PRRS吉林株GP5基因序列测定与分析

PRRSV易引起基因变异现象,使得异地疫苗不能有效地控制本地区PRRS的发生。为研制适合本地区的亚单位疫苗,试验参照GeneBank中已发表的PRRSV序列设计了1对特异性引物,对吉林分离株JL-0605对GP5基因进行了序列扩增和测序,序列分析结果表明,PRRSV JL-0605株GP5氨基酸序列与CH-1α和HEB1株氨基酸序列高度一致,而与VR-2332和BJ-4株有一定的差异,和LV株在N端及中心区具有很大的差异,JL-0605株GP5蛋白抗原性及亲水性与中国河北株具有较高的相似性;与VR-2332株相比,30～40位氨基酸处抗原表位形态发生较大变化,在135～145位氨基酸处抗原表位优势增强现象。     

PRRS吉林株M基因序列测定与分析

为研制安全有效的适合预防吉林地区PRRS的亚单位疫苗,利用吉林地区PRRS病猪肺脏中分离获得的PRRSV JL-0605病毒株,参照GeneBank中已发表的PRRSV序列设计1对特异性引物,克隆M蛋白基因,根据M蛋白基因序列和推导的氨基酸序列进行同源性、系统进化树、疏水域及抗原表位的分析。结果表明,PRRSV JL-0605株的M蛋白氨基酸序列与CH-1α和HEB1株高度一致,而与VR-2332和BJ-4株有一定的差异,和LV株在N端及中心区具有很大的差异,JL-0605株M蛋白抗原性及亲水性与中国河北株具有较高的相似性;JL-0605株与VR-2332株相比在60位处抗原表位优势减弱。本研究为PRRS M蛋白和基因的深入研究及开发利用提供科学依据。     

猪繁殖与呼吸系统综合征病毒华南株GDgz 的分离鉴定及遗传进化分析

为了解华南地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株的变异特性,用Marc-145细胞从广东省疑似猪繁殖与呼吸综合征发病猪场采集的肺组织中分离得到1株PRRSV(命名为GDgz),该毒株能产生明显的细胞病变。全基因组进化分析和同源性比对分析结果显示,GDgz与中国高致病性毒株位于同一分支,与欧洲型毒株Lelystad-virus同源性最低、仅为60.3%,与美洲型经典毒株VR-2332的同源性为88.8%,与中国高致病性毒株JXA1和HuN4同源性为98.8% 和98.9%,与JXA1的疫苗株同源性为91.1%,与NADC30和NADC30-like毒株 CHsx1401和JL580同源性分别为84.5%、87.2%和83.6%。NSP2序列比对结果显示,GDgz在高变区存在30个不连续氨基酸缺失。GP5序列比对结果显示,GDgz在GP5抗原表位上有氨基酸突变,表明GDgz属于美洲型高致病性毒株传代致弱的疫苗株,且在抗原表位上有一定程度的突变。     

PRRSV辽宁分离株ORF3基因的克隆与序列分析

以辽宁地区某猪场猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病料为材料,采用RT-PCR方法特异性扩增编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白的ORF3基因全长cDNA,结果该分离株ORF3基因cDNA编码区长765bp,可编码254个氨基酸残基,与美洲型代表株VR-2332和欧洲型代表株LV进行同源性比较,氨基酸同源性分别为87.8%和54.5%,因此推测辽宁分离株属于美洲型。     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒延边地区地方株的分离鉴定

为弄清猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)发病机理及研制PRRSV本地弱毒疫苗和基因工程疫苗,预防和控制PRRS的发生,进行了PRRSV病毒本地株分离试验.采用细胞分离培养、理化特性与血液凝集试验等方法,成功分离了1株PRRSV,命名为YB-0605株.PRRSV的结构蛋白GP4、GP5和M都能刺激机体产生免疫应答,在机体的抗病毒免疫中发挥不同的作用.研究结果为PRRS流行病学丰富了数据库,同时为研究PRRSV变异规律提供了有益的参考数据.     

