竹叶黄酮对过氧化氢诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的保护作用

本试验旨在筛选建立过氧化氢(H₂O₂)诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激模型的最佳条件，并探究竹叶黄酮(BLF)对奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的保护作用。以奶牛乳腺上皮细胞MAC-T细胞系为研究对象，将维持培养基中处理的MAC-T设为对照组，在维持培养基中添加不同浓度(200～1 000μmol/L) H₂O₂处理的MAC-T设为氧化损伤组，在维持培养基中添加80μg/mL BLF和800μmol/L H₂O₂处理的MAC-T设为BLF预处理组。采用细胞增殖试剂盒(CCK-8)法检测细胞活力，采用乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞凋亡率，每次试验平行孔6个，重复试验3次。利用倒置荧光显微镜观察细胞内活性氧(ROS)含量的变化，利用试剂盒法检测细胞内抗氧化指标的变化，利用实时荧光定量PCR法检测细胞线粒体损伤相关基因表达的变化，利用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位(MMP)的变化。结果显示：1)600和800μmol/L H₂O₂     

奶牛乳腺上皮细胞系的建立

采用组织块种植法,成功地培养了奶牛乳腺上皮细胞,并利用细胞角蛋白18的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行了鉴定。通过对细胞接种存活率、群体倍增时间、生长曲线、形态学等生物学性状的检测,建立并鉴定了正常培养的奶牛乳腺上皮细胞系,细胞传至20代以上时仍保持旺盛的增殖活力。通过对细胞传代及反复冻存,建立了奶牛乳腺上皮细胞系,获得了大量的乳腺上皮细胞。     

NFκB1在奶牛乳腺上皮细胞中的表达与定位

试验旨在研究奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cell, BMEC）中NFκB1的表达与定位变化,以阐明NFκB1对BMEC乳合成的转录调节机理。通过组织块法培养原代细胞,利用BMEC和成纤维细胞对胰蛋白酶敏感性的不同进行纯化和传代;利用Western blotting和免疫荧光染色法检测细胞中角蛋白18和β-酪蛋白的表达以鉴定细胞的纯度和泌乳功能;通过添加0.6 mmol/L蛋氨酸建立氨基酸刺激BMEC泌乳的体外模型;Western blotting和免疫荧光法检测添加蛋氨酸后NFκB1和p-NFκB1表达与定位的变化。结果显示,获得了纯化的BMEC;Western blotting检测发现NFκB1在细胞浆中存在约141和105 ku两种形式,在细胞核中只存在105 ku形式;p-NFκB1（50 ku）主要存在于细胞核内。在添加蛋氨酸后NFκB1的141 ku形式的含量有一定增加;105 ku形式在细胞浆内蛋白水平变化不明显,在细胞核内水平明显升高;p-NFκB1在细胞核中的定位明显增加。结果提示,NFκB1参与BMEC乳合成的转录调节,氨基酸通过促进细胞核内NFκB1磷酸化以调节泌乳相关基因的转录和促进乳合成。     

硒对脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的保护作用

本试验旨在研究硒(Se)对脂多糖(LPS)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)氧化损伤的保护作用及其机制。将贴壁生长的第3代BMEC随机分为8组,每组6个重复,每个重复1个培养孔。对照(CON)组采用基础培养液,不添加Se和LPS,培养30h;LPS组和6个Se保护组在基础培养液中分别添加不同水平的Se(0、10、20、50、100、150和200nmol/L),培养24h后,加入1μg/mL LPS作为外源刺激作用6h。结果表明:1)与CON组相比,LPS组BMEC的相对增殖率显著下降(P0.05),谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和总抗氧化能力(T-AOC)均显著下降(P0.05),GPx1和TrxR1的基因和蛋白表达量、硒蛋白P(SelP)含量也显著下调(P0.05);而LPS组的一氧化氮(NO)含量,诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性及其基因和蛋白表达量,炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)和白介素-6(IL-6)含量及其基因表达量,活性氧(ROS)活性,丙二醛(MDA)含量均显著升高(P0.05),丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路相关因子p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、c-Jun氨基端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)的基因表达量呈相似变化。2)与LPS组相比,Se保护组随Se添加水平的增加,相对增殖率,T-SOD、CAT、GPx、TrxR活性,T-AOC,GPx1、TrxR1基因和蛋白表达量均呈先升高后下降趋势;而NO含量,iNOS活性及其基因和蛋白表达量,炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6含量及其基因表达量,MAPK信号通路相关因子ERK1/2、JNK、p38 MAPK的基因表达量,ROS活性,MDA含量呈先降低后升高的趋势;以20~100nmol/L Se保护效果较好,综合来看50nmol/L Se保护效果最好。结果提示,Se可提高BMEC的抗氧化功能,对LPS引起的细胞氧化损伤具有保护作用,其机制是Se增强TrxR活性从而抑制MAPK信号通路的激活,最终减少NO的大量释放,但过高水平的Se会对细胞造成损伤。培养液中20~100nmol/L Se的保护作用较好,尤其以50nmol/L Se效果最好。     

