谷子F-box家族基因的鉴定、分类及干旱响应

蛋白参与细胞周期调控、细胞凋亡及信号转导等多种生命活动对维持植物正常生长发育和介导非生阿物胁迫响应等过程发挥重要作用。谷子具有显著的耐旱耐瘠薄等特性本研究根据谷子转录组分析结果从个家族成员中鉴定出个在干旱胁迫下表达量上调的基因根据序列相似性将其分为类同一类基因具有相似的内含子外显子结构染色体定位分析发现这些基因分别分布在谷子的条染色体上其中第条染色体上含基因最多有个。结构域分析结果表明个蛋白均含保守的结构域而端含、、、、和等结构域。启动子元件分析表明谷子个基因均含逆境应答元件其中和元件的数量最多个说明这些基因对干旱应答反应可能主要受、转录因子调控。转录组分析结果表明基因对干旱胁迫的响应远远高于其他成员对干旱、高盐、、和都有响应亚细胞定位结果显示蛋白定位在细胞核中。本研究为进一步深入了解基因的功能提供了依据。F-box蛋白参与细胞周期调控、细胞凋亡及信号转导等多种生命活动, 对维持植物正常生长发育a和介导非生阿物胁迫响应等过程发挥重要作用。谷子具有显著的耐旱耐瘠薄等特性, 本研究根据谷子转录组分析结果, 从525个F-box家族成员中鉴定出19个在干旱胁迫下表达量上调的F-box基因; 根据序列相似性将其分为6类, 同一类基因具有相似的内含子-外显子结构; 染色体定位分析发现, 这些基因分别分布在谷子的8条染色体上, 其中, 第2条染色体上含F-box基因最多, 有6个。结构域分析结果表明, 19个F-box蛋白均含保守的F-box结构域, 而C端含FBD、WD40、FBA、ZnF、Kelch和LRR等结构域。启动子元件分析表明, 谷子19个F-box基因均含逆境应答元件, 其中, MYB和MYC元件的数量最多(9~78个), 说明这些基因对干旱应答反应可能主要受MYB、MYC转录因子调控。转录组分析结果表明, SiF-box18基因对干旱胁迫的响应远远高于其他F-box成员, 对干旱、高盐、ABA、SA和JA都有响应; 亚细胞定位结果显示, SiF-box18蛋白定位在细胞核中。本研究为进一步深入了解SiF-box18基因的功能提供了依据。     

陆地棉低温响应基因GhJAZ1的克隆及表达分析

为了深入研究棉花JAZ基因在低温响应中的作用机理,利用RT-PCR方法从陆地棉中棉所36中克隆出一个低温应答基因GhJAZ1(GenBank登录号KJ562212)。全长CDS序列为810 bp,编码270个氨基酸,预测编码蛋白质的分子量为29.808 ku,理论等电点为8.33,为非跨膜蛋白。该基因编码蛋白具有一个N端NT结构域、一个TIFY结构域和一个C端Jas结构域。系统进化树分析发现,该蛋白与可可树和黄麻的亲缘关系最近。荧光实时定量PCR分析发现,GhJAZ1基因在下胚轴和根中显著高表达。此外,该基因还受到脱落酸(ABA)和茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导表达,表达量变化趋势均为先升高后降低,但在MeJA诱导下该基因的表达量变化更明显。在低温胁迫下,不同低温耐性棉花材料中该基因的表达量变化程度也不同,耐低温品种中棉所36中GhJAZ1基因的上调表达更为显著,推测该基因参与了棉花低温胁迫防御反应。亚细胞定位显示,GhJAZ1蛋白定位于细胞核中。该研究可为进一步开展GhJAZ1基因低温响应的分子机制研究奠定基础。     

一个棉花β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA的克隆与特征分析

利用本实验室分离的防卫基因类似物片段,通过5’和3’RACE,从海岛棉海7124中克隆了一个β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA,命名为GbGLU。其全长1 266 bp,含一个编码361个氨基酸残基的开放阅读框。该基因编码产物理论分子量和等电点为MW = 39.66 kD,pI = 9.15,含有糖基水解酶家族17的保守结构域,N端有26个氨基酸残基组成的信号肽。Southern结果显示,GbGLU在棉花基因组中以单拷贝形式存在,研究发现,GbGLU的表达受黄萎病菌的诱导。聚类分析表明,棉花葡聚糖酶基因可分为3类,分别含有糖基水解酶家族3、9、17的保守结构域。无论棉花中的还是本研究中参考的其他作物中,受病菌诱导的葡聚糖酶基因都含有糖基水解酶家族17的保守结构域,故推断其为此类基因参与抗病反应的功能域。     