高致病性PRRSV TJ株和致弱毒TJM株Nsp2测序及结构分析

参照GenBank中PRRSV VR-2332株全序列设计特异性引物,扩增高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)TJ株和其致弱毒株TJM株非结构蛋白2(Nonstructure protein 2,Nsp2)编...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GS株结构蛋白基因的克隆及结构特征分析

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332毒株基因序列设计合成了6对引物,应用RT-PCR方法对PRRSVGS株部分片段进行基因的扩增、克隆和测序,将测序结果应用Blast和DNAStar软件进行拼接,并与国内外分离毒株进行核苷酸以及推导氨基酸序列同源性比较.结果发现PRRSVGS毒株结构蛋白基因全长3819bp,包括ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7共6个阅读框,分别编码GP2、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白;与BJ-4、CH-1a、HB-2(sh)/2002和VR-2332美洲株等核苷酸的同源性在87.9%～97.1%,推导的氨基酸同源性在88.3%～97.1%;而与LV和Euro毒株的同源性差异显著,核苷酸同源性在56.0%～70.0%,氨基酸同源性在54.9%～77.6%.构建的系统发育树证明该毒株在基因型上属于美洲型.     

一株湖北HP-PRRSV分离株nsp2基因遗传变异分析

为了解湖北地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异情况和分子流行病学情况,从湖北地区某猪场采集疑似病料进行处理,接种Marc-145细胞,待细胞发生病变后收获病毒,提取病毒总RNA,应用RT-PCR法对PRRSV nsp2部分基因进行扩增,经序列测定,并与美洲株VR-2332、欧洲株Lelystad virus及国内各PRRSV分离株进行核苷酸及其推导的氨基酸进行同源性比较,并绘制系统进化树。结果表明,经RT-PCR扩增获得了PRRSV湖北分离株(命名为HDZZ1)的nsp2基因,核苷酸序列分析显示,获得的nsp2核苷酸与VR-2332的同源性为77. 7%,与Lelystad virus的同源性为44. 3%。其氨基酸与VR-2332的同源性为64. 58%,与Lelystad virus的同源性为13. 93%。证明所获得PRRSV仍为美洲型。与我国分离的高致病性PRRSV毒株07BJ、BJ0708、GD、GDYC、HEB1、Henan-1、HN-HW、HPBEDV、HUB1、HUN4、JXA1、SX-1、SX2009核苷酸同源性高达97. 3%~98. 8%,氨基酸同源性为96. 40%~98. 8%,氨基酸序列分析结果显示,Nsp2蛋白在222位和274-302位两处出现了30个氨基酸的不连续缺失,其Nsp2蛋白的抗原表位发生了改变。系统发生树结果表明,HDZZ1株与高致病性PRRSV毒株位于同一大分支中,与欧洲代表株(Lv)、美国NADC30株和国内NADC30-like HNjz15株处于不同分支中。由此断定,HDZZ1毒株为高致病性PRRSV毒株。     

两株高致病性PRRSV河南分离株ORF5基因克隆及遗传变异分析

从河南信阳和新乡两地区猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征病料中分离出能引起Marc145细胞病变的病毒,命名为HN1和HN2。采用RT-PCR方法从分离的2株PRRSV中均分别扩增出ORF5基因,并将其克隆、测序。用DNAStar软件分析所测序列,并与北美洲型VR-2332株及国内分离株进行核苷酸和推导的氨基酸同源性比较,绘制系统进化树,结果表明,ORF 5核苷酸与北美洲型的同源性为81.2%～99.1%,与欧洲型Lv株的同源性分别为35.9%和35.3%,推导氨基酸与北美洲型的同源性为84.5%～99.5%,与欧洲型Lv株的同源性分别为46.0%和45.5%。证明新分离到的PRRSV毒株仍属北美洲型。与国内分离的高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB1、JX0612、GDZC1、ZQ、SX-1、HB1、HEB1、Hnyz核苷酸同源性达96.5%～99.1%,氨基酸同源性为96.0%～99.5%。分析结果表明,所获得的2个毒株GP5蛋白氨基酸序列中的抗原表位已经发生变异。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株的遗传变异分析

