两株鸡源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析

为了解湖北鸡源禽流感病毒的遗传进化和氨基酸变异情况,将分离到的2株禽流感病毒进行全基因组测序及遗传进化分析。利用RT-PCR扩增流感病毒基因组片段,PCR扩增流感病毒片段、克隆至pMD18-T载体,并对序列特征进行生物信息学分析。结果表明:分离到的2株病毒高度同源,其HA和NA基因属于Y280谱系,PB1、PA、NP和NS基因属于SHF98-like谱系,PB2和M基因属于G1-like谱系;HA裂解位点均为-RSSR↓GLF-,具有低致病性流感病毒的分子特征;在HA蛋白上比当前流行株Y280多了一个潜在糖基化位点313(NCS);在234位点(对应H3编号中的226)产生了从Q到L的突变;在M2蛋白的31位点均产生了从S到N的突变。该2株H9N2亚型流感病毒为Y280谱系的病毒,这提示湖北地区可能也流行Y280-like分支禽流感病毒,虽然属于低致病性禽流感病毒(Low pathogenic AIV,LPAIV),但具有感染哺乳动物的潜在风险。     

江苏H9N2亚型禽流感病毒HA和NA的遗传进化分析

为了解江苏H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的变异情况,采用RT-PCR技术对10株从江苏不同地区分离的H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA基因进行了扩增、克隆、测序和遗传进化分析。结果显示:10株H9N2病毒间HA基因核苷酸和氨基酸的同源性分别是94.3%~99.0%、93.8%~99.6%,NA基因核苷酸和氨基酸的同源性分别是94.9%~99.9%、95.2%~100.0%,它们均属于欧亚分支中的A/Duck/Hong Kong/Y280/97亚群;10株病毒的HA裂解位点均为RSSR-GLF,受体结合位点第198位有8株为苏氨酸,2株为丙氨酸,第191位有1株为组氨酸;10株病毒NA基因在62~64位均存在缺失的现象,从而导致61位的糖基化位点缺失,NA基因第402位均出现了由天冬酰胺(N)到天冬氨酸(D)的变异,8株病毒只具有6个糖基化位点。     

江苏H9N2亚型禽流感病毒HA和NA的遗传进化分析

为了解江苏H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的变异情况,采用RT-PCR技术对10株从江苏不同地区分离的H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA基因进行了扩增、克隆、测序和遗传进化分析。结果显示:10株H9N2病毒间HA基因核苷酸和氨基酸的同源性分别是94.3%⁹9.0%、93.8%99.0%、93.8%⁹9.6%,NA基因核苷酸和氨基酸的同源性分别是94.9%99.6%,NA基因核苷酸和氨基酸的同源性分别是94.9%⁹9.9%、95.2%99.9%、95.2%¹00.0%,它们均属于欧亚分支中的A/Duck/Hong Kong/Y280/97亚群;10株病毒的HA裂解位点均为RSSR-GLF,受体结合位点第198位有8株为苏氨酸,2株为丙氨酸,第191位有1株为组氨酸;10株病毒NA基因在62100.0%,它们均属于欧亚分支中的A/Duck/Hong Kong/Y280/97亚群;10株病毒的HA裂解位点均为RSSR-GLF,受体结合位点第198位有8株为苏氨酸,2株为丙氨酸,第191位有1株为组氨酸;10株病毒NA基因在62⁶4位均存在缺失的现象,从而导致61位的糖基化位点缺失,NA基因第402位均出现了由天冬酰胺(N)到天冬氨酸(D)的变异,8株病毒只具有6个糖基化位点。     

