河南中牟县奶牛片形吸虫感染情况调查及种类鉴定

利用尼龙袋集卵法对奶牛粪便中的虫卵收集、镜检,利用PCR技术对片形吸虫分离株线粒体nad1基因序列进行扩增与分析。结果显示:13份样品检测为阳性,阳性率5.41%(13/240),13个分离株nad1序列长度基本一致,为442~446 bp;通过种系发育分析结果显示,中牟县奶牛片形吸虫种类主要为肝片吸虫和大片吸虫,优势虫种为大片吸虫。说明中牟县奶牛片形吸虫流行情况较为严峻,需要引起当地防疫部门和养殖户的注意。     

河南济源地区奶牛肝片吸虫感染情况调查

为了解河南济源地区奶牛肝片吸虫感染情况,以期为该病的防制和进一步研究奠定基础,本研究采用尼龙袋集卵法对奶牛粪便中虫卵进行收集、镜检,摸清奶牛肝片吸虫病在济源市流行情况,利用PCR技术对肝片吸虫分离株线粒体nad1基因序列进行扩增与分析。结果显示,13份样品检测为阳性,阳性率为5.41%,13个分离株nad1序列长度基本一致,为488～494bp,各分离株间同源性为99.3%～100.0%;种系发育分析结果显示,所有的济源市分离株与Genbank收录的肝片吸虫分离株位于同一大分支,与大片吸虫所属分支较远。     

吸虫线粒体基因组及其应用研究进展

吸虫病(Trematodiasis)如血吸虫病、肝片形吸虫病等是一类重要的人兽共患寄生虫病,在我国和世界各地普遍流行,危害严重。本文将对吸虫线粒体基因组全序列分析的研究进展、应用和今后的发展方向作一综述。目前,已完成包括复殖亚纲10个种和单殖亚纲4个种总计14种吸虫线粒体基因组全序列测定。吸虫线粒体基因组碱基组成、基因结构与排列、基因变异等分析结果为线粒体功能基因组学研究、比较基因组学研究、分子分类学研究、物种起源、分子系统发育与进化分析及其疾病诊断等提供了重要依据和指导作用。线粒体基因组序列分析有助于解决一些新近发现的种如三平并殖吸虫、中华血吸虫等独立种的分类地位;而怡乐村并殖吸虫和佐渡并殖吸虫是大平并殖吸虫的同物异名吸虫。日本片形吸虫与大片形吸虫的cox1基因序列完全一致,这些日本片形吸虫应为大片形吸虫;大片形吸虫不同株虽然在cox1基因序列上无差异,但nad1基因却有8.3%变异性,这表明大片形吸虫不同株中可能存在隐蔽种。总之,线粒体基因组序列可为吸虫虫种与虫株的分类学地位的确定提供重要依据。同时,人们可根据线粒体基因组序列,通过PCR方法有效地对临床上易混淆的吸虫的种、株或群等作出确切的鉴别与诊断,从...     

猪囊尾蚴西昌分离株线粒体cox1和nad1基因的序列测定与种系发育分析

应用PCR技术对3个猪囊尾蚴西昌分离株的线粒体细胞色素C氧化酶第Ⅰ亚基(cox1)基因全序列和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原酶第一亚基(nad1)基因部分序列进行扩增,分析其遗传变异,并用Mega 5.0程序NJ法绘制种系发育树,探讨不同地区来源的猪囊尾蚴种系发育关系。测序结果显示,猪囊尾蚴的cox1基因全序列长度为1 620bp,nad1基因部分序列长度为796bp。cox1和nad1基因序列均存在一定的遗传变异,且cox1基因序列的变异高于nad1序列。种系发育分析结果显示,所有猪囊尾蚴分离株构成一个分支,3个西昌分离株均属于猪带绦虫亚洲基因型。结果表明,cox1和nad1基因均可用于猪带绦虫的分子分类,为猪带绦虫病/猪囊尾蚴病的分子诊断奠定了基础。     