大白菜开花相关基因CO的BAC克隆筛选及分析

根据已经公布的大白菜CO基因(Bra008669)序列设计特异引物,采用三维PCR法筛选大白菜BAC文库,获得了3个含有CO的BAC克隆。对筛选到的3个BAC克隆进行PCR扩增,将克隆测序结果与大白菜CO基因进行序列比对,结果表明,相似性达到99.73%,且N端有保守B-BOX结构,C端有保守的CCT结构域,证明所筛选的3个BAC克隆是含有大白菜CO基因的克隆。     

雷蒙德氏棉和亚洲棉Alfin-like PHD finger家族的生物信息学分析

Alfin-like PHD finger是植物中特有的一类转录调控因子,在调控植物生长发育、非生物胁迫响应及抗病反应等过程中起重要作用。为全面了解Alfin-like PHD finger基因家族在雷蒙德氏棉和亚洲棉基因组中的数目、分布情况及家族各成员间的关系,进而研究和揭示Alfin-like PHD finger在棉花抵抗逆境胁迫中的作用。运用生物信息学的方法在雷蒙德氏棉(D5)和亚洲棉(A2)全基因组中分别鉴定出12个和10个Alfin-like PHD finger基因家族成员,并对家族成员的基因结构、染色体定位、保守结构域及进化关系等方面进行分析。结果表明,雷蒙德氏棉和亚洲棉中Alfin-like PHD finger转录因子具有高度保守的DUF3594结构域和PHD结构域,两个二倍体棉花中该家族基因成员之间为一对一关系;雷蒙德氏棉中的12个成员基因分布在5条染色体上,亚洲棉中的10个成员基因也分布在5条染色体上;亚细胞定位预测发现,该家族的基因分别定位于细胞核、叶绿体基质、过氧化物酶体和细胞质基质;根据结构域差异和系统发育分析结果,将Alfin-like PHD finger转录因子家族分为3个进化分支。上述结果为分离鉴定棉花中新的逆境胁迫响应基因提供参考。     

棉属野生种旱地棉蛋白激酶基因GarCIPK8的克隆与功能分析

CIPK (calcineurin B-like calcium sensor interacting protein kinase)是植物钙感受器钙调磷酸酶B类似蛋白特定靶向的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在前期的研究中, 我们将棉属野生种D亚组旱地棉(Gossypium aridum)盐胁迫前后RNA混合样品进行转录组测序, 发现一CIPK相关基因存在较高的转录丰度。盐胁迫下荧光定量PCR分析表明该基因在根部表现诱导上调表达, 推测该基因可能参与植物在高盐胁迫下的生理调控。利用电子克隆及RT-PCR方法从旱地棉中克隆了一个ORF全长为1350 bp的蛋白激酶基因GarCIPK8。序列分析表明该基因编码的蛋白含有449个氨基酸, 分子量为51.12 kD, 理论等电点为8.13, 其N端催化结构域包含一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶域, C端具有植物CIPK蛋白家族特有的24个氨基酸组成的NAF保守结构域; 与水稻OsCIPK8蛋白的相似度为73.95%。为进一步验证其功能, 利用组成型高效强启动子CaMV35S和拟南芥逆境胁迫启动子rd29A构建植物表达载体并转化烟草, 经PCR和RT-PCR分子检测, 证明GarCIPK8基因已经整合到烟草基因组中, 并正常表达。T₁代转基因植株耐盐性鉴定结果表明GarCIPK8基因对提高转基因植株的耐盐性有较明显的作用, PEG干旱模拟试验也证明GarCIPK8基因可增强植株的抗旱性。     

马尾松PmTIR1基因的克隆及编码蛋白质的结构预测

TIR1(transport inhibitor response 1)基因在生长素信号转导途径中发挥重要作用。本研究采用PCR技术和RACE技术,利用Primer Premier5进行引物设计,从马尾松中克隆出TIR1基因的全长c DNA序列,命名为Pm TIR1。此c DNA全长2 446 bp,包括1 725 bp完整的ORF,能够编码含有574个氨基酸的蛋白,此蛋白相对分子质量为64 240.3 u,等电点为6.76。利用Clustal X、ANTHEPROT和DNAMAN等软件分析Pm TIR1序列及其编码的氨基酸序列,结果表明:马尾松Pm TIR1蛋白氨基酸序列与火距松TIR1蛋白同源性高达99%,Pm TIR1蛋白含有F-box结构域和多个LRR结构域;Pm TIR1蛋白的F-box结构域可能与SCFTIR1中SKP1结合,它符合F-box家族的特点。利用实时定量技术得知Pm TIR1在马尾松嫩根、嫩茎、嫩叶中都有表达,在嫩叶中表达量最高、嫩根中次之、嫩茎中最低。本研究可为生长素调控马尾松生长发育相关机理提供理论依据。     