犬源H9N2亚型流感病毒的遗传进化及其致病性分析

【目的】明确犬源H9N2亚型流感病毒的分子变异特征及致病性,为今后探究流感病毒的禽—犬跨种传播机制提供科学依据。【方法】从流浪犬中分离H9N2亚型流感病毒,利用RT-PCR扩增其8个基因节段进行BLAST同源比对,然后基于国内外的22株参考毒株进行遗传进化分析,并通过小鼠滴鼻感染试验评估分离毒株的致病性。【结果】从采集的393份犬鼻拭子样品中分离获得1株H9N2亚型流感病毒,命名为A/canine/Guangxi/LZ11/2018(简写为LZ11)。分离毒株LZ11为三重组毒株,其中,HA、NA和NS基因属于BJ/94类谱系,PB2和M基因属于G1类谱系,PB1、PA和NP基因属于F/98类谱系;病毒基因组成属于近年我国广泛流行的S基因型。分离毒株LZ11的HA蛋白在第324～331位存在1个裂解位点(PSRSSR↓GL),符合低致病性流感病毒的特征;HA蛋白还出现²²⁶Q→L突变,具有优先结合人类α-2,6唾液酸受体的能力;NA蛋白在¹¹⁹E、¹⁵¹D、²⁷⁶E、²⁹²R和...     

华东地区H9N2亚型禽流感病毒HA基因的遗传演化分析

为了解华东地区H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的遗传特点和流行规律,利用RT-PCR方法扩增华东地区2008~2013年分离的17株H9N2亚型AIV血凝素(HA)基因片段,进行序列测定和遗传进化分析,并对HA蛋白质的裂解位点、受体结合位点和潜在的糖基化位点进行分析。结果显示,17株H9N2亚型AIV HA基因核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为84.6%~99.3%和86.0%~99.5%,均属于欧亚分支。其中15株鸡源病毒属于Y280-like亚系,2株鸭源病毒属于G1-like亚系。HA裂解位点都是非连续碱性氨基酸,属于低致病力毒株。HA受体结合位点149、150、191、198和234位氨基酸存在变异,尤其是234位氨基酸有14株毒株变为L,表现出人流感病毒受体结合特性。有2株毒株在145位氨基酸出现新的糖基化位点,5个毒株在218位氨基酸缺失1个糖基化位点,13个毒株在313位氨基酸增加了一个新的糖基化位点。研究结果表明华东地区近年来H9N2亚型AIV存在一定的变异,应加强对该类病毒的分子流行病学监测。     

四株H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆与分子特征分析

对分离自北方地区发病鸡群中的四株H9N2亚型禽流感病毒(AIV)进行了血凝素(HA)基因的全长扩增和序列测定.将其核苷酸序列及推定的氨基酸序列与GenBank中已有的参考序列进行比较并绘制了系统进化树.结果表明基于HA基因多个不同的核苷酸区段所做的系统发育分析结果基本一致.尽管分离时间不同,但这四株AIV的HA基因同源性很高,均属于A/DK/HK/Y280/97-like病毒.四株病毒在HA裂解位点、受体结合位点以及推测的糖基化位点的氨基酸序列均与上述亚系相似,但是其中的两株病毒由于一个核苷酸的变异,缺失了HA上298～300位的一个潜在的糖基化位点.     

