偏肿革裥菌锰过氧化物酶的分级纯化

【目的】研究白腐菌偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)锰过氧化物酶(MnP)的分级纯化,以期得到L.gibbosa MnP的纯品和进行后续酶学性质研究。【方法】在对L.gibbosa所产MnPs进行优化培养、获得大量MnPs粗酶液的基础上,通过硫酸铵(NH4)2SO4分级盐析、聚乙二醇(PEG)沉淀进行粗酶液浓缩、在起始缓冲液中进行透析、经DEAE-琼脂糖CL-6B离子交换柱层析进行梯度洗脱和葡聚糖G-75凝胶过滤柱层析等方法对MnPs粗酶液进行纯化,并对分级纯化方法进行优化,对纯化浓缩后的纯酶样品采用SDS-PAGE方法进行酶纯度检验。【结果】在75%、80%和85%这3种(NH_4)_2SO_4饱和度中,85%的(NH_4)_2SO_4是沉淀MnPs的适宜饱和度,在该饱和度下测得上清液中酶活为3.63 U·L~(-1),蛋白浓度为0.132 mg·mL~(-1),表明MnPs已基本沉淀完全;试管小试法确定离子交换柱层析中上样的最适缓冲体系为pH7的Na_2HPO_4-NaH_2PO_4起始缓冲液;离子交换柱层析后收集的洗脱液检测到3个蛋白吸收峰,其中只在第2个蛋白吸收峰中检测出MnP活性,该MnP活性值变化曲线与蛋白吸光值一致。这个活性峰经凝胶过滤柱层析后,洗脱结果只出现1个明显的蛋白吸收峰,在其中检测出较高的MnP活性;浓缩后的冻干样品经SDS-PAGE电泳检测只在约40 k Da处有1条清晰的蛋白谱带,表明对MnP的纯化已达到电泳纯。【结论】筛选出85%饱和度的(NH_4)2_SO_4盐析法是初期沉淀与纯化L.gibbosa所产MnPs的最适方法;PEG浓缩法简便、易行、有效;初期浓缩后再经过离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析可以得到电泳纯的MnP纯化样品。     

猴头菌菌株CB1的系统发育分析与木质素降解酶的检测

首先对猴头菌菌株CBI进行培养特性观察,表明菌株能产生较多的厚垣孢子;对其ITS序列进行扩增(GenBank登录号为GU584100),并与猴头菌属5个种的17个不同地域菌株进行基于ITS序列的系统发育分析,结果表明菌株CB1与猴头菌同种其他菌株遗传距离较近并聚类在一起.明确该菌株的分类地位后,对其进行木质素降解酶系统的检测,结果表明猴头菌可产生锰过氧化物酶(MnP)和漆酶(laccase),但不产生木质素过氧化物酶(LiP).MnP和漆酶的酶活性变化是有规律的,Mn2是猴头菌产生MnP的必要因子,而漆酶的产生则不受该条件的制约.在含Mn2+的LNAS培养基中加入木屑为底物的条件下,猴头菌MnP最大酶活性为45.56 U·L-1,漆酶最大酶活性为61.85 U·L-1.     

