猪Myl1基因启动子克隆及多态性研究

肌球蛋白轻链1基因(Myl1)编码的不同剪切体(主要是MLC1f和MLC3f)与哺乳动物骨骼肌肌纤维类型相关.通过猪BAC文库筛选及引物步行法测序获得Myl1基因的启动子序列,采用PCR-RFLP技术分析蓝塘猪、大花白猪、大白猪、长白猪和杜洛克猪5个品种Myl1基因启动子区的多态性.结果表明,Myl1基因-678C/T位点在蓝塘和大花白等本地猪种中多态性丰富,而在杜洛克、长白和大白等外来猪种中几乎只有CC基因型.     

牛MYOZ1基因启动子活性分析

【目的】鉴定牛MYOZ1基因转录起始位点,确定牛MYOZ1基因核心启动子区域,为进一步研究牛MYOZ1基因的转录调控机制奠定基础。【方法】以秦川牛肌肉5′RACE准备cDNA为模板,设计5′RACE扩增试验,确定牛MYOZ1基因转录起始位点。以秦川牛外周血基因组DNA为模板,通过PCR克隆获得牛MYOZ1基因转录调控区-1 628/+61目的片段。通过生物信息学分析软件预测可能包含的转录因子结合位点,设计逐段缺失引物,获得7个亚克隆,将其分别与pGL3-Basic载体连接,得到牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,通过脂质体法转染C2C12细胞系,检测7个重组质粒的荧光素酶活性,分析启动子活性。【结果】确定了牛MYOZ1基因的转录起始位点,成功克隆获得7个系列缺失的牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒:pMYOZ1-1 628/+61、pMYOZ1-1 430/+61、pMYOZ1-1 179/+61、pMYOZ1-932/+61、pMYOZ1-676/+61、pMYOZ1-437/+61和pMYOZ1-116/+61,其中重组质粒pMYOZ1-116/+61启动子活性极显著高于pGL3-Basic,推测牛MYOZ1基因-116/+61区域可能包含核心启动子;重组质粒pMYOZ1-1 628/+61启动子活性极显著高于pMYOZ1-1 430/+61片段活性(P0.01),表明牛MYOZ1基因启动子区域-1 628/-1 430片段可能包含启动子活性增强元件。生物信息学分析发现,牛MYOZ1基因启动子-116/+61片段可能包含SP1、GC Box、CAAT等多个重要转录因子结合位点;-1 628/-1 430片段可能包含SP1、MyoD等多个重要转录因子结合位点。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且初步确定了牛MYOZ1基因的核心启动子区域位于-116/+61。     

猪HIF-1α基因启动子区及编码区的生物信息学分析

利用生物信息学方法,对NCBI中公布的猪缺氧诱导因子HIF-1α基因的5′端上游2 000 bp长度的候选启动子区进行了核心启动子及转录结合位点的预测;同时对其所编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、跨膜结构域、信号肽、高级结构及进化关系进行了分析。结果显示：猪HIF-1α基因5′端上游存在潜在启动子区,存在CpG岛,存在多个转录因子结合位点,编码的蛋白为亲水性蛋白;蛋白质等电点为5.11,共由824个氨基酸组成,含量最高的为亮氨酸。HIF-1α蛋白主要定位于细胞核内,不存在跨膜结构域,为非跨膜蛋白,不存在信号肽,二级结构主要为α-螺旋及无规卷曲。此外通过对猪HIF-1α基因序列的同源性比较发现,与猪HIF-1α基因同源性最近的是绵羊,同源性最远的是原鸡。此研究为猪HIF-1α基因结构和功能的探索提供了一定的理论依据。     

新牧1号苜蓿抗逆相关基因MvNHX1启动子表达载体的构建

为了进一步研究新牧1号苜蓿抗逆相关基因MvNHX1启动子的功能,采用双酶切的方法,用核酸内切酶SacⅠ和NcoⅠ分别双酶切pCAMBIA1304质粒和阳性重组质粒pEASY-T1-simple-pMvNHX1,然后回收目的片段。通过T4DNA连接酶将目的片段和空载体相连后获得连接产物。将连接产物导入到宿主菌DH5α,通过画板,卡那霉素筛选后挑单菌落摇菌。然后用菌液PCR及双酶切鉴定该载体后,用冻融法将其导入农杆菌EHA105。结果表明,成功培养出含有抗逆相关基因MvNHX1启动子pMvNHX1∶GUS∶EHA105的菌落;成功构建出新的植物表达载体pMvNHX1∶GUS。     