H9N2亚型AIV鼠肺适应株的获得及其氨基酸变异分析

【目的】将H9N2亚型禽流感病毒在豚鼠体内连续性传播9代后,能够稳定的在豚鼠间传播,可见H9N2亚型禽流感病毒对哺乳动物的感染能力以及在哺乳动物间传播的能力还是很强的。因此,使用此株病毒A/Chicken/Jinan/Li-2/2010(H9N2)简称JN,应用小鼠动物模型,研究H9N2亚型流感病毒在小鼠肺内适应性传代后对小鼠的致病力,以及传代过程中流感病毒的变异。检测和筛选流感病毒致病性变异的关键氨基酸位点,探索H9N2亚型流感病毒变异的分子机制。【方法】将一株H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Jinan/Li-2/2010（H9N2）在小鼠的肺脏进行传代,将小鼠解剖、摘除肺部、研磨离心后经滴鼻接种下一代小鼠,传播九代后,用MDCK细胞扩繁病毒,得到鼠肺适应株JN-P9-2-M1;扩增、克隆传代病毒JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1的全基因测序,推断各基因编码的氨基酸,与JN原代病毒(P0)的核苷酸和氨基酸相比对,得到各代次病毒核苷酸与氨基酸变化的位点;解剖小鼠,获得小鼠的肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑和肠,滴定各组织中的病毒滴度,检测病毒的组织噬性;乙醚麻醉小鼠后,每个病毒稀释度鼻内接种3只小鼠,检测小鼠的幸存率和发病率;采集攻毒小鼠的肺部,固定后进行病理切片和免疫组化,比较JN原代病毒与JN-P9-2-M1对小鼠肺部的损害。【结果】JN-P9-2-M1对小鼠的致病性明显提高,其MLD₅₀为10^3.5EID₅₀,10⁶EID₅₀、10⁵EID₅₀、10⁴EID₅₀攻毒剂量的小鼠幸存率是0,而原毒JN对小鼠不致死,JN-P9-2-M1对小鼠的致病性比原毒提高了至少1 000倍;攻入JN-P9-2-M1病毒剂量为10⁶-10³EID₅₀的小鼠,体重明显减少,临床症状也很明显,攻毒后3-8 d,小鼠表现精神萎靡、被毛零乱、呼吸急促、弓背等症状,而原毒JN在10⁶EID₅₀时,小鼠的体重变化率都跟阴性对照组相似;JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1同原毒JN的受体结合特性相同,都是只能特异性结合SAa-2,6Gal受体,具有人样流感病毒的受体结合特性;JN病毒仅能在小鼠肺部检测到,病毒滴度很高,而JN-P9-2-M1不仅在小鼠肺部有很高的滴度,在小鼠的肝脏、脾脏、肾脏和脑部都能检测到。【结论】 JN-P9-2-M1对小鼠的致病性明显提高,比原毒提高了至少1 000倍;PB2 E627K、HA N313D和HA N496S等3个位点可能是病毒对小鼠致病力初步提高的原因,而PA L342I和NA N218T这两个点突变,就有可能是进一步提高病毒对小鼠致病力的关键位点。     

北京3株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列分析

[目的]为了解2000年北京地区H9N2分离毒株的遗传特点。[方法]采用RT-PCR技术扩增了3株H9N2亚型禽流感病毒北京地区分离株的HA基因片段,并对所得序列进行分析比较。[结果]遗传演化分析表明,所分离的3个毒株的HA基因与其他中国内地和香港毒株的同源性分别为XU株84.8%（Dk/HK/Y439/97）～98%（Ck/GX17/00）,LIU株85.1%（Dk/HK/Y439/97）～99.1%（Ck/GX17/00）,BEI株90.7%（Ck/BJ/3/01）～99.1%（Ck/GX17/00）。氨基酸序列分析发现,3株病毒均为禽源低致病力毒株,226位氨基酸均为L（Leu）,更易于与人类细胞结合;HA蛋白存在7个糖基化位点。[结论]从分子水平分析,A/Chicken/Beijing/xu/00、A/Chicken/Beijing/bei/00和A/Chicken/Beijing/liu/00株属于低致病力的H9N2亚型禽源毒株。     

H9N2亚型禽流感病毒的致病特性研究

将SS,KMI,KMIII3个禽流感病毒的感染性胚液分别中2周龄及5周龄的SPF鸡,观察其症状及病理变化。结果显示：1,3个毒株均可引起攻毒鸡体温升高,部分出现水样淡黄色稀粪,但不能致死攻毒鸡,表明3个毒株均为非高致病力毒株,2,攻毒鸡除胰腺充血出血外,其他器官不见明显的肉眼病理变化,但组织病理病理学的变化较为明显和一致,主要为：脑及脊髓充血出血,神经元变性坏死,胶质细胞增生;心肌在出血,组织变性坏列, 腺充血出血,组织坏死,3个毒株对5周龄SPF鸡的病理变化无明显差异,但KMI毒株对2周龄SPF鸡的病理损害稍大于SS株。     

