挤压去核法和盲吸去核法在延边黄牛体细胞核移植中的对比研究

分别采用挤压去核法和盲吸去核法对延边黄牛卵母细胞进行去核处理,之后进行核移植,培养观察,比较两种去核方法对延边黄牛体细胞核移植效率的影响.挤压法的操作成功率和去核率明显高于盲吸法,盲吸法操作程序耗时比挤压法长,但是差异不显著.两种方法获得了相近的卵裂率和囊胚率,但挤压法构建的重组胚在囊胚数上高于盲吸法.挤压法在延边黄牛体细胞核移植上比盲吸法更有效.     

化学辅助去核法对延边黄牛卵母细胞去核率及其重构胚发育率的影响

为提高延边黄牛体细胞克隆的效率,采用化学辅助去核法--化学诱导剂脱羰秋水仙碱(Demeeoleine,简称Deme)处理体外成熟的MⅡ期延边黄牛卵母细胞,经显微操作构建重构胚后观察发育情况.试验研究了,Deme的处理浓度、作用时间对延边黄牛卵母细胞去核效果及其重构胚发育的影响.结果显示:体外成熟的卵母细胞在0.2μg/mL、0.3 μg/mL、0.4 μg/mL的Deme溶液中处理45 min,显核率与去核率无显著差异,去核率达100%,但是0.2 μg/mL处理组的囊胚发育率显著高于其他处理组;45 min处理组的显核率显著高于30 min、60 min处理组,45 min处理组的囊胚率高于其他处理组;化学辅助去核法的囊胚率显著高于盲吸法.化学辅助去核能够准确定位去除细胞核,并提高了延边黄牛体细胞克隆的去核率及重构胚的体外发育率.     

不同受体胞质对延边黄牛体细胞核移植效率的影响

为确定延边黄牛体细胞核移植过程中卵母细胞的最佳去核时期,本试验选取体外成熟22 h的中期(MⅡ期)卵母细胞与体外成熟28 h的末期(TⅡ期)卵母细胞进行化学辅助去核操作,并将去核的卵母细胞作为受体构建重构胚,后期观察发育情况.结果显示,M期卵母细胞的显核率与TⅡ期卵母细胞的显核率无显著差异;但是TⅡ期卵母细胞所得重构胚的卵裂率及囊胚率均显著高于MⅡ期卵母细胞所得重构胚的卵裂率及囊胚率.综上所述,卵母细胞体外成熟28 h后的TⅡ期可作为延边黄牛核移植去核操作的理想时期,在TⅡ期卵母细胞中选择化学辅助去核法去核能够提高延边黄牛体细胞克隆的效率.     

改进的末期去核方法解决延边黄牛卵母细胞第一极体残留问题

传统的末期去核方法仅仅去掉了第二极体及其附近少量的细胞质,第一极体仍然残留在卵母细胞中.本研究中,将末期去核方法进行了改进,即在去除第二极体及其附近少量胞质的同时去除第一极体.采用改进的末期去核法和传统的末期去核方法对延边黄牛卵母细胞进行去核操作,比较两种方法的去核率以及重组胚后期发育的整体效率.改进的末期去核法在去核率[(90.51±3.05)%]以及囊胚形成率[(8.78±2.38)%]上与传统的方法[分别为(87.00±1.82)%、(6.56±2.95)%]相似;传统的末期去核法在去核操作上耗时较长[(44.13±2.60)s],但在注核操作上用时略短于改进的末期去核法[(30.33±1.17)s];改进的末期去核方法所构建的重组胚异常发育率比传统的末期去核法低[(18.02±2.83)%],但差异不显著.改进的末期去核方法,去除第一、第二极体及其附近少量细胞质,可达到较高的去核率,并且支持发育到囊胚,同时解决了第一极体残留的问题.     

谷氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,试验研究了在培养液中添加一定浓度的谷氨酸对延边黄牛克隆重组胚发育的影响。选择成熟了20～22 h并且排出第一极体的卵母细胞进行去核与注核,然后进行体外培养,观察卵母细胞的卵裂以及囊胚发育情况。结果显示,低浓度的谷氨酸能够提高重组胚的卵裂率,高浓度则抑制卵母细胞的卵裂;而囊胚的发育方面,低浓度的谷氨酸会降低其发育率。所以,添加适量浓度的谷氨酸能够提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率。     

谷氨酰胺对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚发育率,研究了在体外培养液中添加不同浓度的谷氨酰胺对克隆重组胚发育率的影响.试验中选择成熟培养20～22 h的卵母细胞,脱颗粒细胞后选择排出第一极体的卵母细胞进行去核与注核操作,然后将融合、激活后的卵母细胞在添加不同浓度谷氨酰胺的体外培养液中进行培养.结果显示,体外培养液中添加浓度为1....     

精氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,试验研究了在体外培养液中添加不同浓度的精氨酸对重组胚发育的影响。选择形态良好排出第一极体的卵母细胞进行去核与注核操作,然后开始融合、激活,最后在添加不同浓度(0、0.061、0.132、0.264mmol/L)精氨酸的培养液中培养。结果发现,对照组与处理组之间重组胚的卵裂率和8-16C的发育率差异不显著,而囊胚的发育上,0.061mmol/L处理组显著高于对照组。表明体外培养液中添加精氨酸后能够促进体细胞克隆重组胚的发育。     

利用冷冻的GV期卵母细胞制备延边黄牛核移植胚胎的研究

研究使用玻璃化冷冻、程序化冷冻和超快速冷冻3种方法冷冻延边黄牛的卵母细胞,确定适宜的延边黄牛核移植受体卵母细胞的冷冻方法。结果显示,3种冷冻方法处理的GV期卵母细胞在成熟率上相似,玻璃化冷冻法得到的卵母细胞形态正常率要高于程序化冷冻和超快速冷冻法(P<0.05),超快速冷冻法回收率最低。采用玻璃化冷冻法,核移植重组胚卵裂率明显高于程序化冷冻和超快速冷冻法(P<0.05),在融合率上,3种方法差异不显著。表明玻璃化冷冻方法对延边黄牛GV期卵母细胞冷冻效果优于程序化冷冻和超快速冷冻方法,是一种较适合延边黄牛核移植的卵母细胞冷冻方法。     

共培养对延边黄牛重组胚体外发育的影响

以新鲜的颗粒细胞作为供核细胞,以延边黄牛MⅡ期去核的卵母细胞作为受体进行体外培养.使用CR1aa培养液培养时卵裂率(83.7%)显著高于TCM-199液和mSOF液组(76.9%和77.4%),但在重组胚的早期发育各阶段都不存在统计学差异(p>0.05).以CR1aa和TCM-199为基础液时,输卵管上皮细胞和颗粒细胞共培养在卵裂率及重组胚的各阶段发育率都有显著提高(p<0.05).结果表明:CR1aa培养液适用于延边黄牛重组胚的体外培养,以CR1aa液 输卵管上皮细胞和TCM-199液 颗粒细胞共培养的形式效果更好(p<0.05).     

小鼠卵母细胞去核方法的初步研究

[目的]寻求既简单又有效的提高小鼠卵母细胞去核率的方法。[方法]分别采用3种不同的方法(盲吸法、点击法、负压-点压法),研究对MII期小鼠卵母细胞去核率的影响。[结果]结果表明,采用负压-点压法去核,其卵母细胞的去核率可达62.8%,与其他两种方法所获得的去核率差异显著(P<0.05)。[结论]负压-点压法是一种简单、有效的小鼠卵母细胞去核方法。     

延边黄牛与韩延F1幼牛生长发育规律分析

通过对延边黄牛和韩延F1牛体重和体尺的对比,分析其生长发育规律,结果表明,韩延F1牛各月龄体重均高于延边黄牛;延边黄牛公、母牛体长的生长发育速度在8月龄左右快于体高,而韩延F1公、母牛的体长的生长发育在4月龄左右就已经快于体高;韩延F1公牛坐骨宽的发育也早于延边黄牛公牛,按性别来说,6月龄前母牛的后躯宽度(腰角宽、坐骨宽)生长强度较公牛大,6~18月龄公牛逐渐超过母牛.     

