山羊脂肪酸合酶基因(FASN)启动子结构与功能的初步分析

本研究旨在对山羊脂肪酸合酶基因(Fatty acid synthase,FASN)启动子进行结构与功能的初步分析,进而对其转录调控机制进行探讨。采用PCR技术从西农萨能羊基因组DNA中克隆FASN基因启动子,通过缺失分析,构建7个包含不同缺失片段的荧光素酶报告基因载体,转染山羊乳腺上皮细胞和MCF-7细胞,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动活性。结果表明,克隆得到FASN基因的启动调控序列2 589bp,生物信息学分析发现,该启动子序列含有典型的启动转录元件TATA-box和E-box,分别位于转录起始位点(+1)上游-41和-74bp处。报告基因分析表明,启动子核心区域定位在-293～-79bp,在线软件预测发现,该区域含有Sp1、NF-Y、USF和SREBP等转录因子结合位点。结果显示,FASN基因启动子前端存在负调控元件,Sp1、NF-Y、USF和SREBP等转录因子可能参与FASN基因的转录调控。     

盐生草HgNHX1基因启动子的克隆及功能验证

为了进一步探明盐生草HgNHX1基因启动子的功能,从盐生草基因组中克隆了HgNHX1基因上游 5'侧翼调控区1523 bp的序列,即HgNHX1基因启动子(pHgNHX1)序列,并利用PlantCARE、PLACE等在线软件对HgNHX1基因5' 端上游序列进行预测和分析,发现该启动子中除具有TATA-box、CAAT-box等核心启动子元件外,还含有多个与盐、干旱、缺水、冷、伤害等逆境胁迫诱导有关的作用元件;同时具有生长素、脱落酸、赤霉素及乙烯等植物激素诱导响应的功能元件,表明分离得到的DNA片段具有典型启动子的一般特征。构建pBI-HgNHX1启动子植物表达载体并转化拟南芥和烟草,利用组织染色法鉴定转基因烟草和拟南芥的 β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)表达模式,发现在转基因拟南芥的各个器官均有GUS 酶的活性,说明pHgNHX1具有一定的组成型启动子活性。     

草地早熟禾PpGA2ox基因启动子的克隆及功能分析

为了研究草地早熟禾(Poa pratensis L.)GA2-氧化酶基因(PpGA2ox)的启动子,利用染色体步移的方法从草地早熟禾中克隆得到1109bp的PpGA2ox基因启动子序列。Plant CARE在线预测结果表明该启动子序列中存在CAAT-box、TATA-box等启动子基本顺式作用元件以及响应干旱胁迫和茉莉酸甲酯诱导的调控元件。构建PpGA2ox基因启动子与GUS报告基因融合的植物表达载体转化拟南芥,阳性植株GUS组织化学染色结果表明PpGA2ox基因启动子可以驱动GUS基因在拟南芥中表达并且表达具有组织特异性。与对照相比,激素处理及非生物胁迫下GUS基因表达量发生变化,推测PpGA2ox基因的表达可受到激素及非生物胁迫调控。     

紫花苜蓿尿黑酸植基转移酶的克隆、表达分析以及遗传转化研究

维生素E是一种人体必需,却不能自主合成的脂溶性维生素。尿黑酸植基转移酶(HPT)是维生素E生物合成途径的关键限速酶,直接影响植物体内维生素E的总量。本实验利用同源克隆的方法,根据截形苜蓿的序列从紫花苜蓿中克隆得到HPT基因的完整开放阅读框(ORF)。NCBI Blast分析结果表明,该基因编码412个氨基酸,属于异戊烯转移酶UbiA超家族。多序列比对结果表明,该序列与其他物种的HPT蛋白序列相似度高达80%,将其命名为MsHPT。进化树分析结果表明,MsHPT与截型苜蓿MtHPT亲缘关系最近,蛋白序列相似度为96.84%。通过染色体步移技术得到该基因的启动子序列,分析结果显示,该基因的启动子区域含有胁迫响应元件、激素响应元件(脱落酸、赤霉素和乙烯)以及大量的光响应元件。实时荧光定量PCR检测结果表明,MsHPT基因在紫花苜蓿各组织中均有表达,叶片中的表达量最高,根次之。经低温、NaCl、PEG、GA₃和ABA诱导后该基因表达均上调,表明其可能参与了植物的抗逆性调控。扩增MsHPT基因的开放阅读框,对其进行双酶切后转入双元表达载体pBI121中,通过农杆菌介导的方式将该基因转入拟南芥。通过PCR鉴定,得到7株阳性苗。本研究为进一步探索MsHPT在紫花苜蓿维生素E的合成以及紫花苜蓿抗逆调控中的作用奠定了基础。     