3株猪流行性腹泻病毒S1基因的克隆及序列分析

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可感染各阶段的猪,使患病动物出现水样腹泻、呕吐,并伴随厌食和精神沉郁等临床症状,对哺乳仔猪危害尤为严重。为了解河南某猪场PEDV流行毒株S1基因的变异情况,以江苏农牧科技职业学院动物药学院实验室保存的感染PEDV临床病料为样本,对其进行S1基因扩增、克隆以及序列分析。对S1基因的进化分析结果显示,该猪场PEDV分离株S1基因推导的氨基酸序列之间的同源性高达99%,BLAST搜索结果显示与AHCZ-2株的相似性最高,将获得序列与经典毒株CV777相比在第57位插入了4个氨基酸NQGV,在第134位插入1个氨基酸D,而在第157、158位缺失2个氨基酸,在中和表位区域共有11处氨基酸突变,与国内其他毒株均位于G2-b进化分支,研究结果为进一步掌握该地PEDV的流行毒株和毒力变异情况提供了理论依据。     

猪APOA2启动子与转录因子GATA1作用的研究

对猪APOA2潜在启动子区进行克隆及活性分析,确定核心启动子区域,并进一步分析转录因子GATA1对APOA2基因转录活性的影响。结果表明,APOA2基因主要在猪的肝脏及脂肪组织中表达。双荧光素酶活性显示,猪APOA2基因5′端侧翼-813～-565 bp区域为核心启动子区,且-659～-565 bp区域内更可能存在一些促进APOA2转录的顺式作用元件。过表达GATA1基因结果显示,转录因子GATA1显著促进APOA2基因的转录;定点突变试验确认,转录因子GATA1可直接与APOA2基因启动子区的GATA1结合位点(-608～-599 bp)相结合。转录因子GATA1可直接靶向APOA2基因启动子区并促进APOA2的转录。     

美洲棉铃虫CYP321A1基因启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体的构建及活性测定

【目的】构建美洲棉铃虫细胞色素P450基因CYP321 A1启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体,为探索CYP321 A1基因的转录调控机制奠定基础。【方法】设计合成PCR引物,从美洲棉铃虫基因组DNA中扩增并克隆CYP321 A1基因的启动子区;将克隆的启动子片段插入载体pGL3-basic构建萤火虫荧光素酶报告基因载体p(-1 470/+64);用p(-1 470/+64)转染美洲棉铃虫脂肪体细胞系BCIRL-HzFB33,并用双荧光素酶报告基因检测系统分析该启动子活性。【结果】p(-1 470/+64)经双酶切、PCR鉴定及DNA测序分析鉴定准确无误;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,证实所构建的重组载体p(-1 470/+64)可以反映CYP321 A1启动子活性;黄酮、花椒毒素处理极显著地增强了重组载体p(-1 470/+64)的荧光活性。【结论】成功构建了美洲棉铃虫细胞色素P450基因CYP321 A1启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体,CYP321A1启动子活性可以被植物次生物质黄酮、花椒毒素高度诱导。     

粘虫中肠胰蛋白酶基因启动子的克隆及其功能分析

【目的】通过克隆粘虫Mythimna separata(Walker)(Lepidoptera:Noctuidae)中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列,并分析启动子功能,为进一步探索昆虫胰蛋白酶活性调控机制奠定基础。【方法】利用Genome Walking方法克隆粘虫中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列,运用在线分析软件NNPP v.2.2和数据库JASPAR进行序列分析,构建由胰蛋白酶基因启动子驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体,通过转染草地贪夜蛾sf21细胞系,瞬时表达后用双荧光素酶报告基因检测系统分析该启动子活性。【结果】克隆得到粘虫中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列1 863bp,其中含TATA框、CAAT框等启动子核心序列及GATA、STAT、C/EBP等转录调控元件。双荧光素酶报告基因检测系统分析表明,相对于空载体pGL3-Basic,所构建的重组载体p(-1 673/+25)具有明显的启动子活性。【结论】克隆得到的启动子片段明显具有启动报告基因表达的能力,可用于在胰蛋白酶基因启动子水平和转录因子水平研究杠柳新苷活性化合物的激活机理。     