绵羊肝片吸虫谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆与序列分析

本研究扩增肝片吸虫(Fasciola hepatica,Fh)谷胱甘肽硫转移酶(GST)基因,并进行同源性分析。根据GenBank发表的部分Fh GST基因序列设计并合成一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增出Fh GST基因完整的开放阅读框(open reading frame,ORF),测定序列,使用分子生物学软件进行同源性分析。获得Fh GST基因全长682 bp,编码218个氨基酸,与澳大利亚分离的肝片吸虫GST同源性较高,与大片吸虫和卫氏并殖吸虫的GST也有较高的同源性。不同虫株GST基因具有较高的同源性,因此Fh GST蛋白不适合用作诊断抗原,但由于其存在交叉反应,GST基因作为分子疫苗的候选基因具有重要意义。肝片吸虫GST基因的克隆,为进一步研究GST蛋白的功能和作用奠定了基础。     

Pseudoterranova decipiens复合种的几个姊妹种种间线粒体nad1基因序列差异的研究

对来自世界各地的P．declplens复合种共6个姊妹种的线粒体（mtDNA）NADH脱氢酶亚单位Ⅰ基因（nad1）序列进行PCR扩增、克隆、测序和序列分析。结果显示，nad1基因序列种间差异为3．6％～15．0％，遗传差异性分析结果与ITS1、ITS2和cox1的基因序列遗传差异性分析结果基本上一致，nad1能提供准确的遗传标记，可用于P．decipiens复合种姊妹种的鉴定。这些结果有助于阐明P．declpiens复合种种间的遗传变异，为进一步的分子遗传学和分子诊断学研究奠定基础。     

牛蜱龙岩分离株的分子鉴定

为了解福建省龙岩地区牛场体表蜱的种类,试验采集龙岩地区牛体表寄生蜱样本,基于蜱的核糖体rDNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列PCR扩增方法进行分子鉴定,获得ITS1和ITS2基因序列,进行blastn相似性搜索,应用MegAlign和MEGA 7.0软件完成同源性分析及种系发育分析。结果表明,该蜱ITS1序列与中国甘肃微小扇头蜱分离株同源性达99.32%(JQ737124.1、JQ737125.1),与中国湖南微小扇头蜱HAI2分离株同源性达99.16%(MK224531.1);ITS2序列与中国河南、南非豪登微小扇头蜱分离株同源性均为100%(KX450287.1、KY457506.1);种系发育分析结果显示,龙岩地区牛体表分离的牛蜱ITS基因序列与扇头蜱属ITS基因序列聚类,与革蜱属和璃眼蜱属处于两个不同的分支。说明福建龙岩牛蜱分离株为微小扇头蜱。     

酶切图谱及序列分析虫体ITS2鉴别中国的片形吸虫

提取我国广西、四川、黑龙江、甘肃等地及法国的片形吸虫的总DNA，用PCR扩增完整的ITS－2。对得到的PCR产物用限制性内切酶Hsp 92Ⅱ，RcaI进行酶切和RFLP技术分析。并对ITS－2PCR产物进行双向测序。以便确定国内片形吸虫种内及种间ITS－2的特点和序列变异的水平。结果显示：广西、四川、黑龙江、法国等地的样品通过PCR均扩增到约550bp的ITS－2目标片段。Hsp92 Ⅱ,Rcal可区别不同种的片形吸虫。对PCR产物的序列分析结果表明片形吸虫ITS－2全长均为362bp，同种内ITS－2序列无变异，不同种间ITS－2序列存在5－6个碱基差异，变异率约为2.8%。对各地区片形吸虫ITS－2的PCR－RFLP分析与对PCR产物的DNA序列分析一致证明，来自四川的样品和法国样品同属肝片形吸虫F.hepatica；广西样品属大片形吸虫F.gigantica；黑龙江的样品为中间型片形吸虫。本研究首次从分子水平上证实我国除有肝片形吸虫、大片形吸虫外，还存在中间型的片形吸虫。     