灰树花的系统发育分析和主要木质素降解酶的测定

对灰树花菌株迁西二号进行了ITS序列扩增与测序(GenBank登录号为GU584099),并对灰树花及相关白腐菌进行了基于ITS序列的系统发育分析,结果表明灰树花与Grifola sordulenta (Mont.) Singer等白腐菌的亲缘关系较近。采用LNAS(低氮天冬酰胺-琥珀酸)培养基添加4种不同底物,对菌株迁西二号在25 ℃恒温下静置培养,得到了不同时间内的培养液,用紫外可见分光光度计分别检测了在470 、420 、310 nm处对于2,6-二甲氧基苯酚 (2,6-DMP)、2,2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)、3,4-二甲氧基苯甲醇/藜芦醇(VA)的氧化作用后光密度值的变化情况,作为锰过氧化物酶(MnP)、漆酶(Laccase)和木质素过氧化物酶(LiP)产生和活性大小的依据,从而获得了灰树花木质素降解酶系统的主要酶系及其与培养基的成分和酶作用底物的基本关系。结果表明,灰树花可产生MnP和漆酶,但不产生LiP;对比4种成分不同的培养液酶活力测定结果,未添加底物的培养液MnP最大酶活仅为2.96 U·L^-1,漆酶最大酶活仅为4.49 U·L^-1。添加底物木屑和2,6-DMP后MnP最大酶活为8.06 U·L^-1,漆酶最大酶活为9.85 U·L^-1,表明在培养液内添加酶的底物木屑后能轻微地提高两种酶的分泌量。     

几株半知菌对马尾松落叶的分解——木质纤维素酶的活性动力学

应用固体发酵方法,研究Alternaria sp., Penicillium sp., Cephalosporium sp., Tricherderma sp., Pestalotiopsis sp.和Aspergillus fumigatus 6种土壤半知菌降解马尾松凋落叶片过程中产生的漆酶(Laccase)、木质素过氧化物酶 (LiP)、锰过氧化物酶 (MnP)、羧甲基纤维素酶 (CMCase) 和滤纸糖酶 (FPA)的动力学曲线,以及各种酶活性与底物降解的关系.结果表明:Pestalotiopsis sp. 能够产生相对较高的漆酶活性和引起底物的总有机物质(TOM)质量损失最大;Alternaria sp. 产生的MnP酶活性最高;Pestalotiopsis sp. 产生的CMCase和FPA酶活性也为最高.试验中6种菌前期的降解速率依赖于CMCase 和 FPA酶活性的高低,后期则由木质素酶和纤维素酶协同作用来决定.依据6种菌的酶生产动力学曲线、TOM 质量损失和降解速率,可将其划分为2种功能类型:功能群Ⅰ为纤维素分解菌,包括Alternaria sp., Penicillium sp., Cephalosporium sp.和Tricherderma sp. 4种;功能群Ⅱ为木质纤维素分解菌,包括 Pestalotiopsis sp.和Aspergillus fumigatus 2种.试验中也发现:Pestalotiopsis sp.产生漆酶的活性较高,同时是一株比较有效降解木质纤维素底物的菌种.     

白腐菌糙皮侧尔漆酶性质及其对蒽醌染料脱色性能的研究

白腐菌糙皮侧尔(Pleurotus ostreatus strain 3.42)分泌胞外漆酶，但未发现分泌木质素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP)、每升反应液以0．5mmol 2，2′-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)和0．1mmol的Cu^2 为诱导剂可明显提高漆酶酶活，酶活分别可达1000和800U／mL。与其它真菌漆酶相比，该酶最适反应pH值为3．5，在pH值4．0～6．0之间酶活性稳定；最适反应温度为65℃，在醋酸缓冲液(pH值5．0)中，反应温度低于50℃时，漆酶非常稳定；该酶对对-甲氧基酚的氧化速度要快于邻-甲氧基酚。叠氮化钠对该漆酶有强烈的抑制作用。蒽醌染料活性艳蓝KN-R(RBBR)可被该漆酶(30U／mL)直接脱色，12h脱色率为70％；添加小分子的介体物质ABTS(5μmol／L)，可使染料完全脱色。     