广西巴马小型猪ANK1基因启动子克隆及其活性分析

[目的]克隆广西巴马小型猪ANK1基因启动子,确定其活性核心区,为研究ANK1基因启动子与肉质性状的相关性及构建动物疾病模型打下基础.[方法]通过在线软件对ANK1基因启动子的转录因子结合位点进行预测,根据转录因子结合位点设计特异引物扩增不同长度的ANK1基因启动子片段,并利用双荧光素酶试剂盒检测其荧光值,以确定不同ANK1基因启动子片段的活性.[结果]发现ANK1基因启动子存在1个转录起始位点(TSS)、2个CpG岛和多个转录因子结合位点,并以此作为ANK1基因启动子的分段依据,将其分割为P638、P791、P1113、P1163、P1648、P1694、P1796和P2074等8个不同长度的目的片段.成功克隆获得的8个ANK1基因启动子片段经KpnⅠ和HindⅢ双酶切、T4真核表达载体连接、细胞转染等方法构建8个双荧光素酶重组报告基因,双荧光素酶试剂盒检测结果显示,广西巴马小型猪ANK1基因启动子在P1796片段活性最强,与其他片段存在显著差异(P<0.05).[结论]成功克隆获得广西巴马小型猪ANK1基因启动子的8个片段,且利用双荧光素酶试剂盒检测确定其核心启动子区域出现在P1796片段.     

猪生长激素启动子的克隆及功能分析

[目的]克隆猪生长激素启动子,确定其启动子核心序列和主要的顺式作用元件。[方法]根据NCBI上公布的序列设计引物,PCR扩增了猪生长激素5’端-1 821～+61 bp的序列,并通过移步缺失的方法,获得9段长短不一的启动子序列,将其分别构建到双荧光素酶表达载体pGL3-basic上。通过重组质粒瞬时转染大鼠垂体瘤细胞(GH3)、猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)和转染后细胞荧光素酶活性的测定,检测这些5’末端缺失质粒在垂体及非垂体细胞中的相对转录活性。[结果]成功扩增了猪GH基因5’上游启动区1 882 bp的片段,并构建了9个pGL3-mGH promoter报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测系统证实插入报告基因载体中的启动子具有非常强的细胞特异性。[结论]猪生长激素特异性在垂体细胞中表达,其最小启动子位于-110 bp以内,启动子区-218～-110 bp和-429～-218 bp间存在正向调控元件。     

利用CRISPR/Cas9系统构建可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系

目的 将Tet-on系统与CRISPR/Cas9系统相结合建立诱导敲除猪Sohlh1基因的细胞系。方法 分离培养猪胎儿成纤维细胞(PFF),进行慢病毒载体PCW-eSpCas9(1.1)侵染并通过1 μg/mL嘌呤霉素筛选及强力霉素(Dox)诱导;改造pLV-sgRNA载体,进行293FT细胞转染验证;构建含Sohlh1基因目标靶点的pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,进行慢病毒包装检测;利用包装病毒侵染稳转PCW-eSpCas9(1.1)的PFF细胞,3 μg/mL灭稻瘟菌素进行筛选,随后添加Dox诱导进行表达分析和敲除效率检测。结果 建立了受Dox调控可诱导eSpCas9(1.1)蛋白表达的PFF细胞系,不添加Dox,eSpCas9(1.1)蛋白不表达;293FT细胞表达绿色荧光,表明pLV-sgRNA-2A-GFP载体改造成功。3、4、6号Sohlh1基因靶点具有敲除活性,利用最优的2个靶点构建了pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,荧光表达显示载体慢病毒包装成功。构建稳转PCW-eSpCas9(1.1)和pLV-sgRNA-2A-GFP的PFF,经Dox诱导72 h后,Sohlh1基因的敲除效率为85%。结论 利用Tet-on系统和CRISPR/Cas9系统成功构建了可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系,为研究Sohlh1基因的功能以及制备条件性敲除Sohlh1基因去除生殖细胞的模型猪奠定了基础。     