广西2株H9N2亚型猪源流感病毒的HA基因序列分析

[目的]了解广西H9 N2亚型猪源流感病毒的分子流行病学特征并揭示其遗传变化规律,为有效防控猪流感提供参考依据.[方法]运用PCR方法扩增广西2株H9N2亚型猪源流感病毒(A/swine/Guangxi/P2/2011和A/swine/Guangxi/P3/2011)的HA基因,并进行克隆测序及序列比对分析,绘制遗传进...     

1998-2021年我国人感染H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化规律

【目的】通过分析1998—2021年间我国人感染H9N2亚型禽流感病例的发病时间、所在省份、年龄和性别等信息,明确H9N2亚型禽流感病毒的流行病学特征;通过分析人源H9N2亚型禽流感病毒的基因特征,阐明人源H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化规律;为H9N2亚型禽流感病毒跨种间传播的预警和防控提供数据支撑。【方法】基于流感基因数据库、病例报道和文献资料,获得1998—2021年我国人感染H9N2亚型禽流感病毒的病例信息和毒株序列数据。从时间、空间、性别和年龄的分布对感染病例进行分析,明确人源H9N2亚型禽流感病毒感染的流行病学特征。通过DNASTAR中的MegAlign软件对人源H9N2病毒的各基因片段的核苷酸序列进行同源性分析,利用MEGA7.0软件构建系统进化树和分析病毒蛋白关键位点,揭示遗传演化趋势和病毒蛋白关键氨基酸位点的变异情况。通过GISAID网站下载2019—2021年间我国H9N2亚型禽流感病毒的核苷酸序列,利用mafft比对后在MEGA7.0中查看人源与禽源H9N2病毒关键氨基酸位点的突变差异,揭示当前人源和禽源H9N2病毒可能引起的风险。【结果】1998—2021年我国...     

H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为 10^6.5 EID₅₀·mL^-1 的 H7N9 亚型禽流感病毒尿囊液依次进行 10 倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR 方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测 H1-H15 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1-N9 亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9 亚型 AIV 样品有特异性目的条带,与其他N1-N9 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对 H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为 1.4×10^2.5 EID₅₀·mL^-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR 方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。     

浙江省5株H9N2亚型禽流感病毒的血凝素基因分子特征与遗传进化分析

H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)是我国禽类中最流行的低致病性禽流感(LPAIV),因其持续的抗原漂移与跨物种传播风险对养殖业和公共卫生安全构成严重威胁。为了解浙江省流行的H9N2亚型AIV的遗传进化特征,本研究对当地分离到的5株H9N2亚型AIV毒株的血凝素(HA)基因进行测序与分子特征分析。结果显示,5株分离株分属于欧亚谱系的h9.4.2.1和h9.4.2.5分支,HA基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为83.51%~99.88%和86.33%~99.83%。值得注意的是,分离株A/Chicken/Zhejiang/HZ01/2022和A/Duck/Zhejiang/TZ01/2022与疫苗株CK/SS/94的HA基因核苷酸同源性仅为88.24%~88.35%,氨基酸同源性为89.43%~90.82%。所有分离株的HA裂解位点均呈单碱性氨基酸特征,符合低致病性病毒特性。受体结合位点分析发现存在I163T、H191N、A198T/V、Q234L和Q235M突变,这些突变可能增强病毒与人源唾液酸α-2,6-半乳糖受体的结合能力。糖基化位点分析显示,分离株存在7~8个潜在糖基化位点,其中218和551位点缺失,206和313位点增加,这些变异可能增强病毒对哺乳动物宿主的适应性。此外,HA蛋白抗原位点存在234、285和334位点突变,而181、280、281与296位点高度保守。研究表明,浙江省H9N2亚型AIV通过关键位点突变和糖基化模式改变持续进化,可能导致病毒毒力增强、疫苗保护效力下降,并增加跨物种传播风险。亟须加强本地流行毒株的分子监测,优化疫苗株匹配性,以提升防控效能并降低公共卫生威胁。     

