清远麻鸡miR-142-3p分析及其关键靶基因的筛选

为分析清远麻鸡不同组织中miR-142-3p的表达情况,并筛选其在脾脏中的关键靶基因,本研究利用在线数据库预测鸡miR-142-3p靶基因,并对靶基因进行GO和KEGG富集分析以及构建蛋白-蛋白互作网络。利用在线公共数据库,分析脾脏相对于其他组织的miR-142-3p表达量;再根据miRNA表达量与其靶基因表达量负相关机制,对miR-142-3p靶基因与脾脏中相对其他组织显著下调基因取交集,筛选潜在靶基因。结果表明：1）预测获得85个靶基因,GO富集分析显示,靶基因参与多种高分子化合物的合成与转运过程。2）KEGG结果显示富集到MAPK、Notch、Wnt等多条与抗肿瘤免疫相关的信号通路。3）PPI网络共筛选到4个Hub基因。4）miR-142-3p在脾脏中的表达量极显著高于肝脏、肺脏、胸肌、心脏和肾脏（P<0.01）。5）共筛选到TWF1、MYH10、NFIB、FNBP1L和FERMT2 5个靶基因。综上,鸡miR-142-3p在脾脏中很可能通过TWF1、MYH10、NFIB、FNBP1L和FERMT2 发挥生物学功能。本研究为解析鸡miR-142-3p的功能及其分子机制提供了参考和依据。     

鸡肌肉发育相关miR-133a-5p分析和关键靶基因筛选

为筛选miR-133a-5p影响鸡肌肉发育的关键靶基因,本研究利用在线数据库预测miR-133a-5p靶基因,并对靶基因进行富集分析和构建蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interaction,PPI)网络,寻找网络图中有意义的模块。通过单因素方差分析,比较分析肌肉和其他组织中的miR-133a-5p表达量;再依据microRNA与靶基因负相关的作用机制,将miR-133a-5p靶基因与肌肉中相对下调基因取交集,筛选关键靶基因。最后,通过RNA22 v2对筛选结果进行评估。结果表明:1)共获得157个靶基因;2)GO富集分析显示,靶基因参与多个生物合成过程的调控和代谢过程;KEGG富集结果包括MAPK信号通路等多种信号通路,也包括肌动蛋白细胞骨架等与肌肉发育直接相关的通路;3)PPI网络图共筛选到4个有意义模块,涉及17个基因;4)miR-133a-5p在肌肉中表达显著上调(相对肺、肝脏和肾脏),与肌肉相对下调基因取交集后,筛选到SOX5(SRY-box 5)、PRTFDC1(Phosphoribosyl transferase domain containing 1)、THRB(Thyroid hormone receptor beta)、THBS2(Thrombospondin 2)和ARRDC3(Arrestin domain containing 3)5个基因;5)在GSE93855的表达谱中,PRTFDC1和THRB在肌肉中表达量最低,而RNA22 v2评估结果显示,仅SOX5和THRB存在P<0.05的结合位点。综上,miR-133a-5p很可能是通过SOX5、PRTFDC1、THRB、THBS2和ARRDC3影响肌肉发育,其中SOX5和THRB尤为重要。本研究为进一步研究鸡miR-133a-5p提供了理论基础和数据支撑。     

ssc-miR-17-3p调控脂肪沉积的靶基因生物信息学分析

[目的]找到与猪脂肪沉积相关的候选靶基因,为ssc-miR-17-3p参与脂肪沉积调控机制研究提供相关理论依据. [方法]利用miRDB,miRWalk和TargetScan数据库获得了miRNA-17-3p候选靶基因;利用DAVID和KOBAS数据库对候选靶基因进行了KEGG/GO功能富集分析,并通过Cytoscape可视化工具构建了其可能参与的调控网络.[结果]结果表明,ssc-miR-17-3p候选靶基因TSTD2、CSDE1、SCGB1 D1、TEAD1、GPD2、NFATC3、MBNL1、PPP1R12B、CAMK2D、HBEGF、LRRC28、UBE2D4、MAP4与脂肪沉积有关.GPD2、CAMK2D、HBEGF等可能在催产素信号通路、MAPK信号通路、GnRH信号通路,以及脂质代谢、甘油磷脂代谢、糖醇代谢、大分子代谢,细胞代谢等过程发挥了作用.[结论]ssc-miR-17-3p可能通过调控多个靶基因,信号通路和生物过程影响脂肪的沉积与代谢,其功能有待进一步实验室试验验证.     