阿拉尔市售鸽蛔虫种类的分子鉴定

为了解阿拉尔市售鸽的蛔虫感染种类,采用剖检法对从阿拉尔市农贸市场购买的110羽鸽进行检查,发现14羽感染蛔虫,感染率为12.7%(14/110);共获虫体188条,最大感染强度为48条/羽。随机提取10条虫体DNA,分别基于线虫SSUr DNA、nad2和cox1基因位点进行PCR扩增和测序,结果显示：所获虫体的SSU rDNA和nad2基因序列与鸡尾鹦鹉蛔虫同源性分别为99.9%和100%;cox1基因序列与鸽蛔虫同源性为97.9%;鉴定本次分离的虫体为鸡尾鹦鹉蛔虫。进化分析显示,本次所获鸽源蛔虫分离株与鸡尾鹦鹉蛔虫分离株聚类在一支,而与其他属蛔虫处于不同分支。研究结果为鸽源蛔虫的种类鉴定提供了基础资料。     

山羊源枝睾阔盘吸虫的形态和分子鉴定

为鉴定采自西昌市6只山羊体内的小型吸虫的种类,本研究采用传统的形态学观察和PCR方法对其进行种类鉴定。经形态学观察,发现采自6只山羊体内的吸虫与枝睾阔盘吸虫形态相似;对6个样本虫株cox1基因部分序列进行PCR扩增和序列测定,并用cox1序列构建其与其他吸虫的系统发育关系。测序结果显示所获得的吸虫cox1基因片段大小为429 bp,6个虫株的同源性为97.7%~99.8%;构建的NJ系统发育树显示6个虫株与胰阔盘吸虫的亲缘关系最近。因此,结合形态学观察结果,将分离的6个小型吸虫虫株均鉴定为枝睾阔盘吸虫。研究结果为枝睾阔盘吸虫病的分子诊断、分子流行病学调查的进一步研究奠定了基础。     

分子分类结合形态学观察鉴定重庆地区片形吸虫种类

目的明确重庆地区片形吸虫的种类,并为重庆地区片形吸虫的分类研究提供科学的参考依据。方法在对重庆地区黄牛、水牛肝脏上寄生的片形吸虫形态结构进行观察后,根据片形吸虫第一内转录间隔区(ITS-1)和第二内转录间隔区(ITS-2)基因设计特异性引物,运用多聚酶链式反应(PCR)技术,以法国肝片吸虫gDNA为对照,对所采样品gDNA用大片吸虫和肝片吸虫的ITS-1和ITS-2特异性引物进行扩增。结果形态学鉴定均为“不规则”片形吸虫,电泳结果显示均分别扩增出特异性ITS-1和ITS-2条带。结论综合形态学和PCR鉴定结果,初步认为重庆地区存在着大片吸虫和肝片吸虫的“中间型”。     

豆状带绦虫线粒体rrnL和nad5基因的克隆及种系发育研究

本研究旨在阐明中国豆状带绦虫囊尾蚴河南分离株线粒体核糖体大亚基基因(rrnL)部分序列(prrnL)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位5基因(nad5)部分序列(pnad5)的遗传变异情况,并用prrnL和pnad5序列重构豆状带绦虫与其他带科绦虫的种系发育关系。采用聚合酶链式反应(PCR),扩增豆状带绦虫囊尾蚴分离株的线粒体prrnL和pnad5,将所测的序列用PAUP 4.0 Beta 10程序MP法绘制种系发育树,利用DNAStar 5.0中的MegAlign程序进行同源性分析。所获得的豆状带绦虫线粒体prrnL长度约为847 bp,pnad5为602 bp。所获rrnL序列与GenBank中豆状带绦虫相应序列的相似性为99.1%~100%,nad5为99.2%~100%;河南分离株之间rrnL序列的相似性为99.65%,nad5为99.5%;与GenBank中其他带科绦虫序列的相似度rrnL低于83.4%,nad5低于85.7%。种系发育分析结果表明,所有豆状带绦虫分离株和已知豆状带绦虫位于同一分支。由于豆状带绦虫分离株的线粒体rrnL和nad5基因序列种内很保守,种间差异较大,故可作为带科绦虫种间遗传变异研究的标记。     

