猪精子RNA提取的初步研究

实验采用Trizol一次法或试剂盒提取猪精子的总RNA,然后通过RT-PCR扩增的方法,检测精子和睾丸组织中鱼精蛋白(PRM-1)的mRNA;使用不同数量的精子,检测在本实验条件下能扩增出PRM-1带所需要的最小精子数量;通过OD260/280的测算,判断不同提取方法所得RNA的纯度;通过琼脂糖电泳得到精子RNA与睾丸、卵巢组织RNA的电泳图。实验结果表明:在使用RNA沉淀剂时,1.51×107精子可检测到PRM-1的mRNA,不使用沉淀剂则需要3.02×107精子才检测到;使用Trizol一次法提取的精子总RNA纯度较常规Mini试剂盒(W6221)高;本实验首次得到猪精子总RNA的普通琼脂糖凝胶电泳图。初步研究的结果表明,Trizol一次法可用来提取精子总RNA供进一步研究;猪精子RNA的28S和18S片段与睾丸、卵巢组织无明显差异。     

奶牛精子RNA提取

优选3头公牛细管冻精,采用上游法获得纯化精子,以含体细胞污染的精子作对照,应用离心层析柱方法和Trizol一步法相结合提取总RNA,紫外分光光度计检测总RNA的D260/280值和产量,并对总RNA进行RT-PCR和凝胶电泳。结果显示,纯化的牛精子中不含体细胞,奶牛细管精液总RNA在2 h内完成提取,D260/280值为1.80,大于200 bp的总RNA产量为0.92 μg/107个精子,精子总RNA进行RT-PCR,电泳后可得到清晰的SRY、LEP和RPS23基因3条带,不含18S rRNA基因条带。结果表明,离心层析柱法和Trizol一步法相结合可获得高质量的奶牛精子总RNA,且纯度和完整度高,可满足分子生物学研究的要求。     

猪精子结合和内化外源基因的影响因素研究

精子介导基因转移(SMGT)是目前转基因动物研究中简单而高效的方法之一,其中精子结合和内化外源基因的效率是精子介导转基因成功的关键.本试验以DIG标记的线性化EGFP作为示踪基因来检测猪精子结合和内化外源基因的影响因素,结果表明:猪精子能够自发结合外源基因,结合部位主要在精子顶体后区.精子结合外源DNA的阳性率随共孵育时间延长而增加,在37℃或39℃时孵育60 min后,阳性率不再增加;在17℃时孵育90min后,阳性率不再增加.在检查的15只公猪样本中,精子与外源DNA的结合率为6.57%～35.81%,内化率为2.99%～24.66%,个体间差异显著(P<0.01).精浆能够强烈抑制外源基因的结合和内化,脂质体及DMSO能够显著提高转染效率.死精子能够结合外源基因,但不能将其内化;反复冻融导致质膜破裂的精子对外源基因有更高的结合率,且不受个体影响.     

沙子岭猪睾丸组织发育过程中差异表达基因的筛选及注释

本研究采用RNA-seq技术对60(DS)、90(DN)、120(DT)、150(DF)日龄沙子岭猪睾丸组织进行转录测序,筛选差异表达基因并进行功能注释,从而为进一步研究猪睾丸组织发育和精子生成的分子调控机制奠定理论基础。结果表明,各文库获得的序列数量共计1 095 135 628条,164.26 GB,其中比对至猪参考基因组的序列比例为73.07%～75.64%,共有25 491条转录本,对应21 606个基因;DN VS. DS组的差异表达基因数量为1 606个,其中1 216个上调基因显著富集于40条GO项,390个下调基因显著富集于166条GO项;DT VS. DN组的差异表达基因数量为180个,其中97个下调基因显著富集于37条GO项;DF VS.DT组的差异表达基因数量为438个,其中243个下调基因显著富集于22条GO项。说明沙子岭猪睾丸组织发育过程中基因表达存在明显差异,尤其是60日龄至90日龄期间,这些差异表达基因可为进一步研究沙子岭猪睾丸组织发育和精子生成的分子机制提供参考依据。     

猪睾丸组织的形态学观察、细胞凋亡和巴豆酰化修饰

制作睾丸组织切片,运用HE染色和细胞TUNEL染色分别观察不同发育阶段猪睾丸的形态学和细胞凋亡;提取睾丸组织蛋白,利用免疫印迹检测不同发育阶段猪睾丸蛋白的Kcr修饰水平;最后利用免疫荧光技术检测Kcr蛋白在猪睾丸组织中的定位.结果 显示,随着月龄的增长,猪睾丸精细管管腔直径增加,睾丸组织在4月龄时精细胞开始分裂,凋亡细...     

牛组织高质量总RNA和mRNA的提取

实验以牛肌肉、肝脏等组织为材料,分别应用一步法和磁珠法提取总RNA和mRNA,通过反复试验分别改进提取过程中的部分操作步骤。结果表明：提取的的RNA和mRNA具有较好的均一性和完整性,符合进一步研究的需要。为不具备专用RNA操作间的实验室开展此方面的工作提供参考。     

精子RNA的研究进展

1 精子RNA存在的争论 作为遗传物质的载体,精子的作用仅是将父本的基因组DNA成功地带入到卵子中,所以成熟精子不必含mRNA,这个观点被广泛接受.有关精子中存在RNA的报道,常被解释为有未成熟的精子细胞的存在,或是精子分析样本中混杂有体细胞,或是精子中含有未被支持细胞吸收的胞质小体造成~([1]),而胞质小体的存在又通常被认为是精子成熟度低的标志.     

