草莓乙烯受体FaEtr2基因的克隆及其反义表达载体的构建

为了构建草莓乙烯受体FaEtr2基因的反义表达载体,在已报道的FaEtr2基因序列的基础上,设计特异引物,克隆草莓乙烯受体FaEtr2基因部分特异序列,将该片段反向插入植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr2。通过双酶切鉴定后,导入农杆菌EHA105中,酶切和PCR鉴定表明质粒已导入到农杆菌中。本研究为后期该反义基因转化草莓品种以改良草莓果实耐贮运性打下基础。     

上西早生柿ETR5基因片段的克隆与植物表达载体的构建

从上西早生(Uenishiwase)柿叶片中,提取了基因组DNA。以基因组DNA为模板,经PCR扩增,克隆到一个549 bp的ETR5的DNA片段。序列分析表明,上西早生柿基因与洋梨ETR5的核苷酸同源性为79.0%,氨基酸同源性为81.0%;并且含有其他植物ETR5的保守氨基酸区和不变氨基酸残基,表明克隆到的序列是上西早生柿ETR5的基因片段。设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个ETR5-Uenishiwase片段。2个片段经单酶切消化后连接成反向互补的大片断。连接片断经双酶切消化后,连接到植物表达载体pBI221上,构建成Uenishiwase-ETR5基因的植物表达载体。     

种子特异表达启动子的克隆分析及其植物表达载体的构建

根据GenBank已公布的种子特异性的Oleosin蛋白基因启动子序列设计合成引物,利用PCR技术从油菜总基因组DNA中扩增出Oleosin基因启动子序列(SOP),将该序列克隆到pGM-T载体中,经鉴定获得pGM-T-SOP重组载体。测序和序列分析表明,该启动子序列由899 bp核苷酸组成,其核苷酸序列与GenBank中的Oleosin基因启动子序列同源性高达95.6%。分别用限制性内切酶HindⅢ和BamH I双酶切重组质粒pGMT-SOP和双元植物表达载体pBI121,分别回收pGMT-SOP重组质粒中的SOP小片段和pBI121植物表达载体中去掉CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化和鉴定,获得由SOP驱动报告基因GUS的新型植物表达载体pBI121-SOP,为外源基因在油菜种子中的定位表达研究奠定基础。     

棉花纤维特异表达GhCesA4启动子的克隆及序列分析

 以新疆陆地棉品种新陆早19的DNA为模板,克隆了棉花纤维特异启动子GhCesA4,GenBank登录号：EU183119 ,将启动子基因序列克隆到pMD19-T载体中,由载体通用引物M13-47、RV-M 经PCR鉴定获得pMD19-T/GhCesA4重组载体。测序和序列分析表明,该启动子序列由1503 bp核苷酸组成,与GenBank中GhCesA4基因启动子序列同源性高达98％。分别用限制性内切酶ClaⅠ和BamⅠ双酶切重组质pMD19-T/GhCesA4和双元植物表达载体pBI121,分别回收pMD19-T/GhCesA4重组质粒中的GhCesA4小片段和pBI121 植物表达载体中缺失CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化、酶切及测序鉴定,获得由GhCesA4驱动报告基因GUS的新型植物表达载体,命名为pBI-GhCesA4     

番茄转录因子LeMADS-MC正反义植物表达载体的构建

为进一步阐明转录因子家族MADS-Box对番茄果实成熟的调控途径,本研究利用聚合酶链式反应技术(PCR)从番茄(Solanum lycopersicum)cDNA中克隆LeMADS-MC基因和LeMADS-antiMC基因核心片段,将这2个基因通过酶切分别正向连接到pCAMBIA1300-221载体和反向连接到pCXSN载体中,并用冻融法将重组载体导入农杆菌中。获得的重组载体分别通过PCR及酶切鉴定符合预期结果且测序结果与NCBI同源性高达100%。结果成功构建了适合于番茄农杆菌遗传转化的植物表达载体,为下一步通过LeMADS-MC基因研究果实成熟衰老机理奠定了物质基础。     

