypium hirsutum L.)品系徐州142及其无纤维突变体的胚珠在纤维起始期（开花后0和4 d）的基因表达，结果表明，在总共显示的561条带中两种胚珠各有特异带83条。将正常有纤维胚珠的差异片段47个进行反向 Northern blot检验，32个在有纤维胚珠中特异表达。选取18个在有纤维胚珠中特异表达的片段进行序列分析，结果表明，8个分别与polyphosphoinositide结合蛋白、细胞色素氧化酶亚基Ⅱ、β-葡萄糖苷酶、蔗糖合成酶、Ca2+通道蛋白、水稻高渗反应蛋白osr40、类TSO1蛋白序列有相似性；4个与拟南芥(Arabidopsis thiliana )的假拟蛋白相似；另有6个找不到相似序列。     

长爪沙鼠TLR4基因片段克隆及其在脏器中的表达和分布特征

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是参与调节先天免疫的一类具有高度保守性的蛋白受体.为克隆长爪沙鼠(Meriones unguiculatus) TLR4基因片段,分析其在内脏组织中的分布特征,本研究通过分析比较大鼠(Rattus norvegicus)、小鼠(Mus musculus)与仓鼠(Mesocricetus auratus) TLR4基因序列,选择保守区设计引物,扩增长爪沙鼠TLR4基因片段;将所得片段连接到克隆载体上,测序并使用DNASTARMeglign软件分析该序列与其他不同种属动物TLR4基因序列同源性;采用半定量PCR与免疫组织化学技术分析TLR4在正常长爪沙鼠脏器组织中的表达情况.结果显示,本研究成功克隆了长爪沙鼠TLR4基因片段(GenBank登录号:KX137123),BLAST分析比对发现,与其他鼠类的TLR4基因同源性在87.4％以上,与仓鼠的同源性较高(89.1％),与人(Homo sapiens)、猪(Sus scrofa)的TLR4同源性较低,分别为69.5％和73.1％,提示长爪沙鼠与仓鼠的亲缘关系较近,与人和猪的亲缘关系较远.半定量PCR分析结果显示,TLR4基因在长爪沙鼠心、肝、脾、肺和肾中呈差异表达,以肺脏中表达量最高,肝脏中表达量最低.免疫组化结果表明,在长爪沙鼠的肺脏和脾脏组织中可见较多TLR4阳性反应产物,在肺脏中阳性反应产物主要见于肺泡支气管上皮细胞;在脾脏中阳性反应产物主要见于脾小结周围的边缘区,淋巴小结内也可见少量分布;肾脏中偶见阳性反应产物分布,心脏和肝脏上均未检出,这与转录水平结果较一致.研究结果为探究长爪沙鼠先天免疫及其作为良好的动物感染模型提供了理论依据.     

猪Nramp1基因启动子克隆及其组织表达活性分析

Nramp1基因在猪肺泡巨噬细胞中具有较高的组织表达特异性,本研究的目的是克隆并分析猪(Sus scrofa)Nramp1基因在肺泡巨噬细胞中的特异性表达调控元件.本研究首先利用5'RACE技术确定了Nramp1基因转录起始位点,在此基础上构建了-1 327～+86 bp区域内不同长度的嵌套缺失片段,分别连接至pGL3-BASIC载体上,构建了pLUC1430、pLUC1136、pLUC840、pLUC751、pLUC487、pLUC379、pLUC274及pLUC179共8个缺失表达载体.采用脂质体转染法,与海肾荧光素酶载体共转染猪肺泡巨噬细胞、肾细胞、脂肪前体细胞和胎儿成纤维细胞,采用双荧光素酶报告系统验证了Nramp1基因不同启动子片段的表达活性,结果表明Nramp1基因核心启动子区位于-386～-173 bp.进一步比较了pLUC487[-386～+86]启动子区在巨噬细胞、猪肾细胞、脂肪细胞和胎儿成纤维细胞中的表达活性,结果表明Nramp1基因在巨噬细胞中的表达活性极显著地高于肾细胞、脂肪细胞和成纤维细胞(P<0.01),表明Nramp1基因启动子具有较高的巨噬细胞特异性.本研究获得了能够在猪肺泡巨噬细胞中特异表达的调控元件,为进一步实现外源基因在猪肺泡巨噬细胞中的特异性表达提供了基础.     