猪FAM213B基因mRNA和启动子的克隆及序列分析

【目的】获得猪FAM213B基因完整mRNA和启动子序列,研究猪FAM213B基因表达,为探讨母猪妊娠的建立和胚胎发育调控机制奠定基础。【方法】通过5'RACE和3'RACE技术,获得基因完整mRNA序列,分析不同物种该基因氨基酸序列相似性;通过PCR克隆启动子区,并通过双荧光素酶报告基因载体系统转染猪子宫内膜细胞,研究其转录活性。【结果】猪FAM213B基因mRNA全长808 bp,其中5'UTR、CDS区和3'UTR长度分别为67、609(含终止密码子)和132 bp(不含poly A序列),在17~106位氨基酸之间存在硫氧还蛋白折叠结构域;与猪FAM213B基因其他2个潜在转录本相比,三者都包含硫氧还蛋白折叠结构域,但蛋白三级结构存在较大差异;猪FAM213B氨基酸序列与山羊、牛和绵羊高度相似,相似性分别为94.03%、93.03%和91.54%。克隆获得2 261 bp(-2 231/+30)的基因启动子序列,将其连接至双荧光素酶报告基因载体,转染猪子宫内膜细胞,发现获得的启动子片段能够启动下游报告基因的转录,在启动子区存在潜在的典型NFκB等转录因子结合位点。【结论】本研究获得猪FAM213B基因转录本长度为808 bp,其蛋白存在硫氧还蛋白折叠功能结构域,其启动子序列(-2 231/+30)在猪子宫内膜细胞中具有较强的转录活性。     

大豆天冬氨酸蛋白酶基因启动子的克隆及其表达活性分析

【目的】克隆大豆天冬氨酸蛋白酶基因(soyAP1)启动子,并对其表达方式及活性进行分析。【方法】利用TAIL-PCR方法从大豆基因组DNA中克隆soyAP1基因启动子片段。利用启动子在线预测工具分析soyAP1基因启动子片段的启动子元件,并用克隆得到的SAP片段替换pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子,构建表达载体pCAM-SAP。通过农杆菌介导法,使其在大豆各组织中进行瞬时表达,用GUS组织化学染色法分析SAP在各组织中的表达活性。【结果】克隆获得了大豆soyAP1基因的启动子片段,长1 650bp,并将之命名为SAP,其转录起始位点可能是553bp处的A;PLACE分析表明,SAP序列中含有多种典型的种子特异性表达元件;GUS组织化学染色显示,SAP驱动的GUS基因在大豆根、茎、叶中基本不表达,但在种子中有较高的表达活性,且表达强度与CaMV35S启动子相近。【结论】大豆SAP启动子可能具有种子特异表达特性。     

猪LPL基因PCR-RFLP遗传变异的研究

利用PCR-RFLP技术,对大白猪、长白猪、杜洛克、荣昌猪、内江猪、八眉猪、汉中白猪、汉江黑猪8个家猪品种和1个野猪种共368头猪LPL基因的第6和第8内含子进行遗传变异研究。结果表明:(1)在第6内含子的Sma -RFLP位点上,各猪种均存在多态性,长白、杜洛克、内江猪和八眉猪以AA和AB基因型为主,大白、荣昌猪、汉中白猪、汉江黑猪及野猪以AB和BB基因型为主;在Pvu -RFLP位点上,国外猪种均为DD纯合子,而国内猪种和野猪在此位点上均存在变异;(2)在第8内含子的Hind -RFLP位点上,国外猪种和荣昌猪表现出多态性,而国内其他猪种和野猪均为FF纯合子;在EcoR -RFLP位点上,各猪种均表现多态性,且以GH杂合子为主,没有表现出差异。     