用间接免疫荧光试验和RT-PCR方法,从河南省不同地区送检的疑似猪繁殖与呼吸综合征的病料中分离到16株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),扩增分离株的ORF5基因并进行序列测定、比较分析和绘制进化树.结果表明,16株分离株之间的氨基酸序列同源性为88.1%～99.8%;与欧洲型LV株和美洲型VR-2332株的氨基酸序列同源性分别为54.0%～54.5%和88.1%～99.2%,证明分离的16株病毒均为美洲型.用DNAstar等软件对16株分离株推导的氨基酸序列作进一步比较分析,发现16株分离株ORF5基因编码的gp5蛋白的抗原区、潜在疏水区、跨膜区和N-糖基化位点分布均有差异,与其它美洲型毒株也存在一定程度的差异,说明在河南流行的PRRSV存在明显的遗传差异性.     

猪繁殖与呼吸综合症病毒分离株ORF5和Nsp2基因的序列分析

根据美洲型猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)基因组序列设计2对引物,对疑似PRRSV感染猪的病料进行RT-PCR检测,核酸检测阳性病料进行PRRSV分离,获得了1株美洲型PRRSV,命名为GD08-2.对PRRSV GD08-2株、GD-XH株、GD08-1株的ORF5基因和部分Nsp2基因进行序列测定与分析.结果表明,GD08-2株的ORF5基因与PRRSV疫苗株pMLV、经典株VR-2332和GD-XH株的相似性较高,而与GD08-1株的相似性较低.GD08-2株的Nsp2基因推导的氨基酸序列出现12个氨基酸的不连续缺失,分别位于66~74位和192~194位,由此推测,GD08-2株可能为PRRSV的突变株.GD08-1株的ORF5基因与国内分离的高致病性PRRSV相似性较高,其Nsp2基因推导的氨基酸序列存在30个氨基酸的缺失,与国内高致病性PRRSV分离株JXA1的缺失位置完全一致,由此推测,GD08-1株属于高致病性PRRSV;GD-XH株的ORF5基因与疫苗株pMLV的相似性较高,其Nsp2基因存在个别核苷酸的点缺失.遗传进化分析表明,GD08-1株与国内分离的高致病性PRRSV的遗传进化关系较近,属同一分支;GD-XH株和GD08-2株与PRRSV经典株VR-2332、疫苗株pMLV的遗传关系较近,属另一分支.     

猪繁殖与呼吸综合症流行株ORF_5基因遗传变异分析

[目的]分析猪繁殖与呼吸综合症发病原因,流行趋势,为预防和控制猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）提供理论依据。[方法]根据GenBank上的PRRSV的ATCCVR-2332的全基因序列,设计并合成引物,采用RT-PCR技术扩增了7株流行株中的ORF5基因序列。应用DNAStar软件分析所测序列,并与ATCCVR-2332、CH-1a、BJ-4、LV及疫苗株MLV进行序列比较。同时用系统进化树分析了分离株之间的系统进化树。[结果]核苷酸序列分析表明这7株流行株中ORF5基因与VR-2332、CH-1a、BJ-4等代表株的同源性分别为88.1%～98.8%,89.9%～95.2%,85.6%～98.7%;与LV的同源性为54.7%～56.9%。氨基酸序列分析表明,这7株流行株与VR-2332、CH-1a、BJ-4等代表株的同源性分别为88.1%～96.8%,88.1%～94.5%,86.1%～96.5%;与LV的同源性为54.7%～56.2%。[结论]流行株在ORF5基因区域的变异较大,同一地域分离株间ORF5基因序列同源性较高且亲缘关系较近,不同地域则较远。     