雷蒙德氏棉和亚洲棉TCP基因家族的生物信息学分析

TCP基因家族是植物中特有的一类转录因子家族,涉及了植物的多种生长途径以及各种生理生化反应的信号传导。为了更好地了解TCP基因家族在雷蒙德氏棉和亚洲棉基因组中的数量和分布情况等,通过生物信息学方法,在雷蒙德氏棉(D5)和亚洲棉(A2)全基因组中分别鉴定出37个TCP基因家族成员,并对TCP家族成员进行基因结构、染色体定位、保守域、进化关系等分析。结果表明,雷蒙德氏棉和亚洲棉全基因组分别编码37个TCP转录因子成员。雷蒙德氏棉30个成员基因分布在10条染色体上,亚洲棉37个成员基因分布在13条染色体上;内含子/外显子结构分析表明,TCP基因结构较为简单,大部分不含内含子;功能结构域分析,发现所有TCP转录因子具有高度保守的TCP结构域;根据结构域差异和系统发育分析的结果,将TCP基因家族分成2个亚族,进一步划分为PCF、CIN、CYC/TB1三个亚类。以上结果为进一步研究棉花TCP基因家族各成员的功能奠定一定的理论基础。     

南瓜CmNAC基因片段的克隆与序列分析

NAC转录因子是特异存在于植物中具有多种生物功能的新型转录因子,其家族成员N端含有保守氨基酸序列,C端为高度变异的转录激活区。本项研究以南瓜叶片为材料,根据甘蓝型油菜NAC1、番茄NAC、辣椒NAC保守结构域设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增得出长度约为440 bp大小的DNA片段,将其克隆至pMDl9-T载体上,而后对重组克隆进行测序,用BLAST和DNAMAN软件对核酸及氨基酸序列进行分析,结果表明所获得的南瓜NAC基因片段由442个碱基组成,编码147个氨基酸,命名为CmNAC。该基因片段具有其他植物NAC基因中存在的保守区,并且属于NAC家族中ATAF1/2亚家族。     

椰子DNMT家族基因的鉴定和生物信息学分析

DNA甲基化(DNA methylation)能引起染色质结构、DNA结构和稳定性等的改变,影响基因的时空表达。DNA甲基转移酶(DNA methyltrans ferase, DNMT)负责催化完成DNA的甲基化。本研究通过比对已有的椰子基因组数据,找到CnDNMT家族基因,删除不含DNA＿methylase结构域的蛋白,共鉴定4个具有DNA甲基转移酶保守结构域的DNMT基因,分别命名为CnDNMT1～CnDNMT4。采用生物信息学的方法,对基因结构、表达量、蛋白保守结构域、启动子序列等进行了分析。结果表明：这4个基因为DNA甲基转移酶家族中的2个亚家族：CMT和DRM。氨基酸序列分析表明,椰子CnDNMT家族蛋白均为酸性蛋白,且亚细胞定位预测定位在细胞核中。motif搜索结果表明CnDNMT蛋白家族含有5个椰子CnDNMT基因家族含有5个保守元件,5个保守元件的结构域所含有的氨基酸位点数量基本一致,CnDNMT2基因在胚乳中表达量很高,这说明CnDNMT2可能在椰子胚乳发育过程中起重要作用。     

棉花GhCO基因的克隆与表达分析

以中棉所36均一化全长cDNA文库为基础,利用RT-PCR技术从棉花中克隆了一个新的CO蛋白基因,命名为GhCO(GenBank:HM006910)。GhCO cDNA的ORF全长为1017 bp,编码338个氨基酸,含有一个CCT域和两个BBOX域。序列比较分析结果表明,GhCO蛋白与蓖麻RcCO、芒果MiCO具有较高的同源性,是棉花CO蛋白家族中的新成员。QRT-PCR结果表明,GhCO在棉花的花、蕾、胚珠等均有表达,而且在蕾和花中优势表达。GhCO在花芽分化形态出现以前就已经高调表达,推测可能与棉花的花芽分化有关。AtCO已经证明在花发育过程中对开花时间起正向调节因子的作用,推测GhCO蛋白在花发育过程中可能起重要作用。因此,构建了pBIGhCO过量表达载体,为进一步研究GhCO的功能奠定了重要的基础。     