抗H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的制备及亚型鉴定

用基因疫苗pcDNA-H9、纯化H9N2亚型AIV和重组噬菌体T4-H9HA免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用HI和ELISA方法筛选出5株抗H9亚型AIV HA的特异性单克隆抗体H9-01(2E6)、H9-02(3B1)、H9-03(3H11)、H9-04(1A4)、H9-05(2G9)。各株单抗亚型测定的结果为H9-01、H9-02和H9-05均为IgG2b,H9-03为IgG1,H9-04为IgG2a,轻链的亚型均为kappa链。经特异性和与同型病毒的反应谱检测,它们均是HA特异性单克隆抗体。为进一步分析H9N2亚型AIV的结构与功能以及建立监测该亚型AIV的试剂盒奠定了基础。     

H9N2亚型禽流感病毒HA基因体外转录及RNA标准品的初步构建

为了提高H9N2亚型禽流感病毒核酸检测结果的准确性,同时减少试验操作中的污染,对H9N2亚型禽流感病毒HA全长基因序列进行克隆及体外转录,构建用于检测H9N2亚型禽流感HA基因阳性核酸标准品。采用实时荧光定量RT-PCR方法对转录的RNA片段进行验证。结果表明:HA体外转录产物可以准确提供RNA片段的拷贝数并进行定性和定量分析。H9N2亚型禽流感病毒HA基因体外转录RNA可作为H9N2禽流感病毒核酸检测标准品的候选产物。     

1 株 H7N9 亚型禽流感病毒的遗传进化和分子特征分析

对 1 株 H7N9 亚型禽流感毒株 A/environment/Hebei/621/2017（H7N9）简称 EN621 进行基因测序和序列分析, 研究其遗传进化趋势和分子生物学特征。结果显示, 该毒株血凝素（Hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）分别与人源流感毒株的 HA 和 NA 属于同一进化支进化而来, EN621 毒株 HA 蛋白的裂解位点存在多个连续碱性氨基酸,符合典型高致病性 AIV 特征;HA 蛋白上有 4 个糖基化位点与人源流感毒株 HA 蛋白糖基化位点一致, 且第 226 位氨基酸为 Q, 优先与禽类 α-2,3 唾液酸受体结合;NA 蛋白上有6 个潜在糖基化位点与人源流感毒株 NA 蛋白糖基化位点一致;NP 蛋白第 184 氨基酸位点由 A 突变为 K, 对于 AIV 的复制和致病性有着密切联系。本研究提示 EN621 毒株存在感染人的潜在可能性, 应加强 H7N9 亚型禽流感病毒的监测, 建立相应的防范机制,保障公共安全。     

抗H9N2 AIV HA单克隆抗体的制备及其在胶体金层析检测中的初步应用

用基因疫苗pcDNA-H9和纯化H9N2亚型AIV免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用HI和ELISA方法筛选出5株抗H9亚型AIV HA的特异性单克隆抗体H9-01(2E6),H9-02(3B1),H9-03(3H11),H9-04(1A4),H9-05(2G9)。各株单抗亚型测定的结果为H9-01,H9-02和H9-05均为IgG2b,H9-03为IgG1,H9-04为IgG2a,轻链的亚型均为kappa链。经特异性和与同型病毒的反应谱检测,它们均是HA特异性单克隆抗体。用制备的抗H9亚型AIV HA的单克隆抗体做成胶体金层析检测试纸条,可以检测到200个EID50的H9亚型AIV,为监测该亚型AIV试剂盒的进一步商品化奠定了基础。