植物凝集素MNB1基因启动子表达载体的构建及鉴定分析

近年来植物受逆境胁迫的影响日益严峻,而逆境胁迫是造成现代农作物减产的重要因素之一。MNB1基因是拟南芥中与甘露糖高度特异性结合的植物凝集素,具有多种生物学功能,对植物的生长发育及逆境胁迫的应答有着至关重要的调控作用。以拟南芥为试验材料,利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）技术成功构建了ProMNB1:GUS植物表达载体,结合浸花法,成功将ProMNB1:GUS载体转化到拟南芥中,最终通过PCR鉴定分析获得ProMNB1:GUS阳性植株,为研究逆境胁迫下MNB1基因的功能及其转录水平的变化提供了重要的依据。     

猪抗酶1基因核心启动子区鉴定及单倍型转录活性比较

通过双荧光素酶报告基因载体系统检测猪抗酶1(AZ1)基因启动子转录活性,分析蓝塘和长白猪群体AZ1基因启动子SNP及单倍型,在此基础上比较不同单倍型转录活性。结果表明:-453/+79为核心启动子区;在2个群体中检测到AZ1基因启动子8个SNPs,分别为-713 TC、-584 AC、-476 GA、-365 TC、-348 CT、-294 GC、-288 TG和-234 TC,蓝塘猪群体具有更丰富的单核苷酸多态性,而长白猪群体仅在-288座位存在GG和GT 2种基因型,其他7个SNPs均为纯合状态;蓝塘猪群体LTH1单倍型(TAGCCGTC,-713/-234)频率为0.526,为蓝塘猪优势单倍型,其次为LTH2(TAGCCGTT),频率为0.166;长白猪群体优势单倍型为Landrace-H(TAGTCGGT),频率为0.939。LTH1转录活性高于LTH2和Landrace-H,推测-234 TC、-365 TC和-288 TG座位是造成不同单倍型转录活性差异的原因。     

猪LPAR3基因克隆及其在子宫内膜细胞的表达

【目的】获得猪LPAR3基因完整mRNA及基因结构,研究其启动子活性;探究LPAR3基因在子宫内膜的转录调控及可能影响母猪产仔的机制。【方法】应用5'RACE和3'RACE技术获取LPAR3基因完整mRNA序列;预测5'调控区潜在的启动子转录因子结合位点及CpG岛,构建不同长度的启动子双荧光素酶报告基因重组载体,与pRL-TK质粒共同转染至猪子宫内膜细胞,检测启动子活性;应用RT-qPCR比较LPAR3基因在妊娠第12天的二花脸猪和长大二元猪子宫内膜的相对表达量;应用亚硫酸氢钠修饰后测序比较LPAR3基因在妊娠第12天的二花脸猪和长大二元猪子宫内膜的甲基化状态。【结果】猪LPAR3 mRNA全长为2 127 bp,其中5'UTR和3'UTR的长度分别为202和860 bp,CDS区为1 065 bp。克隆获得包括LPAR3转录起始位点上游3 080 bp (–2 430/+650bp)的5'调控序列,分析预测显示该调控区不存在TATA box,存在GC元件、CPBP及糖皮质激素受体IR3等调控因子结合位点,且在–190/–84和–44/+651 bp处存在2个潜在CpG岛。成功构建9个不同长度的5'缺失报告重组载体并转染猪子宫内膜细胞。双荧光素酶活性检测结果显示,启动子P4(+454/+80 bp)的转录活性最高,其次是P6(–123/+80 bp)。RT-qPCR结果显示,妊娠第12天二花脸猪LPAR3基因在子宫内膜的表达量高于在其他组织的表达量,且极显著高于在妊娠第12天长大二元猪子宫内膜的表达量,LPAR3在2个猪种子宫内膜均处于低甲基化状态且差异不显著。【结论】猪LPAR3 mRNA全长为2 127 bp,妊娠第12天LAPR3基因在二花脸猪子宫内膜表达高于其在长大二元猪子宫内膜的表达,显示LPAR3可能参与了猪早期妊娠并影响产仔数。