鸡gga-miR-31-5p 启动子真核表达载体的构建及其转录因子结合位点预测

为确定鸡gga-miR-31-5p启动子基本活性区域,并分析调控其转录的重要转录因子,初步探究影响鸡gga-miR-31-5p的表达调控机制,采用PCR法扩增鸡gga-miR-31-5p启动子,插入到pEGFP-N1载体,构建重组载体。利用菌液PCR及测序鉴定阳性重组质粒。将重组载体转染DF-1细胞系,观察其启动活性。利用在线预测网站预测gga-miR-31-5p启动子区域的转录因子结合位点。结果显示,成功克隆出gga-miR-31-5p启动子片段,并成功构建其pEGFP重组载体。体外转染结果表明,该区域具有启动活性,并发现鸡gga-miR-31-5p启动子区域存在RARα、ER、c-Jun、GR等重要转录因子结合位点。研究初步确定了鸡gga-miR-31-5p启动子区域,同时发现该区域存在重要转录因子结合位点,该结果为后续探讨进一步研究gga-miR-31-5p启动子的生物学功能奠定基础。     

gga-miR-130b-3p对鸡MDCC-MSB1细胞中肿瘤相关基因表达的影响

为鉴定MD淋巴瘤转化细胞中gga-miR-130b-3p 调控的肿瘤相关基因,本研究在MDV转化的鸡淋巴细胞系MDCC-MSB1中过表达该miRNA,转染48 h后收集并提取RNA,利用高通量测序获得过表达gga-miR-130b-3p组和阴性对照组（Negative control, NC）的转录组数据,筛选这些数据中的差异表达基因（Differential expressed genes, DEGs）,对DEGs进行基因本体 GO功能富集分析、信号通路分析以及基因集富集分析,筛选过表达gga-miR-130b-3p前后基因表达变化可能参与的信号通路,并对两组中的差异可变剪切进行分析。结果表明：1）与NC组相比,过表达gga-miR-130b-3p组中共鉴定出117个DEGs,其中83个DEGs显著上调,34个DEGs显著下调。其中MCM10、KCNA3、PTK2、FGL2、GPAM、BMP4、LOXL3、DDO和KRAS等基因可能影响MD肿瘤转化。2）DEGs注释到46个GO条目中,其中生物过程包含免疫系统过程等在内的22个条目,分子功能包括10个条目,细胞组分包括14个条目。3）mimics NC和mimics转染组中的DEGs以及微效基因富集到7个与肿瘤发生相关的通路,其中主要是通过甲状腺激素信号途径、胆碱代谢等通路发挥抑癌作用。4）过表达gga-miR-130b-3p后差异可变剪切类型最多的是外显子跳跃（Exon skipped,ES）,其次是内含子滞留（Intron retained,IR）,最少的是外显子互斥（Mutually exclusive exon,MXE）。综上, gga-miR-130b-3p高表达会引起MSB1细胞中的部分基因差异表达,这些DEGs通过抑癌信号通路抑制MD的肿瘤发展进程,该研究可为解析miRNA在MD肿瘤转化过程中的作用机制提供理论依据。     