棉花3种抗逆相关基因对苗蚜为害的应答反应

 使用荧光定量PCR方法,分析了中棉所41、中棉所44、中棉所49和中棉所79等4种不同遗传背景的棉花品种在受到苗蚜为害时,编码类受体蛋白激酶（LRR-RLK）、ATP合酶β亚基（Atpβ）和捕光蛋白复合物Ⅱ（Lhcb2）等3种代谢相关基因的变化情况。在4种棉花品种中,LRR-RLK的表达量变化情况差异较大,该类LRR-RLK的表达量变化与蚜虫的为害有关;Lhcb2基因在中棉所41的子叶和真叶中、中棉所49的真叶中、中棉所44和中棉所79的子叶中对棉蚜的为害应答比较强烈;Atpβ基因在中棉所41和中棉所49真叶中、中棉所44子叶和真叶中应答反应比较强烈,在中棉所79中应答反应较弱。以上试验结果暗示不同的棉花品种应对苗蚜为害可能存在不同的代谢途径。     

棉花转基因材料的获得及主要农艺性状变异分析

 利用不同棉花受体材料进行花粉管通道法遗传转化研究。通过卡那霉素鉴定、抗虫性鉴定和PCR分子生物学鉴定,证明已成功将Bt基因转化到泗棉3号、辽棉15、中棉所19、中棉所29母本、中棉所35、中棉所36等棉花材料中。通过对转基因材料后代与非转基因材料的铃重、衣分和纤维品质等差异分析,发现花粉管通道转基因后代材料存在广泛的变异。     

Proteomic Analysis of a Cotton Virescent Mutant Obtained by Space Mutation

We extracted total protein from the second-to-top leaves from the cotton line CCRI 58 and its virescent mutant CCRI 58vsp, which was obtained by space mutation. The protein profiles of the two lines were obtained by isoelectric focusing followed by SDS-PAGE. We analyzed the relative abundance of differentially expressed proteins in leaves between CCRI 58 and CCRI 58vsp using ImageMaster-2D Elite 7.0 software, and further identified the differentially expressed protein spots by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF/TOF) analysis. The results showed that 41 proteins showed differential expressions between CCRI 58 and CCRI 58vsp. The PI values of these proteins were mainly concentrated in the range of 4.0 to 7.0 and their molecular weights ranged from 15.0 to 95.0 kDa. After further MALDI-TOF/TOF analysis, we identified 14 of the differentially expression proteins. Among these were ribulose-1,5 bisphosphate carboxylase/oxygenase, S-adenosylmethionine synthase, and flavanone3-hydroxylase. The positively identified proteins were associated with photosynthesis and light respiration, ethylene and polyamine synthesis, and flavonoid synthesis. Based on these differentially expressed proteins, we can explain some of the mechanisms of the cotton virescent mutant at the protein level.     

风、蜜蜂因素对转Cry1Ac基因棉花花粉介导的基因漂移的影响

在温室内人工创造风力和释放传粉昆虫蜜蜂的条件下,应用PCR和蛋白试纸条结合的方法检测外源Cry1Ac基因通过花粉漂移至非转基因棉的频率和距离.结果表明:风力处理和蜜蜂处理的基因漂移频率均显著高于空白对照.漂移至非转基因亲本棉石远321的频率显著高于陆地棉中棉所35和海岛棉吉扎1号.漂移至石远321的频率随距离远近差异显著,而漂移至中棉所35和吉扎1号的频率在不同距离上差异不显著.风力处理共检测到阳性样本72个,在检测范围内,漂移至石远321的最远距离为25.6 m,漂移至中棉所35和吉扎1号的最远距离均为19.2 m.蜜蜂处理中共检测到阳性样本75个,在检测范围内,漂移到常规棉的最远漂移距离均达到设置最远处36 m,并在此处达到峰值.本研究可为转基因棉花基因漂移生态风险性评估提供参考.     

陆地棉开花相关基因GhFLP1的克隆与功能验证

为了明确陆地棉开花促进因子基因的作用,以中棉所36叶片基因组DNA和cDNA为材料克隆得到了开花相关基因Gh FLP1,分析了其特征及功能。该基因全长为537 bp,包含339 bp开放阅读框,编码112个氨基酸。预测分子量约为12.176 kDa,理论等电点为9.13。组织特异性表达分析表明,该基因在花蕾中优势表达,且在早熟品种(中棉所36、中棉所74)中表达量高于中熟品种(中棉所60、鲁棉研28)。启动子序列分析和外源激素处理实验表明该基因受水杨酸和赤霉素调控。农杆菌介导转化拟南芥发现,该基因能促使拟南芥莲座叶减少,开花期提前。荧光定量结果表明,在转基因拟南芥中,内源开花相关基因AtFT、AtLFY、AtAP1和AtSOC1表达量不同程度上调,AtFUL表达量基本不变,AtFLC表达量下调。研究结果显示该基因可能参与陆地棉开花时间的调控,为创制转基因早熟棉花新材料打下基础。     