温度和乌苯苷对延边黄牛卵母细胞Na/K ATP酶活性的影响

通过研究温度和不同分级对延边黄牛卵母细胞Na/K ATP酶活性的影响,以及对其特异性抑制剂乌苯苷的敏感浓度,对延边黄牛卵母细胞Na/K ATP酶做初步探究,为进一步研究Na/K ATP酶活性与卵母细胞体外成熟的相关性打下良好基础.结果表明,延边黄牛卵母细胞的Na/K ATP酶活性在50℃达到最大值,在反应温度低于或高于50℃时酶的活性均降低,且在高于50℃时酶活急剧降低.乌苯苷浓度在2 mmol/L时孤雌卵母细胞完全停止卵裂.A级卵母细胞,裸卵和过成熟卵母细胞三者的Na/K ATP酶活性在统计学上差异不显著,但裸卵的Na/K ATP酶活性在数值上略高于其它两组.因此,延边黄牛卵母细胞的Na/K ATP酶的最适反应温度为50℃,其活力能够被2 mmol/L乌苯苷完全抑制,不同质量卵母细胞的Na/K ATP酶活性中,裸卵的Na/K ATP酶活性最高.     

延边黄牛体细胞克隆囊胚染色体标本制备的研究

[目的]探讨适合延边黄牛体细胞克隆胚胎染色体标本制备的方法。[方法]利用延边黄牛体细胞克隆产生的囊胚制备染色体标本,采用传统的细胞遗传学方法,将延边黄牛体细胞克隆囊胚分别在含有0.11、.0和10.0μg/ml浓度秋水仙素的CR1aa培养液中继续培养4或6 h,以使细胞分裂停留在中期。处理后的囊胚移入柠檬酸钠低渗液中,室温下处理15~20 min。将低渗后的单个胚胎转移至载玻片上,固定并用体积分数为25%的Giemsa溶液染色1~5 h,蒸馏水冲洗脱色,于室温干燥。显微镜下计算胚胎细胞数和有丝分裂指数以及标本制备质量。[结果]结果表明,1.0μg/ml秋水仙素处理6 h后的染色体标本制备效果较为理想。[结论]该研究为制备延边黄牛体细胞克隆囊胚染色体标本提供适宜的试验参数。     

延边黄牛肉与和延F1牛肉理化特性比较分析

对延边黄牛肉与和延F1牛肉的一般成分进行比较分析的结果表明,延边黄牛肉与和延F1牛肉相比,蛋白质含量高0．08％,脂肪含量低0．23％,灰分含量高0．27％,系水率低3．67％,熟肉率低1．93％,失水率高1．45％．和延F1牛肉剪切力值较延边黄牛肉低．     

延边黄牛哺乳母牛优化日粮对瘤胃内环境的影响

选择无流产史、无疾病,个体大小相近的安装永久性瘤胃瘘管的2头延边黄牛,采用自身对照设计法进行延边黄牛哺乳母牛优化日粮对其瘤胃内环境参数影响的研究.结果表明,pH值均在正常范围之内;饲喂优化日粮组总VFA、乙酸、丙酸、丁酸浓度明显高于对照组,且差异极显著(P<0.01);优化日粮的添加使得乙酸/丙酸值变小,但瘤胃发酵还是属于乙酸发酵型,对乳脂率无负影响.     

延边黄牛的微卫星遗传变异及DNA指纹分析

检测了8个群体184个个体,共检测到等位基因330个,各微卫星标记位点的多态信息含量(PIC)为0.536 7~0.886 1,同一标记位点在各群体间存在差异.各位点观察杂合度的变动范围为0.2~0.954 5,期望杂合度的变动范围为0.283 1~0.918.在HEL9和HEL51两个微卫星标记中,延边黄牛特有基因型的频率都达到了40%以上,因此,本实验所获得的微卫星DNA指纹数据对延边黄牛的品种鉴别有重要的参考价值.     

两层缝合法安装牛瘤胃瘘管

采用两层缝合法对4头延边黄牛进行了瘤胃瘘管安装术。试验牛均成功安装瘤胃瘘管,创口愈合良好,试验术式简单,有效缩短了手术时间,有利于后续试验的顺利进行。     

完全混合日粮对延边黄牛犊牛复胃发育的影响

为研究完全混合日粮（TMR）对犊牛复胃发育的影响,选取12头健康的延边黄牛公犊,随机分为对照组（常规饲养）和试验组（完全混合日粮）,于4月龄断奶时进行体重和复胃发育指标的测量。结果表明,饲喂完全混合日粮的处理显著提高了犊牛4月龄的断奶重、瘤胃平均容积、瘤胃平均重量、四胃平均重量、瘤胃乳头平均密度和瘤胃乳头平均长度（P〈0.05）;各项指标中,除网胃平均容积试验组略小于对照组外,试验组比对照组均有所提高,但两组之间差异均不显著（P〉0.05）。