精子RNA的研究进展

1精子RNA存在的争论 作为遗传物质的载体，精子的作用仅是将父本的基因组DNA成功地带入到卵子中，所以成熟精子不必含mRNA，这个观点被广泛接受。有关精子中存在RNA的报道，常被解释为有未成熟的精子细胞的存在，或是精子分析样本中混杂有体细胞，或是精子中含有未被支持细胞吸收的胞质小体造成，而胞质小体的存在又通常被认为是精子成熟度低的标志。     

用RT-PCR技术检测盐渍猪肠衣中猪瘟病毒的研究

参考GenBank中发表的猪瘟病毒（CSFV）序列，设计一对CSFV特异性PCR引物；从CSFV感染猪盐渍小肠中提取总RNA，经逆转录后进行PCR扩增，在盐渍小肠中成功扩增出与预期大小（168bp）一致的特异性条带，而正常猪和感染猪伪狂犬病病毒的猪小肠扩增结果均为阴性。用本方法对20例不同稀释浓度的盐渍猪肠衣样本进行检测，结果显示比经典抗原检测方法（抗原捕获ELISA法）具有更高的敏感性。实验表明，本RT—PCR技术能应用于盐渍猪肠衣的CSFV检测，为快速、准确检测盐渍猪肠衣中CSFV提供了一条新途径。     

供港猪群流感病毒的分离鉴定及流行病学调查

为了对供港猪群中的猪流感流行情况进行分析,从华南地区供港猪群中用无菌棉拭子采集鼻腔粘液样品,采用鸡胚接种方法,从供港猪群中分离出了2株不同亚型的猪流感病毒株,经国家流感中心鉴定分别为H1N1和H3N2亚型。本研究设计了猪流感常见亚型的HA和NA分型特异性引物,建立了猪流感型特异性RT-PCR检测方法;对分离鉴定的2株猪流感病毒和禽流感H5N1 HI检测抗原进行了RT-PCR检测,并对其部分HA和NA基因进行克隆测序分析。对供港猪群的血清检测结果表明:供港猪群中H1N1和H3N2亚型抗体阳性率分别为26.87%、38.26%,禽流感H5N1和H9N2亚型抗体阳性率均为0%。     

口蹄疫与经典猪瘟二联RT-PCR诊断方法的建立及其应用

根据口蹄疫病毒(FMDV)与猪瘟病毒(CSFV)基因组序列高度保守区,设计合成2对引物,以CSFV和FMDV培养物提取RNA并反转录,进行RT-PCR特异性片段扩增,扩增片段大小分别为200 bp、141 bp.结果表明,扩增产物与设计的2对引物之间的序列大小一致.通过特异性与敏感性试验,CSFV与FMDV培养物均可扩增至10-5倍稀释,最终建立的二联RT-PCR方法对上述2种病毒的敏感性亦可达10-4倍稀释,约10 pg的总RNA,证明本法对上述2种病毒具有快速、特异和高度敏感的特点.     

“猪瘟和非洲猪瘟的综合防治措施”专栏(二) 猪瘟病毒诊断方法的现状和发展

猪瘟是一种高度传染性疾病,能在世界范围内引起猪群的大幅度减少.这种疾病在亚洲和中南美的大部分地区、欧洲和非洲的部分地区都有发生.澳大利亚、美国、加拿大以及欧盟等国家已经根除了这种疾病,但南非、德国、荷兰、英国等国还有零星复发.引发猪瘟的病毒属于黄病毒科瘟病毒属的一个成员.对于猪瘟的首次诊断是根据兽医对临床症状和尸体剖解后作出判定的,但许多症状也不完全与猪瘟有关,它们可能会随着病毒株的不同、猪的年龄与健康状况的差异而改变.由于临床症状可能会与其他猪传染病混淆,因此猪瘟的实验室诊断是必不可少的.国际兽疫局和欧盟已经批准了猪瘟诊断手册,为本病的确诊建立取样方法和诊断程序.本文对目前诊断方法的现状进行分析并补充一些新的发展,重点在于介绍反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术.     

健康屠宰猪中博卡病毒的检测及遗传演化分析

为了解我国健康猪群中猪博卡病毒(PBoV)的感染状况,从屠宰场内采集猪淋巴结、脾脏和扁桃体等组织,分别采用套式PCR进行猪博卡病毒1型和2型的检测。结果表明,28份样品中有2份样品用猪博卡病毒2型引物可扩增出439 bp的特异性条带;结构蛋白VP1基因序列分析表明,这2份样品均为猪博卡病毒2型感染,且其VP1序列与猪博卡病毒参考株HM053694的同源性最高,分别达93.8%和93.3%,同属PBoV1/PBoV2进化分支;而与另一个猪博卡病毒V6/V7进化分支的同源性仅为35.1%～39.2%,距离较远。     

高致病性猪蓝耳病病原核酸的RT-PCR检测

对高致病性猪蓝耳病病毒（PRRSV）Nsp2基因缺失变异特征,设计特异性引物,建立RT—PCR方法,对疑似高致病性猪蓝耳病病例进行病原核酸检测,并对扩增所得片段进行克隆测序,通过序列分析以验证RT—PCR扩增的特异性。结果表明：发病猪为高致病性猪蓝耳病病毒感染,建立的RT-PCR方法能够鉴别诊断经典猪蓝耳病和高致病性猪蓝耳病感染。     

猪瘟Erns基因在大肠杆菌中的高效表达

提取猪瘟病毒石门系强毒株的基因组RNA,用RT_PCR扩增其Erns基因的cDNA,将其克隆到原核表达载体pPROEXTMHTc中,然后转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导,Erns基因获得高效表达。SDS_PAGE分析显示,表达的重组融合蛋白表现分子量约为31ku。Westernblot分析表明,重组蛋白具有良好的免疫原性。重组蛋白可用于制备诊断抗原,用于标记疫苗接种和野毒感染的鉴别诊断。