大豆活性肽对体外过氧化氢诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激和炎症损伤的缓解作用

本试验旨在探究大豆活性肽（SBP）对体外过氧化氢（H2O2）诱导的奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）氧化应激和炎症损伤的缓解作用。试验采用体外细胞培养方法,以不同浓度H2O2处理MAC-T细胞建立细胞氧化应激模型,在此基础上以不同浓度（0.15、0.30、0.60、1.20、2.40、4.80 mg/mL）SBP对细胞进行预处理,测定细胞存活率以及细胞内活性氧（ROS）水平、抗氧化指标及炎症相关基因的mRNA相对表达水平,试验同时设置对照组和H2O2模型组。结果显示：与对照组相比,600μmol/L的H2O2作用于细胞12 h,细胞内ROS水平极显著升高（P <0.01）,总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）活性和总抗氧化能力（T-AOC）极显著下降（P<0.01）,丙二醛（MDA）含量极显著升高（P<0.01）。而以0.15、0.30和0.60 mg/mL SBP对细胞进行预处理后,与H2O2模型组相比,极显著降低了细胞内ROS水平（P<0.01）,极显著提高了T-SOD、GSH-Px、CAT活性（P<0....     

维生素E对H2O2诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤及紧密连接相关基因表达的影响

试验通过研究维生素E （VE）对H₂O₂诱导的奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T cells）氧化损伤及紧密连接相关基因表达的影响,旨在揭示维生素E对缓解奶牛乳腺细胞氧化应激的作用。试验设对照组（完全培养基处理组）、H₂O₂组和H₂O₂＋VE组。利用MTT法检测奶牛乳腺细胞存活率,比色法检测奶牛乳腺细胞培养液中超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）含量;通过实时荧光定量PCR检测紧密连接基因ZO-1、occludin、claudin-1的相对表达量。结果显示,与对照组相比,H₂O₂组的奶牛乳腺上皮细胞存活率显著下降（P<0.05）,ROS和MDA含量显著增加（P<0.05）,SOD和CAT活性显著下降（P<0.05）;与H₂O₂组相比,H₂O₂＋20 μmol/L VE组的细胞存活率显著上升（P<0.05）,ROS和MDA含量显著下降（P<0.05）,SOD和CAT活性显著增加（P<0.05）。此外,与对照组相比,H₂O₂组极显著抑制了紧密连接基因的相对表达量（P<0.01）;而与H₂O₂组相比,添加维生素E极显著缓解了H₂O₂对紧密连接基因相对表达的抑制作用（P<0.01）。本研究结果证明,维生素E不仅能够减轻H₂O₂诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤,还能缓解H₂O₂对紧密连接基因相对表达的抑制作用。     

奶牛乳腺上皮细胞体外培养研究进展

体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)常被用于研究乳成分的合成调控以及乳腺的生理代谢.近年来,随着越来越多永生化奶牛乳腺上皮细胞系的建立,其应用也更为广泛.本文综述了奶牛乳腺细胞系的种类和奶牛乳腺细胞体外培养的方法,为研究乳腺上皮细胞的功能及泌乳机制提供参考.     

DDR1对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的调控作用

旨在通过干扰或过表达盘状蛋白结构域受体1（DDR1）基因,探讨其对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及周期的影响。本研究将DDR1基因小干扰RNA片段和过表达载体pcDNA3.1-DDR1转染奶牛乳腺上皮细胞,采用qRT-PCR和Western blot检测细胞中DDR1的干扰和过表达效果;利用CCK-8法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡（早凋、晚凋）的变化;利用qRT-PCR检测增殖与凋亡相关基因的表达情况。结果,在奶牛乳腺上皮细胞中干扰DDR1基因后,其mRNA和蛋白表达分别下调94%和30%,而过表达DDR1基因后,其mRNA和蛋白表达分别上调68.24和1.38倍;干扰DDR1极显著抑制细胞的增殖（P<0.01）,细胞早凋与晚凋比例极显著上升（P<0.01）;干扰组G1期细胞比例极显著上升（P<0.01）,S期细胞比例极显著下降（P<0.01）,G2期细胞比例显著下降（P<0.05）,提示细胞阻滞在G0/G1期。相反,过表达DDR1能显著促进细胞增殖（P<0.05）,显著抑制细胞晚期凋亡（P<0.05）,G1期细胞比例极显著下降（P<0.01）,S期细胞比例极显著上升（P<0.01）,促进细胞由G1期向S期的转换。qRT-PCR检测结果显示,干扰DDR1后显著上调BAX、Caspase9基因的表达（P<0.05）,极显著上调P53、FAS基因的表达（P<0.01）,且显著下调PCNA、CyclinB1基因的表达（P<0.05）;过表达DDR1后,分别显著和极显著下调Cytc与BAX基因的表达（P<0.05,P<0.01）,并极显著上调CyclinB1基因的表达（P<0.01）。综上可见,DDR1能够调控奶牛乳腺上皮细胞的增殖、凋亡和周期,可为阐明DDR1参与奶牛乳腺上皮细胞生长发育的分子机制提供参考。     

奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定

本试验通过组织块培养法获得了奶牛乳腺上皮细胞,联合运用刮除法、相差消化和相差贴壁法、单克隆法对细胞进行纯化,应用倒置显微镜和β-酪蛋白表达检测了体外培养的奶牛乳腺上皮细胞的形态特征和乳蛋白表达,鉴定该细胞为上皮型细胞。     

过氧化氢诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的建立

本试验旨在利用过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)作为刺激源,以细胞存活率及抗氧化指标为判断指标,建立奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)的氧化损伤模型。试验一采用单因子完全随机试验设计,将第3代贴壁生长的BMEC随机分为42组,每组10个重复。细胞培养液中分别添加0、100、200、400、600、800和1 000μmol/L H2O2,使之分别作用2、4、6、8、12、24 h,测定细胞数量,计算存活率。试验二是在试验一得出的适宜H2O2作用时间(本试验的结果为6 h)的基础上,采用单因子完全随机试验设计,将第3代贴壁生长的BMEC随机分为7组,每组6个重复,BMEC中添加不同浓度的H2O2(0、100、200、400、600、800和1 000μmol/L)作用细胞6 h,收集细胞和培养液测定抗氧化指标,筛选使细胞发生氧化损伤的适宜H2O2作用浓度。试验一结果表明,600μmol/L H2O2作用细胞6 h,BMEC的存活率降低至79.79%。试验二结果表明,600~1 000μmol/L组与其他各组相比均显著降低了谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性,提高了丙二醛含量(P<0.05),但600、800和1 000μmol/L组之间差异不显著(P>0.10)。结果 提示,H2O2作用浓度为600μmol/L、作用时间为6 h,使BMEC产生了明显的氧化应激,可作为建立细胞氧化损伤模型时的适宜条件。     

竹叶黄酮对热应激诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的保护作用

本研究以竹叶黄酮(BLF)为添加剂,探究其对热应激诱导奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)损伤的保护作用.将不添加BLF、37℃处理的BMECs设为对照组,不添加BLF、42℃处理的BMECs设为热应激组,以添加不同浓度(1、5、10μg/mL)的BLF、42℃处理的BMECs设为试验组,每组3个重复.应用乳酸脱氢酶(LDH...     

奶牛bTAP蛋白表达载体的构建及其在奶牛乳腺上皮细胞中的表达

奶牛气管抗菌肽是一种具有较强抗菌活性的抗菌小肽。实验从奶牛气管组织中提取总RNA,反转录成c DNA,以此为模板,用奶牛气管抗菌肽特异性PCR引物扩增奶牛气管抗菌肽基因,然后将其连入载体p CMV-C-e GFP中构建奶牛气管抗菌肽的真核表达载体b TAP-GFP,并将此载体转染进奶牛乳腺上皮细胞中,分别运用荧光蛋白观察和细菌记数等方法检测b TAP-GFP蛋白在细胞中的表达及其对大肠杆菌的抗菌活性。试验结果表明,试验成功的建立了奶牛气管抗菌肽的真核表达载体b TAP-GFP,并且此重组载体能在奶牛乳腺上皮细胞中正常表达具有抗大肠杆菌活性的b TAP-GFP蛋白。     

奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态观察

利用原代培养后纯化的奶牛乳腺上皮细胞,以Matrigel为基质胶原,进行奶牛乳腺上皮细胞的三维培养,细胞接种浓度分别为1×104、1×105和1×106个细胞/mL。经过16d培养后,用DAPI对细胞染色,利用荧光显微镜观察细胞生长状况。结果表明,当细胞接种浓度为1×104～1×105个细胞/mL时,细胞形成了团块状结构,出现了类似腔状的腺泡形态。     