鸡蛔虫线粒体cox1和nad4基因的遗传变异分析

为探究鸡蛔虫的种内遗传变异和系统发育关系,对分离自四川省西昌市的15个鸡蛔虫分离株的线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅰ亚基（cox1）基因部分序列和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位Ⅳ（nad4）基因全序列进行PCR扩增、序列测定及分析,并用cox1和nad4基因部分序列构建鸡蛔虫与其他蛔虫的NJ树和贝叶斯树。测序结果显示,所获得的鸡蛔虫cox1和nad4基因全序列长度分别为1 152和1 236 bp,分别有33和40个变异位点,碱基变异率分别为0~2.1%和0~2.3%;分别检测到8和11个单倍型,总的单倍型多样性分别为0.733±0.124和0.933±0.054,核苷酸多样性分别为0.00433±0.00153和0.00541±0.00157,平均遗传距离分别为0.004和0.005。构建的种系发育树均显示15个鸡蛔虫西昌分离株与其他国家/地区的鸡蛔虫分离株聚类形成一个分支,与鸽蛔虫的亲缘关系最近,与其他蛔虫所属的分支相隔较远。研究结果表明鸡蛔虫西昌分离株的遗传变异程度低,且nad4基因比cox1基因更适合作为研究鸡蛔虫分离株遗传变异的分子标记。     

六枝特区畜禽寄生虫名录

我们进行了六枝特区畜禽寄生虫区系调查，经鉴定寄生虫有88种，隶属于7纲、13目、29科、48属。现将名录及宿主报告如下：一、吸虫纲Trematoda（一）复殖目Digenea1．片形科Fasciolidae（1）片形属Fasciola肝片形吸虫F．hepatica黄牛、水牛、绵羊、山羊大片吸虫F．gigantica黄牛、水牛2．双腔科Dicrocoeliidae（2）阔盘属Eurytrema胰阔盘吸虫E．pancreaticum绵羊、山羊支睾阔盘吸虫E．cladorchis黄牛、绵羊、山羊腔阔盘吸虫E．coelomaticum绵羊3.同盘科Paramphistomatidae（3）同盘属Paramphistomum鹿同盘吸虫P．cervi黄牛后滕同盘吸虫…     

片形吸虫Cold-SSCP鉴别方法的建立

以采自我国不同地区的片形吸虫虫体为研究对象，PCR扩增出核糖体DNA (rDNA)的第一内转录间隔区(ITS-1)序列，然后采用非同位素的单链构象多态性(Cold-SSCP)方法分析PCR产物，对不同地区片形吸虫进行分子鉴定。所有样品经Cold-SSCP分析显示2种带型。样品测序及序列分析结果表明，第1种为肝片形吸虫带型，另1种为大片形吸虫带型。本研究建立了区分大片形吸虫和肝片形吸虫的Cold SSCP方法，可用于这2种吸虫的分子流行病学调查，从而为片形吸虫分子生物学的进一步研究奠定了基础。     

肉牛源细极链格孢菌的分离鉴定

为鉴定肉牛皮肤病病原及其致病性并筛选其敏感药物,本研究取患皮肤病肉牛病变部位皮屑、毛发和痂皮进行病原菌的分离,并对分离菌株进行了形态学鉴定、ITS序列分析、小鼠致病性试验和药敏试验。结果显示分离到1株形态特征与细极链格孢菌极其相似的菌株(PY2-1-2);经PCR扩增、测序和BLAST序列比对,结果显示分离株(PY2-1-2)的ITS基因序列与细极链格孢菌(MG975630.1)的ITS基因序列的相似性为99%,分离株PY2-1-2的ITS基因序列长度为543 bp,该片段包括ITS1、5.8S rDNA和ITS2的全部基因序列以及18S rDNA和28S rDNA的部分基因序列,提交GenBank(MH656780.1)。根据形态学结合ITS基因序列分析结果确定该分离株为细极链格孢菌。小鼠致病性试验结果显示该菌对小鼠有致病性。药敏试验结果显示:该菌对灰黄霉素、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑的最小抑菌浓度(MIC)值分别为0.5μg/mL、4μg/mL、1μg/mL、1μg/mL。本研究为今后进一步探究细极链格孢菌引起的皮肤病诊治提供科学有效的参考。     