偏肿栓菌产锰过氧化物酶条件优化

采用LNAS(低氮天冬酰胺-琥珀酸)培养基用4种不同的底物处理方式,对白腐菌偏肿栓菌在28℃下进行静止培养,得到不同时间内的培养液,用紫外可见分光光度计分别检测在470,420,310nm处对于2,6-二甲氧基苯酚(2,6-DMP)、2,2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)、藜芦醇(VA)的氧化作用后光密度值的变化情况,作为其木质素降解酶系统锰过氧化物酶(MnP)、漆酶和木质素过氧化物酶(LiP)产生的依据。结果表明:偏肿栓菌可产生MnP(必须在Mn2+存在的条件下)和漆酶(不依赖于Mn2+),但不产生LiP;在培养液内添加底物木屑和2,6-DMP后可显著提高2种酶的分泌量。在此基础上,用含Mn2+和青杨木屑的LNAS培养基对偏肿栓菌在30℃下静止培养作为初始培养条件,然后采用2次正交试验和多种单因素试验对偏肿栓菌产MnP的培养基组分和培养条件进行优化。结果表明:在试验设定的因素和水平范围内的最优组合是培养液果糖浓度为5g.L-1、酒石酸铵浓度为15mmol.L-1、锰离子浓度是200μmol.L-1、吐温-80浓度为0.25mL.L-1,MgSO4.7H2O浓度为0.35g.L-1、矿质...     

自带介质血红密孔菌NFZH-1的鉴定及其木质素降解特性

菌株自带介质可提高其漆酶降解木质素能力,因此自带介质高产漆酶菌株的筛选、鉴定对漆酶的商业应用将起到促进作用。从南京山林地区分离出两株血红密孔菌NFZH-1和NFZH-2,并以杂色云芝为对照,研究了两株血红密孔菌发酵产漆酶和木质素降解特性。首先通过形态学特性鉴定了NFZH-1为自带介质血红密孔菌。其次以愈创木酚为反应底物,平板接种菌株,培养5天,NFZH-1颜色圈较菌丝圈大,且颜色最深;经10天固态发酵,NFZH-1所产漆酶酶活高达23600 U/g,且未检测出木质素过氧化物酶( LiP)和锰过氧化物酶( MnP)。平板显色和固态发酵产酶结果表明自带介质血红密孔菌NFZH-1为漆酶高产菌株。麦草粉经菌株 NFZH-130天降解,木质素降解率、综纤维素降解率分别达56.7%和36.6%,表明血红密孔菌NFZH-1为选择性高木质素降解活性菌株。     

自带介质血红密孔菌NFZH-1的鉴定及其木质素降解特性（英文）

菌株自带介质可提高其漆酶降解木质素能力,因此自带介质高产漆酶菌株的筛选、鉴定对漆酶的商业应用将起到促进作用。从南京山林地区分离出两株血红密孔菌NFZH-1和NFZH-2,并以杂色云芝为对照,研究了两株血红密孔菌发酵产漆酶和木质素降解特性。首先通过形态学特性鉴定了NFZH-1为自带介质血红密孔菌。其次以愈创木酚为反应底物,平板接种菌株,培养5天,NFZH-1颜色圈较菌丝圈大,且颜色最深;经10天固态发酵,NFZH-1所产漆酶酶活高达23 600 U/g,且未检测出木质素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP)。平板显色和固态发酵产酶结果表明自带介质血红密孔菌NFZH-1为漆酶高产菌株。麦草粉经菌株NFZH-1 30天降解,木质素降解率、综纤维素降解率分别达56.7%和36.6%,表明血红密孔菌NFZH-1为选择性高木质素降解活性菌株。     