马铃薯SGT3基因表达及其启动子功能分析

鼠李糖转移酶(rhamnosyltransferase SGT3)是植物糖苷生物碱合成的关键酶,它主要调控α-茄碱和α-查茄碱从其β形式的转化。本文研究马铃薯栽培种SGT3基因的表达特点及其启动子的功能。实时定量PCR结果发现在红光照射24 h后,SGT3的表达量是黑暗处理的26.8倍,说明红光显著诱导了SGT3的表达;为进一步分析该基因的光调控机理,本项研究克隆到SGT3上游长度为2449 bp的启动子序列,通过分析发现该启动子的转录起始位点位于翻译起始位点上游-152 bp,同时确定了该启动子核心序列及上游增强子、抑制子序列,受病原菌、损伤、干旱、ABA 激素及一系列光调控的顺式元件。构建不同长度(349,572,979,1312和1870 bp)的该启动子驱动报告基因GUS的植物表达载体并转化烟草。结果证明,不同长度的SGT3启动子都可以启动GUS表达,但没有CMV 35S启动的GUS表达量高;其中在P572和P979的表达强度较高,这可能与该片段含有启动子的正调控元件(GATA BOX,5′UTRPY-RICH STRETCH)有关,GUS表达强度在P1312和P1870中明显减弱,预测到该区段存在抑制基因表达的负调控元件(WRKY710S);SGT3启动子的组织特异性实验表明GUS染色主要集中在烟草叶片的叶脉部分,茎中的表皮、韧皮部及木质部,但髓部几乎不表达,根中主要分布在根冠、分生区以及维管束组织中。上述结果为将来研究SGT3在糖苷生物碱合成过程中的调节功能提供了依据。     

新牧1号苜蓿两个抗逆相关基因启动子的克隆及分析

采用实时荧光定量PCR分析了新牧1号苜蓿（Medicago varia Xinmu 1）MvNHX1和MvDREB1基因在盐胁迫下的表达情况。此外,根据已获得的MvDREB1和MvNHX1基因序列设计特异引物,并以新牧1号苜蓿的基因组DNA为模板,克隆得到了这两个基因的启动子。利用生物信息学方法,分析这两个基因启动子的类型和结构,结果表明,MvNHX1和MvDREB1基因的启动子序列中均含有通用启动元件和上游调控元件,如CAAT框、TATA框、光响应元件、低温响应元件等,但部分响应元件的种类和数量不同。通过对两个基因启动子的克隆、分析及比较为进一步研究这两个基因的表达调控机制奠定了基础。     

猪附红细胞体α-烯醇化酶基因的克隆及生物信息学分析

为了研究猪附红细胞体α-烯醇化酶的功能,根据GenBank中猪附红细胞体α-烯醇化酶基因的DNA序列设计引物,以猪附红细胞体吉林株DNA为模板,进行PCR扩增,将该基因克隆到pMD-18T载体后,进行序列测定及分析。结果表明:此序列编码393个氨基酸,与GenBank上登录的α-烯醇化酶序列核苷酸同源性为98%,氨基酸同源性为100%。蛋白质的分子理论值为42.4 ku,理论等电点为6.62。α-烯醇化酶二级结构以α螺旋为主,主要有6个抗原表位区域。系统进化分析显示,该基因与牛支原体的亲缘关系最近,与犬支原体亲缘关系最远。     

柠条锦鸡儿CkNCED1基因启动子的克隆及表达分析

利用染色体步移(Genome walking)技术,克隆柠条锦鸡儿CkNCED1基因上游启动子序列。经顺式元件预测分析,该序列除基本的启动元件之外,还含有2个脱落酸诱导响应元件ABRE、此外还含有多个逆境相关的元件。将CkNCED1基因启动子区连接到pGWB533植物表达载体上,构建Promoter::GUS载体,GUS组织化学染色结果表明,CkNCED1基因在植物的叶、根、茎、花和角果的维管组织中均有表达,且在叶片中表达强度最高。以上研究确定了柠条锦鸡儿CkNCED1基因的表达部位和强度。进一步说明CkNCED1基因在ABA合成调控中发挥重要作用,为深入研究基因功能奠定基础。     