龙眼成花逆转相关基因表达的cDNA-AFLP分析

摘要：以龙眼正常成花花芽和成花逆转花芽为试材,应用cDNA-AFLP技术,研究龙眼正常成花与成花逆转花芽cDNA的差异表达,并利用RT-PCR技术验证,探讨了龙眼成花逆转的分子机制。通过64对引物组合的cDNA-AFLP分析获得了2 560条扩增片段。选择其中有明显差异的片段进行回收、测序,获得了14条核苷酸序列。其中有13个片段在GenBank数据库中发现同源序列,1个功能未知。通过核酸和氨基酸比对分析,与龙眼成花逆转相关的112基因片段同源于银灰杨（Populus tremula x Populus alba）中编码Nek激酶家族(NIMA related protein kinases)基因（83 ％）, 331的核苷酸序列（80％）同源于与拟南芥（Arabidopsis thaliana）中编码内切-1,4-β-葡聚糖酶(EGases)的基因,313的核苷酸序列（78%）同源于与柑橘（Citrus sinensis）中的几丁质酶（chitinase CHI1）基因。     

国兰叶色突变体根状茎差异表达基因分析

兰花叶色对其观赏及商业价值具有非常重要的意义.国兰春剑隆昌素(Cymbidium longibracteaturn Longchangsu)及其叶色突变体叶艺隆昌素是研究兰花叶色形成机制的重要材料.本研究采用Illumina Hiseq2500对这2种材料的根状茎进行denovo转录组测序,以鉴定其与叶艺形成相关的差异...     

香鱼抗凝血酶基因(AT)cDNA的克隆、序列分析及组织表达特征

抗凝血酶(antithrombin,AT)主要抑制凝血酶(thrombin)及其它凝血因子的活性,并具有重要的抗炎活性。本实验从香鱼(Plecoglossus altivelis)肝组织cDNA文库中成功获得了香鱼AT基因的cDNA全序列(EMBL登录号:FN429980)。测序结果表明,香鱼AT基因cDNA全长1487个核苷酸,包含1个大的开放阅读框(ORF),推测编码1个由453个氨基酸组成的蛋白,N端23个氨基酸为信号肽序列。成熟AT具有与哺乳动物AT相似的特征结构,包括:羧基末端附近的丝氨酸蛋白酶活性中心、6个保守的Cys残基形成的3个二硫键结构和4个N-糖基化位点。氨基酸序列分析表明,香鱼AT与大西洋鲑(Salmo salar)AT氨基酸序列同源性最高,为81%。系统进化树分析表明,物种AT的进化关系与目前接受的物种分类关系基本一致,香鱼AT位于鱼类AT簇中,与大西洋鲑、红鳍东方豚(Takifugu rubripes)和斑马鱼(Danio rerio)AT进化相关性最高。AT mRNA在健康香鱼的肝组织中表达量最大,在脾、肾和脑中表达量较低。实时荧光定量PCR结果表明,在鳗利斯顿氏菌(Listone...     

桑树中miR319的克隆及在雄花发育中表达分析

为探究miR319及靶基因在调控桑树雄花发育的分子机制,本研究通过石蜡切片技术判断桑树雄花芽发育时期及在线网站预测miR319的靶基因。结果表明,桑树雄花芽发育分为未分化期(A1)、分化初期(A2)、花序分化期(A3)和总苞形成期(A4)4个不同的阶段;桑树中miR319家族存在miR319a、miR319b和miR319c 3个成员,其中miR319b与miR319c位于同一条前体序列上,预测并获得了miR319 6个靶基因。运用5'-RACE技术验证了miR319a的4个靶基因,其切割位点主要集中在与miRNA互补位点的第10和第11位碱基之间。采用RT-qPCR技术检测miR319a及靶基因在雄花发育不同阶段的表达水平,发现miR319a在雄花发育A2-A3阶段表达水平迅速降低,靶基因Morus012208、Morus008229、Morus008100与Morus005893在此阶段表达水平迅速升高,茉莉酸(JA)含量也迅速升高。同时,JA合成关键基因PLDα1和LOX5在雄花发育A2-A3阶段表达上调,表明miR319通过调控靶基因影响JA合成来调控桑树花序分化。本研究为揭示桑树miR319在JA途径中调控花发育中的分子调控机制奠定了一定的理论基础。     

拟南芥低温诱导cor15a基因的启动子克隆及在转基因马铃薯中的表达

利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)品种Columbia的基因组中扩增出低温诱导基因cor15a的启动子片段并插入克隆载体。序列分析表明，克隆的启动子长900bp，与目前已经发表的启动子序列完全一致。将此启动子插入pBI121的gus基因及NOS终止子上游构成表达载体pLB，通过直接法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，并转化马铃薯(Solarium tuberosum)获得转化再生植株。再生植株PCR检测和PCR-Southern鉴定结果证明，cor15a基因启动子已经成功地转入到马铃薯植株基因组中。GUS组织染色证明拟南芥cor15a启动子在马铃薯中也同样具有低温诱导表达的能力。