华北地区猪繁殖与呼吸综合征病毒变异分析

为了解华北地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异情况,通过对2014—2016年从河南、河北、山东、山西4省采集的疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病料进行检测,将扩增得到的PRRS阳性样品的ORF5基因进行测序,分析华北地区2014—2016年PRRSV的变异情况。结果表明,2014—2016年华北地区流行毒株与国内外代表性毒株核苷酸同源性在84.6%~99.8%;抗原位点比对结果显示,变异株中和表位第37—44位氨基酸为SH(I/L/F)QLIY(N/K),诱骗表位27—30位氨基酸为(V/A)L(V/A)N;系统进化树分析表明,以CH-1a为代表的变异株、以VR-2332为代表的经典毒株以及NADC30毒株在华北地区同时存在。可见,华北地区PRRSV流行情况复杂。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株GP5基因的克隆及在293T细胞中表达

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ATCC VR-2332株GP5基因序列设计1对特异性引物,应用RT—PCR方法扩增PRRSVHn／06-1分离株GP5基因片段．将扩增片段克隆到真核表达载体pcDNA3．0中,测序后用DNAstar序列分析,构建的pcDNA—GP5重组质粒瞬时转染293T细胞,48h后用Western-blot检测。证明GP5基因在293T细胞中获得了表达,可与PRRSV阳性血清发生特异性反应．     

1株PRRSV类NADC30毒株的分离鉴定及序列分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株的变异情况,将PRRSV阳性病料处理后接种Marc-145细胞,成功分离到1株PRRSV毒株,将其命名为HENZXC-4,并对其全基因组序列进行测定和分析。结果表明,HENZXC-4为未发生重组的类NADC30毒株,其NSP2蛋白存在131个氨基酸不连续缺失,且其GP5蛋白存在1个氨基酸插入。     

猪繁殖与呼吸综合征流行株ORF5基因遗传变异分析

[目的]分析猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）发病原因、流行趋势,为预防和控制PRRSV提供理论依据。[方法]根据GenBank上的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ATCCVR-2332的全基因序列,设计并合成引物,采用RT—PCR技术扩增了7株流行株（HIJ10,HL148,HLJ64,HLJ76,HL177,HLJ85,HLJ87）中的ORF5基因序列。应用DNAStar软件分析所测序列,并与ATCCVR-2332、CH-1a、BJ-4、LV及疫苗株MLV进行序列比较。同时用系统进化树分析了分离株之间的亲缘关系。[结果]核苷酸序列分析表明这7株流行株中ORF5基因与VR-2332、CH—1a、BJ-4等代表株的同源性分别为88．1％～98．8％,89．9％～95．2％,85．6％～98．7％;与LV的同源性为54．7％～56．9％。氨基酸序列分析表明这7株流行株与VR-2332、CH-1a、BJ4等代表株的同源性分别为88．1％～96．8％,88．1％～94．5％,86．1％～96．5％;与LV的同源性为54．7％～56．2％。通过系统发育进化树分析可知HLJ48、HL164、HLU6、HLJ77、HLJ85与CH-1株亲缘关系密切,同属一亚群,表明所获得的毒株与参考株CH．1亲缘关系较近,可能由CH-1演化而来。HLJ10、HU87与疫苗株MLV关系较近,而且HLJ10、HLJ87的同源性高达100％,可能由于使用疫苗而感染,说明黑龙江省存在疫苗毒的隐性感染。[结论]流行株在ORF,基因区域的变异较大,同一地域分离株间ORF,基因序列同源性较高且亲缘关系较近,不同地域则较远。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株GP5基因的遗传变异与系统进化分析

为进一步了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在国内的分子遗传进化情况,对中国大陆1996～2008年间33株PRRSV分离毒株(29株来自GenBank)的GP5序列与国外部分代表毒株进行了分析比较.结果表明,所选PRRSV中国分离毒株中有32株属于北美洲型(NA),并大致可分为2个基因亚群,1株属于欧洲型(EU).其中,自2006年在我国暴发的高致病性蓝耳病病毒(H-PRRsV)属于亚群1,且与YA株亲缘关系较近;亚群2毒株则与Ingelvac的弱毒疫苗株及其亲本株VR-2332具有较高的同源性.     