能源橡胶草GGPPS基因启动子的克隆及瞬时表达研究

以多年生宿根型草本植物橡胶草为材料,根据已获得的橡胶草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)基因序列设计引物,采用TAIL-PCR扩增到GGPPS基因5'上游大小为1131 bp的序列。采用PlantCare和PLACE软件分析,表明该序列不仅具有启动子的基本元件,同时还有与多个器官特异表达元件以及与胁迫相关的顺式作用元件,命名为pTkGGPPS(GenBank:KT901796)。将该序列代替pCAMBIA1304质粒上的CaMV 35S启动子序列,以GFP基因作为报告基因,构建pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP植物表达载体,利用农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞,结果表明,该启动子能够驱动GFP基因表达,具有一定的活性。TkGGPPS基因启动子克隆及瞬时表达为橡胶草中橡胶合成及组织特异性研究奠定了基础。     

桑树成花素基因MaFT的启动子克隆和功能位点分析

FT(flowering locus T)是高等植物开花过程中关键的信号整合因子,主要在叶片维管束中合成,通过运输抵达茎顶端分生组织发挥作用。为了研究桑树FT基因的转录调控机制,以白桑种(Morus alba Linn.)品种新一之幼嫩叶片的基因组DNA为模板,根据NCBI数据库公布川桑(Morus notabilis)全基因组中FT同源序列的上游序列设计引物,PCR扩增获得FT基因的启动子片段,其长度为921 bp,命名为MaF TP。通过PLACE和PlantC ARE在线启动子预测工具分析,该序列中除含有TATA-box、CAAT-box等真核生物启动子的核心元件外,还存在脱落酸的响应元件ABRE,生长素响应元件AuxRR-core,水杨酸响应元件TCA-element,生理节律相关顺式作用元件circadian,光响应元件I-box、G-box、MNF1等,以及胚乳表达必需的顺式作用元件Skn-1-motif和抗逆性相关的顺式作用元件W-box、MBS、TC-rich repeats,表明FT基因的转录表达可能受光照、干旱、节律性、脱落酸、生长素、水杨酸等因素的调控,并参与胚乳的形成。将5'端缺失的5段FT启动子序列(从大到小依次为MaF TP903、MaF TP762、MaF TP542、MaF TP289、MaF TP162)分别与报告基因GUS融合构建表达载体,利用农杆菌转化烟草(Nicotiana benthamiana)植株,通过GUS染色对不同长度的启动子活性进行分析,结果表明:除了MaF TP903的活性较弱外,其余启动子缺失片段均能驱动GUS基因高效表达,且表达量相近。依据研究结果推测:MaF TP启动子的762~903 bp区段可能存在MaF T基因转录表达的负调控元件。     

紫花苜蓿MsLEA4启动子的克隆及表达分析

为了深入研究紫花苜蓿（Medicago sativa）MsLEA4基因的功能,本试验采用染色体步移技术从紫花苜蓿基因组中扩增出MsLEA4启动子序列,构建GUS植物超表达载体,并根据序列分析结果对紫花苜蓿进行相应逆境胁迫。结果表明：紫花苜蓿MsLEA4启动子含有响应脱落酸（abscisic acid,ABA）调控的顺式作用元件ABRE,响应赤霉素（gibberellin,GA）调控的顺式作用元件P-box,参与胚乳合成的顺式作用元件GCN4和Skn-1,以及涉及光调控和光周期的顺式作用元件;外源ABA、GA、持续光照以及黑暗均能诱导MsLEA4基因的表达;GUS基因只在拟南芥花和荚果中表达。因此,MsLEA4基因能参与紫花苜蓿的逆境调控,与该基因启动子序列中所含的一系列顺式作用元件相关。本研究为进一步探索MsLEA4基因在紫花苜蓿逆境胁迫、光调控以及组织特异性表达中的作用奠定了基础。     

匍匐翦股颖HSP26.7基因启动子的表达分析

为研究匍匐翦股颖HSP26.7基因启动子在植物抗逆方面的功能,克隆了匍匐翦股颖的一个小热激蛋白HSP26.7基因的启动子并进行了序列分析;构建了同时具有该启动子序列和GUS报告基因的植物表达载体,并通过农杆菌侵染法转化拟南芥植株.结果显示:该启动子存在HSE,ABRE等响应高温和其他胁迫的调控元件,受高温胁迫强烈诱导,...     