MYCN基因在鸡成肌细胞和胸肌组织表达及生长发育中变化

MYCN是癌基因中的核蛋白类调控基因.在前期采用Illumina60kSNP芯片开展的胴体性状的全基因组关联(GWAS)研究中发现,MYCN基因与胸肌、腿肌重达显著相关.为进一步验证该基因在肌肉发育调控中的作用,采用Q-PCR技术,系统检测成肌细胞增殖分化期、胚胎发育后期和出生至98日龄肌肉组织中MYCN基因的mRNA表达量,并比较12个组织的特异性表达差异.结果表明,在鸡成肌细胞增殖、分化过程中,MYCN基因mRNA表达量在分化期显著高于增殖期(P＜0.01),并随诱导分化时间的延长表达量上升;在胚胎期14～21胚龄,mRNA表达量随胚龄的延长而持续上升,18至21胚龄变化显著(P＜0.01);在出生至98日龄生产发育阶段,在0～14日龄的表达量呈急剧下降趋势(P＜0.01),14日龄后变化不显著(P＜0.05).通过12个组织特异性表达分析,MYCN在胸肌、腿肌中的表达量仅次于大脑和下丘脑中枢神经系统中的表达水平.综合各发育阶段的结果表明,MYCN基因参与了肌肉组织发育的调控,其功能主要作用在鸡胚胎发育后期至出生后14日龄之内.该研究为阐明鸡肌肉生长发育的遗传机制提供了理论依据.     

miR-423-5p在牛肌肉组织中表达及其靶基因预测

miR-423-5p在细胞中具有重要的生物学功能,如在肌细胞中能影响细胞的增殖.根据miRBase及NCBI网站显示的相关信息利用分析软件对miR-423在各物种之间的同源性进行了分析.取成年西门塔尔牛体内的骨骼肌、小肠、心脏组织利用茎环荧光定量PCR进行miR-423-5p表达量检测,将牛骨骼肌卫星细胞(MDSCs)...     

鸭脂肪生成相关的miR-184-3p分析及关键靶基因筛选

为筛选miR-184-3p影响鸭脂肪生成的关键靶基因,本研究首先利用在线数据库预测miR-184-3p靶基因,并对靶基因进行富集分析和蛋白-蛋白相互作用（Protein-protein interaction,PPI）网络构建,寻找网络图中有意义的模块,然后分析靶基因在脂肪中的表达,再依据microRNA对靶基因负相关的作用机制筛选关键靶基因。最后,通过RNA22 v2对筛选结果进行评估。结果表明：1）共获得225个靶基因。2)GO富集分析显示,靶基因参与细胞和大分子生物合成过程的负调控过程;KEGG富集结果包含Notch信号传导途径、动物线粒体自噬和内吞作用3条显著通路。3)PPI网络图共筛选4个核心基因;4）表达谱分析共筛选到4个基因,DVL3(Dishevelled segment polarity protein 3)、HOXA9(homeobox A9)、LIFR(LIF receptor subunit alpha)和SPECC1L(Sperm antigen with calponin homology and coiled-coil domains 1 like);而R...     

p27基因在宫颈癌组织中的表达及其意义

目的：探讨肿瘤抑制基因p27在宫颈癌组织中的表达及其临床意义。方法：应用免疫组织化学方法（SP法）检测p27基因在62例官颈癌组织和20例正常官颈组织中的表达。结果：62例宫颈癌组织中,p27的阳性表达率为38．7％（24／62）;p27的阳性表达与宫颈病灶大小、临床分期、细胞分化程度、转移及预后有密切关系（P〈0．01或〈0．05）;与宫颈癌的病理类型及年龄无关（P〉0．05）。结论：p27基因的表达与宫颈癌的生长、浸润及淋巴结转移有关,其表达水平的高低可作为判断宫颈癌预后的重要指标之一。     

突变型抑癌基因p53在鸡马立克氏病肿瘤组织中的表达研究

[目的]探讨抑癌基因p53在鸡马立克氏病的发生与发展中的作用和意义。[方法]采用免疫组织化学和细胞化学技术,观察抑癌基因p53在鸡马立克氏病肿瘤组织及体外培养感染马立克病毒的鸡胚成纤维细胞中的表达。[结果]在体外培养的鸡胚成纤维细胞(CEF)感染马立克氏病毒后,感染的CEF呈阳性。在马立克氏病的发生过程中,突变型抑癌基因p53在病鸡的肝脏、肾脏、肿瘤、心脏、脾脏、肺脏、胸腺及法氏囊中均可检出中等量的表达。p53发生突变时所产生的p53蛋白突变体的半衰期比未发生突变时要长。[结论]突变型p53基因具有直接转化细胞和阻碍野生型p53发挥作用的特点,致使突变的DNA得以积累,最终导致癌变的发生。     