家蚕抗菌肽attacin基因植物表达载体的构建

抗菌肽是昆虫抵御外界微生物侵染的主要物质。本文利用双酶切将pBI121载体上的植物启动子CaMV35S克隆到植物表达载体pCAMBIA2300上,构建重组表达载体pCAMBIA2300-CaMV35S。PCR扩增家蚕抗菌肽attacin基因编码区全长并利用T载体成功克隆（GenBank登陆号：GU244351）,然后利用双酶切将attacin 基因亚克隆到pCAMBIA2300-CaMV35S上,通过PCR鉴定,成功构建了attacin基因的植物表达载体pCAMBIA2300-CaMV35S-attacin。为研究attacin基因在植物抗病性方面的应用奠定基础。     

紫杉烷14β-羟基化酶基因片段的克隆及其植物表达载体的构建

采用CTAB法提取中国红豆杉基因组DNA,利用PCR技术克隆得到紫杉烷14β-羟基化酶(简称14OH)基因前半段,测序结果表明DNA片段序列为915bp,与报道的14OH基因同源性为98.3%。然后将获得的DNA片段(915bp)正反向插入到二元载体pZh01的GUS两端,构建成14OHRNAi植物表达载体pZ14a,又选其中与羟基化酶家族其他成员同源性低的部分(390bp),正反向插入到二元载体pZh01的GUS两端,构建成14OHRNAi植物表达载体pZ14b。同时将克隆得到的DNA片段(915bp)反向插入到二元载体pZh01中,构建成14OH反义RNA植物表达载体pZ14c。经PCR和酶切图谱分析鉴定,确认载体构建成功。     

拟南芥WUS基因的克隆及植物表达载体的构建与鉴定

克隆得到正确的拟南芥WUS基因,成功构建WUS基因组成型植物表达载体和WUS-EGFP融合基因诱导型植物表达载体,分别转化了根癌农杆菌EHA105,并用WUS基因组成型植物表达载体转化橡胶树愈伤组织,得到组织化学检测阳性的愈伤组织,为深入研究WUS基因生理生化功能做准备。用双酶切切下植物表达载体PBI121的35S-GUS片段,将其连接到pCAMBIA2301上成为中间植物表达载体pCAMBIA2301-35S-GUS。提取拟南芥总RNA,通过RT-PCR方法获得WUS基因,经过TA克隆连接到pEASY-T1载体上,再用双酶切切下WUS基因,将其取代pCAMBIA2301-35S-GUS中的GUS片段,形成pCAMBIA2301-35S-WUS植物表达载体。同时以质粒pCAMBIA2301-EGFP为模板,PCR获得EGFP,用重叠延伸PCR技术（gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR）获得WUS- EGFP融合基因,经双酶切将融合基因连接到诱导型植物表达载体pER8上,构成pER8-WUS-EGFP诱导型植物表达载体。通过电击转化法将这两个载体成功转入根癌农杆菌EHA105中,经过双酶切检测、PCR检测与测序分析,检测结果皆完全正确,克隆的WUS基因与WUS-EGFP融合基因序列和NCBI上公布的序列也完全一致,说明这两个植物表达载体已经构建成功。另外用pCAMBIA2301-35S-WUS植物表达载体遗传转化橡胶树易碎胚性愈伤组织,经GUS染色为蓝色,说明愈伤组织转化成功。     

牡丹ACS基因片段的克隆及反义植物表达载体构建

根据GenBank登录的牡丹ACS基因DNA全长序列(FJ769773),设计一对特异性引物,在优化的PCR扩增体系的基础上,应用高保真DNA聚合酶KOD-Plus从洛阳红牡丹叶片总DNA中扩增出牡丹ACC合成酶基因片段PsACS-4。测序结果表明:克隆序列长970 bp,不包含牡丹ACS基因内含子序列,与目标序列同源性达100%;用SacI和SmaI对重组质粒和空载体pBI121双酶切、连接,将PsACS-4基因片段反身插入到植物表达载体pBI121的35S启动子下游,成功构建了牡丹ACS反义基因植物表达载体。