新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定及Nsp2和ORF5基因遗传变异分析

为探索新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异特征,利用RT-PCR、ORF5和部分NSP2基因序列进行分析,鉴定从新疆某猪场疑似猪高热病死亡猪肺脏分离出的一株病毒.分离的病毒株被鉴定为PRRSV美洲型,命名为XJ-Q株.该株病毒与香港分离株HK13亲缘关系最近,与国内变异株(HUB1和JXA1)同源性较为亲近.与美洲型标准毒株VR-2332相比,该分离株在481位和532～560位共有30个氨基酸缺失;与国内分离的PRRSV变异株相比,在487～489位有3个氨基酸的独特缺失.结果表明,新疆分离株为PRRSV美洲型,属于新缺失的PRRSV毒株.     

新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定及Nsp2和ORF5基因遗传变异分析

为探索新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的变异特征,利用RT-PCR、ORF5 和部分NSP2 基因序列进行分析,鉴定从新疆某猪场疑似猪高热病死亡猪肺脏分离出的一株病毒。分离的病毒株被鉴定为PRRSV 美洲型,命名为XJ-Q 株。该株病毒与香港分离株HK13 亲缘关系最近,与国内变异株（HUB1 和JXA1）同源性较为亲近。与美洲型标准毒株VR-2332 相比,该分离株在481 位和532~560 位共有30 个氨基酸缺失;与国内分离的PRRSV 变异株相比,在487~489 位有3 个氨基酸的独特缺失。结果表明,新疆分离株为PRRSV 美洲型,属于新缺失的PRRSV毒株。     

中国部分地区2005－2007年猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株ORF5基因和Nsp2基因遗传变异分析

 【目的】为分析2005－2007年间中国部分省区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行毒株的分子生物学特征,了解其遗传演化规律,查明中国目前PRRSV流行毒株现状。【方法】应用病毒分离方法从中国4个省份在2005－2007年间采集的81份疑似蓝耳病病料中分离到36株猪繁殖与呼吸综合征病毒,应用RT-PCR方法对36株PRRSV现地分离株的ORF5基因和Nsp2基因进行扩增和序列分析。【结果】36株现地分离株均属于美洲型 PRRSV,ORF5基因全长均为603 bp,未发现有基因缺失或插入,编码约200个氨基酸,分离株推导氨基酸序列变异主要发生在9～39位;36个分离株中有15株PRRSV Nsp2基因全长为2 940 bp,21株PRRSV Nsp2基因全长为2 850 bp;发生Nsp2缺失的PRRSV在Nsp2基因第481位、532～560位发生了不连续缺失,共缺失30个氨基酸。与GeneBank中收录的14个PRRSV ORF5、Nsp2基因进行核苷酸及氨基酸序列比较和分析,系统进化关系显示,除B02-2005株可能与疫苗株有关外,多数现地分离株与Ch-1a株遗传距离较近,不同年份分离到的毒株与早期PRRSV分离株的同源性逐年降低。【结论】根据氨基酸变异情况对PRRSV现地分离株进行亚群聚类分析,发现36株现地分离株分别归属于以VR-2332为代表的4亚群,以BJ-4为代表的1亚群和以Ch-1a为代表的２亚群。进化关系表明PRRSV ORF5、Nsp2基因及其推导的氨基酸序列均发生了较大变异,不同地区PRRSV分离株的遗传关系存在交叉现象,地域特征不明显。