猪DKK1基因启动子区的克隆及其活性分析

旨在初步探索DKK1基因转录调控机制,本研究利用启动子在线预测软件分析了该基因启动子区序列特征,根据Ensembl数据库已公布的猪DKK1基因的5′侧翼区序列,设计特异性PCR引物进行扩增、测序,进而构建启动子区不同缺失片段的pGL3-DKK1双荧光素酶表达载体,分别转染293T细胞和Hela细胞,并进行双荧光素酶报告基因检测。结果显示,DKK1基因启动子中含有1个TATA-box、多种转录因子和1个CpG岛;DKK1基因启动子对239T细胞具有偏好性,其中p-1 679/+292bp启动子片段活性最高,且显著高于其他缺失片段(P0.01)。-953~-1 679bp为核心启动子区域,-586~-953bp区域可能存在负调控元件,在-953~-1 679bp区域可能存在正调控元件。本试验通过对DKK1基因进行生物信息学分析并结合不同长度启动子片段双报告基因活性检测,证实了DKK1基因的5′侧翼区序列具有启动子转录活性,并初步确定了该基因的启动子区域,找到了启动子的核心区域和主要调控区域,为进一步研究DKK1基因转录调控机制奠定基础。     

柑橘TIFY基因的结构特征及响应低温的表达分析

TIFY基因家族是一类包含TIFY结构域的植物特有转录因子,与植物的生长发育密切相关,且在非生物逆境响应中起着重要作用。本研究基于柑橘基因组测序结果,分析了3个TIFY基因家族成员的基因结构特征,并利用qPCR分析了低温胁迫下这些基因的表达水平。结果表明：(1)3个TIFY基因含有TIFY结构域和Jas motif,属于JAZ蛋白亚家族基因;(2)3个TIFY基因的启动子含有LTR、DRE core、STRE、TC-rich repeats等逆境相关顺式作用元件以及MeJA响应元件、ABA响应元件等激素响应相关元件,推测3个TIFY基因可以响应多种非生物胁迫;(3)Cs1g17220和Cs4g07130在果实中高表达,推测其可能与果实发育相关;(4)3个TIFY基因受低温诱导在早期上调表达,且受低温胁迫的程度越大,其受诱导上调表达的倍数越高。本研究将为进一步解析TIFY基因家族在柑橘中的作用和功能提供重要线索。     

奶山羊心脏型脂肪酸结合蛋白（FABP3）基因启动子的克隆及活性分析

心脏型脂肪酸结合蛋白（FABP3）是一种15 kDa的蛋白，涉及信号转导途径，参与长链脂肪酸的摄取及利用。本研究采用PCR技术扩增FABP3启动子序列，通过缺失分析构建了5个不同缺失片段荧光素酶报告基因载体，并转染奶山羊乳腺上皮细胞，通过双荧光素酶报告基因系统检测FABP3缺失片段启动子活性。结果表明：从奶山羊基因组中克隆得到2109 bp FABP3基因启动子序列（包括转录起始位点上游1985 bp），与牛（KJ649748.1）、猪（HM591296.1）和人（NG047049.1）的基因组序列同源性分别为90%、80%、75.08%。经转录因子在线软件预测分析发现，该启动子含有潜在的TATA框（TATA-box）、过氧化物酶增殖物激活受体反应元件（PPRE）、肝X受体反应元件（LXRE）、雌激素受体（ER）及两个环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）的结合位点，分别位于-1632 bp和-189 bp。缺失突变研究发现，启动子片段-1801 ～ +124活性最高，同时这一片段含有两个CREB结合位点，而当缺失至-80位点时，活性显著下降（P ＜ 0.05），且这一片段不包含CREB结合位点。表明CREB可能参与调控FABP3基因启动子的活性，为FABP3基因的转录调控研究提供理论依据。 [关键词] 心脏型脂肪酸结合蛋白（FABP3）|启动子|基因克隆|西农萨能奶山羊     