精氨酸对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成的影响

本研究以奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）为模型,研究添加不同浓度精氨酸对BMECs酪蛋白合成的影响。采用单因素完全随机试验设计,以0.70 mmol/L精氨酸（DMEM培养基中精氨酸的浓度）为对照组,试验组精氨酸的浓度分别为1.40、2.80、5.60和11.20 mmol/L,每组6个重复。采用MTT法检测BMECs的增殖率;利用酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒检测BMECs中精氨酸代谢关键酶活性;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测BMECs中精氨酸代谢关键酶、酪蛋白以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路基因的相对表达量;运用蛋白质免疫印迹（Western Blot）技术检测酪蛋白表达量及mTOR信号通路蛋白磷酸化水平。结果表明：1）当精氨酸的浓度为2.80 mmol/L时,BMECs的增殖率显著高于对照组和其他精氨酸组（P<0.05）;当精氨酸的浓度为2.80和5.60 mmol/L时,BMECs中鸟氨酸脱羧酶活性显著高于对照组和其他精氨酸组（P<0.05）。2) 2.80 mmol/L精氨酸组BMECs中αs1-酪蛋白、к-酪蛋白、蛋白激酶B、m...     

奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态观察

利用原代培养后纯化的奶牛乳腺上皮细胞,以Matrigel为基质胶原,进行奶牛乳腺上皮细胞的三维培养,细胞接种浓度分别为1×104、1×105和1×106个细胞/mL.经过16d培养后,用DAPI对细胞染色,利用荧光显微镜观察细胞生长状况.结果表明,当细胞接种浓度为1×104～1×105个细胞/mL时,细胞形成了团块状结构,出现了类似腔状的腺泡形态.     

奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态观察

利用原代培养后纯化的奶牛乳腺上皮细胞,以Matrigel为基质胶原,进行奶牛乳腺上皮细胞的三维培养,细胞接种浓度分别为1×104、1×105和1×106个细胞/mL。经过16d培养后,用DAPI对细胞染色,利用荧光显微镜观察细胞生长状况。结果表明,当细胞接种浓度为1×104～1×105个细胞/mL时,细胞形成了团块状结构,出现了类似腔状的腺泡形态。     

奶牛乳腺上皮细胞中Bta-miR-877靶基因的初步验证

利用高通量测序的方法筛选出在高脂奶牛和低脂奶牛中差异表达的miR-877和其预测的靶基因。通过生物信息学方法预测出edn1、ptgis可能是miR-877的靶基因,之后通过荧光定量检测miR-877以及其靶基因的表达量。结果显示,转染miR-877mimics组miR-877的相对表达量显著高于转染miR-877inhibitor组;靶基因的相对表达量,转染miR-877mimics组的edn1、ptgis基因表达水平均显著低于转染miR-877inhibitor组(P<0.01)。经GraphPad Prism6分析显示,edn1、ptgis基因的相对表达量与miR-877的表达量呈负相关,初步验证edn、ptgis是miR-877的靶基因。本试验为深入了解miR-877在乳脂质代谢调节中的作用提供依据,从而为生产实践提供一定的理论基础。     

丹皮酚对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤的缓解作用

旨在探究丹皮酚对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells, BMECs)炎性损伤的缓解作用。使用CCK-8法检测不同浓度丹皮酚对BMECs活力的影响,选用20、50和100 mg/L丹皮酚处理LPS诱导的BMECs炎性模型,并检测细胞凋亡、氧化应激因子、相关炎性因子及NF-κB关键通路蛋白表达的变化。结果显示：10～100 mg/L丹皮酚对BMECs增殖有不同程度的促进作用;不同剂量的丹皮酚可显著抑制细胞凋亡及IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平,提高超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,降低丙二醛(MDA)含量,抑制IκBα和p65的磷酸化水平。以上结果表明,丹皮酚能够抑制LPS诱导的BMECs的炎性损伤,其作用机制可能与NF-κB信号通路被抑制有关。     

荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞的体外培养

用外科手术的方法采取健康的泌乳期荷斯坦奶牛乳腺组织,采用机械剪切结合酶消化的方法,在体外进行原代乳腺上皮细胞分离培养。结果成功地培养出荷斯坦奶牛原代乳腺上皮细胞。显微镜下观察,细胞形成单层呈鹅卵石样;角蛋白免疫组化染色后,呈现阳性反应。经数次传代后,细胞增殖依旧旺盛。     

体外培养奶牛乳腺上皮细胞的形态学观察

荷斯坦奶牛是我国饲养的主要奶牛品种。研究荷斯坦奶牛乳腺发育的生理、病理对于奶牛育种和保障奶牛健康均具有重大意义。因此，进行荷斯坦奶牛的乳腺上皮细胞分离培养及形态学研究，可为今后的工作奠定基础。本研究在形态学方面对培养的乳腺上皮细胞进行了系统的阐述，以期对今后的研究提供借鉴。