片形吸虫第一内转录间隔区DNA多态性的研究

以不同地区的片形吸虫虫株为研究对象，经PCR扩增出了ITS-1部分基因片段，采用单链构象多态性(SSCP)方法，并结合序列分析研究了不同地区片形吸虫ITS-1 DNA的多态性。不同地区的样品经SSCP分析，显示3种带型，第1种为大片形吸虫的带型，第2种为肝片形吸虫的带型，第3种为2种带形的混合带型。广西区样品和大部分贵州省样品属于大片形吸虫带型；四川省、黑龙江省和部分贵州省样品为混合带型；南京市和甘肃省样品为肝片形吸虫带型或混合带型。测序结果表明，根据ITS-1基因的序列变异位点可区分2种片形吸虫；表现为混合带型的样品在变异位点具有多态性。本研究结果显示，ITS-1片段可作为遗传标记用以区分大片形吸虫和肝片形吸虫，同时也证实，在我国除了这2种片形吸虫外，还可能存在着“中间型”的片形吸虫。     

小熊猫槽盘吸虫的形态学鉴定及分子进化研究

为鉴定我国黑龙江省分离的小熊猫肠道吸虫的种类及确定其在复殖吸虫中的分类地位,本研究首先对分离的吸虫进行染色制作虫体装片,根据虫体形态学特征初步鉴定为小熊猫槽盘吸虫。采用PCR方法扩增该吸虫的rDNA ITS序列,测序后与NCBI数据库中相关序列进行比对分析。结果表明,本研究分离的吸虫rDNA ITS序列全长为936 bp,其中ITS-1、5.8S和ITS-2序列分别为518 bp、126 bp和292 bp,与NCBI数据库中鹿槽盘吸虫(Ogmocotyle sikae)的同源性达到94.9%。最后,基于rDNA ITS-2序列构建系统发生树,探讨本研究中分离的吸虫在复殖吸虫中的分类地位。进化分析结果表明,在复殖目吸虫的分支中,本次分离的小熊猫肠道吸虫与槽盘属吸虫处于同一分支,因此鉴定本研究分离的吸虫为小熊猫槽盘吸虫。研究填补了槽盘吸虫的分子数据,为小熊猫槽盘吸虫病的流行及防控提供依据。     

湖南娄底市犬弓首蛔虫流行状况及线粒体cox1和nad4序列变异分析

为了解湖南省娄底市犬弓首蛔虫流行状况及虫株遗传变异情况，本试验于2021年3—9月对该地区368份犬粪便和104份环境(土壤和水源)样品的犬弓首蛔虫污染情况进行调查；对9个犬弓首蛔虫分离株线粒体cox1和nad4序列进行扩增、测序与分析。结果显示：被调查的犬粪便和环境样品的犬弓首蛔虫虫卵检出率分别为13.59%(50/368)和18.27%(19/104);其中宠物犬(11.74%)较流浪犬(17.36%)来源粪便样品检出率低，公园来源土壤样品(9.09%)较小区来源样品(3.92%)检出率高；9个犬弓首蛔虫分离株线粒体cox1和nad4序列长度分别为424 bp和1 197 bp,核苷酸序列同源性为99.4%～100.0%和98.7%～100.0%,与其他具有代表性蛔虫分离株对应序列同源性均低于90%;9个犬弓首蛔虫分离株线粒体cox1和nad4序列核苷酸多样性分别为0.007±0.002和0.006±0.003。结果表明湖南娄底市犬弓首蛔虫分离株遗传变异较低，但虫卵流行状况严重，且存在于公共环境中，对人类健康造成潜在威胁。     

一株貉子源毛滴虫的分离鉴定

为进一步鉴定从河北秦皇岛地区腹泻貉子的盲肠中新分离得到的一株毛滴虫,本研究分别对其进行了分离与体外培养、形态学观察及18S rRNA和ITS1-5.8S rRNA-ITS2基因序列相似性分析。形态学观察结果表明从貉子体内分离的毛滴虫具有4根前鞭毛和一根独立鞭毛,为人五毛滴虫形态结构。18S rRNA和ITS1-5.8SrRNA-ITS2基因序列与GenBank中登录的人五毛滴虫基因序列的相似性均为99%。基于18S rRNA和ITS1-5.8SrRNA-ITS2两种基因构建系统进化树,结果显示本研究从貉体内分离的毛滴虫与人五毛滴虫处于同一进化分支,亲缘关系较近。综合以上鉴定结果表明本研究从秦皇岛地区貉子体内所分离的这株毛滴虫为人五毛滴虫。由此推断貉子毛滴虫病可能由人体内的毛滴虫感染所致。