偏肿革裥菌锰过氧化物酶酶学性质和染料脱色

【目的】研究白腐菌偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)所产锰过氧化物酶(MnP)纯酶的序列特征、酶学性质及其对染料的脱色能力,为其应用于木质素降解、染料脱色奠定基础。【方法】将纯化后的样品经SDS-PAGE检测后获得的唯一L.gibbosa MnP条带切割,采用Nano液相色谱-电喷雾串联质谱法联用(Nano LC-ESI-MS/MS)多肽测序技术对蛋白氨基酸序列进行测定。利用该SDS-PAGE图谱,建立蛋白分子量与迁移率的标准直线,从标准直线上求出MnP纯酶样品的表观分子量;参照酶活测定方法检测最适反应温度及温度稳定性、最适反应p H值及p H稳定性;采用lineweaver-Burk双倒数作图法求解米氏动力学常数Km值。研究L.gibbosa菌种培养液和MnP纯酶液对蒽醌类的茜素红、偶氮类的刚果红、杂环类的中性红和三苯基甲烷类的结晶紫等4种不同类型染料的脱色能力。【结果】串联质谱扫描出2条MnP的保守序列肽段,与克隆到的基因Lg-mnp1编码的Lg-MnP1(Gen Bank登录号:ACO92620)序列完全吻合,表明其所代表的酶蛋白Lg-MnP1就是唯一电泳带中主要的蛋白。Lg-MnP1的表观分子量为45.39 k Da,最适反应温度为35℃,在低于40℃的条件下都具有一定的催化能力,但温度超过50℃后迅速失活;其最适反应pH值为3.5,p H超过4.5反应程度就迅速下降,在p H为2~3时最稳定;在以2,6-DMP为底物时,在21℃条件下其米氏常数Km为6.124 mmol·L~(-1)。L.gibbosa培养液对染料在1 h的脱色率分别为茜素红100%、中性红22.17%、刚果红19.09%,对结晶紫的脱色率很低,在36 h脱色率仅为0.018%。纯化后的Lg-MnP1溶液对染料的最大脱色率在2 h分别为中性红100%、刚果红95.55%、茜素红75.85%和结晶紫36.57%。【结论】SDS-PAGE得到的唯一一条电泳带中的MnP是Lg-MnP1。Lg-MnP1是一种中温性、偏酸性的酶,与2,6-DMP的亲和力较大。L.gibbosa含有菌丝的培养液对茜素红具有彻底的降解效果,但Lg-MnP1纯酶液对中性红、刚果红和结晶紫的降解效率要远高于同时含有菌丝、漆酶和MnPs的培养液。     

构巢曲霉转化子菌株产MnP条件优化及对3种染料的脱色

【目的】对转入猴头菌MnP1和MnP2基因的2个构巢曲霉转化子菌株TN02A7-He-mnp1和TN02A7-Hemnp2产MnP的初始培养条件进行优化,然后用优化后的酶液对3种染料进行脱色研究,以期提高锰过氧化物酶(MnP)活性。【方法】采用单因素试验进行最适产酶温度的筛选;正交试验检测血红素浓度、Mn~(2+)浓度、pH值和转速4个因素在3个水平下对酶活性的影响,并通过优化培养验证试验检测酶活性;吸光度法检测优化后的酶液对3种染料的脱色率。【结果】菌株TN02A7-He-mnp1产TN02A7-He-MnP1最适培养条件为:在MMPGRT培养基的基础上,加入2 g青杨木屑作为产酶底物,Mn~(2+)浓度为267μmol·L~(-1)、氯化血红素浓度为0.05 g·L~(-1)、培养液pH值为7.5,100 mL三角瓶中装液量为50 mL、接入2个φ=10 mm的菌块,于37℃、180 r·min~(-1)的摇床中培养120 h;菌株TN02A7-He-mnp2产TN02A7-He-MnP2最适培养条件与TN02A7-He-mnp1相似,只是氯化血红素溶液浓度为0.03 g·L~(-1),摇床转速为220 r·min~(-1),其他条件相同。在上述最适培养条件下,2个构巢曲霉转化子菌株产TN02A7-He-MnP1和TN02A7-He-MnP2的酶活性分别为133.62和147.09 U·L~(-1),是初始培养条件的2.89和3.46倍。染料脱色试验表明,2个菌株对杂环类染料中性红和偶氮类染料刚果红在4 h内达到58%以上的脱色率,16 h对中性红达到或接近100%,20 h对刚果红达到或接近100%。【结论】通过优化培养基成分与条件可以提高2个构巢曲霉转化子菌株MnP的产酶量,2个菌株对中性红和刚果红都有高效的脱色作用。