鸡U6核内小RNA基因的克隆与分析

本研究旨在获得鸡U6 snRNA的全序列,并对其序列、启动子及拷贝数等进行分析。本实验通过RT-PCR、克隆、测序获得了鸡U6 snRNA的部分序列(94 bp)。根据测序结果和鸡全基因组序列数据,结合生物信息学分析,结果获得了鸡U6 snRNA的全长序列(106 bp),该序列与人U6 snRNA序列相似性为100%,在鸡基因组中有4个拷贝,其中3个成簇存在于28号染色体上一段2 kb长的DNA片段上;另一个位于18号染色体。已有研究报道,这4个基因拷贝的5′侧翼区均具有启动子活性,说明它们是真基因。结果表明:这4个U6 snRNA基因启动子区均含有潜在的远端序列元件(DSE)、近端序列元件(PSE)和TATA box等RNA聚合酶Ш启动子元件。本研究成功获得了鸡U6 snRNA的全长序列,为选用U6基因作为内参基因开展鸡miRNA定量表达分析以及鸡U6基因的转录调控研究奠定基础。     

鸭CD8α基因启动子区的克隆及荧光素酶报告基因重组体的构建

旨在了解分化群α基因可能的调控序列及其转录调控机制。本研究利用基因组步移技术扩增鸭CD8α基因的启动子区序列,使用在线软件进行序列分析;分别将鸭肝炎易感组和抗性组的CD8α基因启动子区定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic中,利用酶切与测序技术进行鉴定;并瞬时转染细胞,采用荧光素酶报告基因系统检测启动子载体的活性。结果,扩增出一条长度为2 480bp的片段(包含第一外显子56bp,启动子区2 424bp)。经序列分析,鸭CD8α基因启动子区具有典型的TATA-box、GC-box和CAAT-box,其转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游-406bp处,且发现了CdxA、Nkx-2、GATA-1、SRY等41个潜在转录因子结合位点。经酶切与测序鉴定,成功构建了鸭CD8α基因荧光素酶报告基因重组体。荧光素酶报告基因检测系统显示,构建的鸭肝炎易感组和抗性组的报告基因启动子载体具有相当的活性。研究结果为进一步探讨CD8α基因的转录调控奠定了基础。     

鼠隐藏管状线虫烯醇化酶基因的克隆与序列分析

为获得鼠隐藏管状线虫(Syphacia obvelata)烯醇化酶结构及其功能,采用同源克隆方法结合RACE技术克隆获得了烯醇化酶基因c DNA序列,并对其进行了序列分析。测序结果显示,扩增获得的鼠隐藏管状线虫烯醇化酶基因大小序列为1603 bp,包含全长为1311 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,共编码436个氨基酸,推导分子量为47.428 k Da。序列分析结果显示,鼠隐藏管状线虫烯醇化酶含有10个丝氨酸激酶磷酸化位点、3个苏氨酸激酶磷酸化位点和4个酪氨酸激酶磷酸化位点,1个潜在的跨膜螺旋结构,无信号肽剪切位点;在亚细胞水平,预测其主要定位于胞浆;二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,其中α-螺旋占34.86%,无规则卷曲占30.50%,延伸链占24.08%,β-转角占10.55%。Swiss-Model模建的3D结构显示,鼠隐藏管状线虫烯醇化酶为一"哑铃"样结构,包含氨基端和羧基端两个结构域,结构域之间为Linker区。每个结构域由多个α-螺旋、β-折叠和卷曲所构成桶形结构,催化中心和Mg~(2+)结合位点位于桶形结构的中心。本研究结果为鼠隐藏管状线虫烯醇化酶基因的功能研究奠定基础。     

山羊卵巢维持基因FOXL2启动子活性及调控区域分析

旨在研究山羊卵巢维持基因FOXL2启动子活性以及探究该基因的调控机理。从NCBI数据库调取FOXL2基因启动子序列,用生物信息学软件对其核心启动子和转录因子进行预测分析。使用PCR技术克隆FOXL2基因启动子序列,并构建一系列缺失载体,瞬时转染293T和A375细胞,利用双荧光素酶基因检测仪测定相对荧光素酶活性值。结果表明,该基因启动子区域存在两个典型的CpG岛,分别位于(-920/+51(972bp))和(+125/+555(430bp))区域;经KpnⅠ和HindⅢ双酶切鉴定表明,重组载体质粒构建正确;在细胞中插入不同长度的FOXL2基因启动子片段,随着启动子5′端截短,荧光素酶转录活性先升高再逐渐降低。(-934/+324)区域存在转录活性,(-32/+324)区段包含了转录的基本元件;(-934/-456)区域在转录过程中对FOXL2基因起负调控作用,(-456/-192)区域为正调控区域。