棉花子叶衰老过程中氮素的再利用

 以陆地棉早熟品种中棉所58和中熟品种邯郸109为材料,研究子叶衰老过程中氮素的再利用率（NRE）及氮代谢相关指标的变化。结果表明：子叶衰老过程中,单位面积总N含量（NPA）逐渐降低,中棉所58 NRE为69.26%,邯郸109为54.45%;叶绿素、可溶性蛋白质含量和硝酸还原酶（NR）活性先上升后降低,NR最先降低,中棉所58和邯郸109分别在9 d、14 d开始下降;中棉所58各指标比邯郸109早下降4～8 d。谷氨酸脱氢酶（GDH）活性先下降后上升,表明GDH可能是氮素再利用的关键酶。     

The Difference and Mechanism in Tolerance to Low-Potassium among Cotton Seedlings Over-Expressed Arabidopsis AtCIPK 23, AtAKT 1 and AtCBL 1 Genes

[Objective] To provide theoretical basis for potassium efficient cotton breeding, this work aimed to evaluate the influence of low potassium on transgenic cotton seedlings over-expressing Arabidopsis thaliana’s AtCIPK 23, AtAKT 1 and AtCBL 1 genes, respectively. [Method] Hydroponics was used to explore the growth vigor, dry weight, potassium concentration and accumulation of transgenic cotton and CCRI 24 seedlings under low and optimum potassium conditions. Furthermore, the root morphology, potassium utilization index, potassium transport ability and the severity to damage were comprehensively analyzed to uncover the possible physiological mechanisms. [Result] Under the optimum conditions of potassium, the transgenic plants and control grew well and showed no significant difference. However, with low potassium stress, the dry weight of plants over-expressing AtAKT 1 gene was 1.66 times of CCRI 24. Its total root length, root surface area and volume were about 3 times than those of CCRI 24. The AtAKT 1 plants also displayed obvious growth advantage, higher potassium utilization index and transport ability, and the severity to damage was lower. Plants over-expressing AtCIPK 23 and AtCBL 1 genes, however, were almost the same as the CCRI 24. [Conclusion] This study revealed that the ability of cotton’s resistance to low potassium was significantly improved by over-expression of AtAKT 1 gene, an exogenous potassium ion channel protein gene from Arabidopsis thaliana.     

转Bt基因抗虫棉中棉所30的碳、氮代谢特征

本试验在田间条件下研究了转Bt基因抗虫棉中棉所30的碳、氮代谢特征,于各主要生育期测定了棉株地上部营养器官的全N、非蛋白质N和可溶性糖及淀粉含量.研究结果表明,与轮回亲本中棉所16相比,中棉所30苗蕾期的C/N较低,非蛋白质N含量较高,N代谢比较旺盛;初花期至盛花期的C/N则较高,C代谢明显加强;进入结铃早期,中棉所30叶片中可溶性糖、淀粉及营养体中非蛋白质N的含量均下降,反映出其"根源”和"叶源”的功能已减弱,表现出早衰迹象.为了改善转Bt基因抗虫棉中棉所30的生育状况,提高其产量和品质,"促源”是根本.     

抗虫棉外源Cry1A融合杀虫蛋白在土壤中的降解动态

 以转Bt基因棉GK12和转Bt+CpTI基因棉中棉所41为试验材料,以其亲本材料（泗棉3号、中棉所23）为对照,采用ELISA测定方法,研究了抗虫棉外源Bt杀虫蛋白在土壤中的降解动态。结果表明：在土壤掩埋条件下,转Bt 基因棉和转双价基因棉叶片中Bt杀虫蛋白的降解动态基本一致,降解周期达6个月;叶片掩埋后1～3个月,杀虫蛋白降解最迅速,4～6个月降解缓慢,第7个月已检测不到。不同生育期两者根系中Bt杀虫蛋白含量变化趋势基本一致,5月最高,6－9月迅速下降,10月至次年3月逐渐下降,至次年4月已检测不到。土壤中Bt杀虫蛋白的降解动态基本一致,两类抗虫棉播种前土壤中均检测不到Bt杀虫蛋白,苗期开始Bt杀虫蛋白的含量逐渐增加,至花期均达到最高峰,铃期以后逐渐下降。棉花收获后6个月内,两类抗虫棉田土壤中Bt杀虫蛋白含量迅速降低,到次年4月已检测不到。