miR-222-3p在鹅肥肝形成中的作用及靶基因验证

为了检测miR-222-3p在填饲鹅不同组织中的表达情况,并对其靶基因进行预测和验证,探讨miR-222-3p在鹅肥肝形成中的功能。运用实时荧光定量 PCR技术检测miR-222-3p 在填饲鹅肝脏、胸肌和腹脂中的表达量;采用生物信息学方法对鹅miR-222-3p的靶基因进行预测,荧光定量PCR技术检测预测靶基因在肝脏中的表达量,并利用双荧光素酶基因报告系统验证其靶向关系。结果显示：相比对照组,miR-222-3p 在填饲鹅肝脏和腹脂中的表达量均显著升高;生物信息学预测结果显示MARF1和B4GALNT3基因在3’UTR区域存在miR-222-3p的潜在结合位点,且这两个基因在鹅肥肝中均显著下调,而双荧光素酶基因报告系统显示只有MARF1基因与鹅 miR-222-3p存在靶向关系。结果表明,miR-222-3p在鹅肥肝中表达量显著上调,且可能通过其靶基因MARF1对鹅肥肝的形成发挥调控作用。     

miR-99a-5p inhibits target gene FZD5 expression and steroid hormone secretion from goat ovarian granulosa cells

MicroRNA (miRNA) has vital regulatory effects on the proliferation, differentiation and secretion of ovarian granulosa cells, but the role of miR-99a-5p in goat ovarian granulosa cells (GCs) is unclear. Both miR-99a-5p and Frizzled-5 (FZD5) were found to be expressed in GCs in goat ovaries via fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry, respectively, and FZD5 was verified (P<0.001) as a target gene of miR-99a-5p by double luciferase reporter gene experiments. Furthermore, FZD5 mRNA and protein expression were both found to be regulated (P<0.05) by miR-99a-5p in GCs. Moreover, the overexpression of miR-99a-5p or knockdown of FZD5 suppressed (P<0.05) estradiol and progesterone secretion from the GCs, as determined by ELISA. In summary, miR-99a-5p inhibits target gene FZD5 expression and estradiol and progesterone synthesis in GCs. Our study thus provides seminal data and new insights into the regulatory mechanisms of follicular development in the goat and other animals.     

miR-210-5p对南极独角雪冰鱼心脏发育的作用机制研究

microRNA为短链非编码RNA,通过与靶基因3'UTR序列互补在转录后水平发挥作用。已有研究表明,microRNA在心脏发育过程中起着重要的调控作用。南极冰鱼因体内缺乏功能性血红细胞,其心脏出现了补偿性增生。前期的研究提示,独角雪冰鱼心脏中特异表达的microRNAs可能与冰鱼心脏的补偿性增生相关。本研究针对南极冰鱼心脏中高表达的miR-210-5p,运用斑马鱼显微注射、靶基因预测等手段研究了miR-210-5p对心脏发育的作用机制。结果表明:斑马鱼胚胎注射miR-210-5p后,出现心包膜水肿,心脏发育畸形等现象。qRT-PCR分析显示,过表达miR-210-5p的斑马鱼胚胎中,心脏发育相关的标志性基因bmp4、smad1、gata6以及tbx2b的表达水平下调。Western blotting分析发现,bmp/smad通路中的BMP2、BMP4、SMAD1、GATA6以及TBX2B的蛋白表达水平也显著下调。通过对tbx20基因3'UTR的靶基因生物信息学预测,以及对其进行GFP荧光表达分析,发现tbx20基因可能是miR-210-5p的一个靶基因。由此推测,miR-210-5p可能通过抑制tbx20基因的表达,并调控bmp/smad通路以抑制冰鱼心脏发育。