纤溶酶原激活物抑制剂-1在疾病诊断中的研究进展及在动物疾病诊断的应用前景

纤溶酶原激活物抑制剂-1(Plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)是尿激酶型纤溶酶原激活物(U-rokinase-type plasminogen activator,uPA)和组织型纤溶酶原激活物(Tissue-type plasminogen activator,tPA)的内...     

人组织型纤溶酶原激活剂原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的初步表达

目的:构建人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tPA)原核表达载体,检测其在大肠杆菌Escherichia coli中的初步表达.方法:以含有人tPA基因的质粒为模板,设计引物扩增出含有RGDS-tPA基因并构建到原核表达载体pET28a中,测序证实为正确的rtPA序列,并将pET28a-tPA转化至菌株E.coli BL21(DE3).用IPTG诱导rtPA在E.coli中表达,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行验证.结果:琼脂糖凝胶电泳获得目的基因片段tPA的条带约在1 700bp处,鉴定为阳性重组体;聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定获得目的蛋白片段rtPA的条带约53KDa,为非活性的包涵体.结论:人组织型纤溶酶原激活剂原核表达载体构建成功,可在大肠杆菌中有效表达.     

中药虻虫纤溶成分(TFC)及其性质

虻虫生药浸提液经 75%饱和度(NH4)2SO4 沉淀、Sephadex G-75 凝胶过滤层析得虻虫纤溶成分(TFC);TFC 的最适作用温度为 50℃,最适作用 pH 为 7.5;0.52 mmol/L PMSF 能完全抑制 TFC 的纤溶活性,金属离子 Ca++,Mg++,Zn++,Cu++,Mn++,Hg++ 对 TFC 活性有部分抑制作用;TFC 既具有纤溶酶活性,又具有激活纤溶酶原的活性,既可以降解纤维蛋白又可以降解纤维蛋白原.     

人微小纤溶酶原cDNA在毕赤酵母中的高效表达及活性检测

【目的】人微小纤溶酶原是由261个氨基酸组成的肽链,位于人纤溶酶原第549～790位,含有纤溶酶原活性区域,被激活后具有纤溶活性,能够降解纤维蛋白。本文旨在优化人微小纤溶酶原cDNA在毕赤酵母中的表达条件。【方法】在NCBI中获取人微小纤溶酶原氨基酸序列,根据毕赤酵母密码子偏爱性原理,设计对应的DNA序列,然后进行人工合成。合成的基因序列经测序验证后酶切与表达载体pPICZαA连接形成重组表达质粒pPICZαA-mPlg,转入大肠杆菌JM109中扩增质粒,提取阳性菌落中的重组质粒,双酶切获得人微小纤溶酶原的表达单元,然后构建4拷贝(表达单元)pPICZαA-mPlg,单酶切线性化质粒。然后电转化导入感受态毕赤酵母SMD1168中,经表型筛选、PCR筛选阳性克隆,获得高表达人微小纤溶酶原工程菌。培养工程菌后,甲醇诱导工程菌细胞让人微小纤溶酶c DNA表达,用SDS-PAGE检查其分子量,发色底物法检测微小纤溶酶原活性,通过发酵条件优化提高人微小纤溶酶原的产量,用SP-Sepharose fast flow凝胶层析方法纯化目标蛋白。【结果】SDS-PAGE检测到符合人微小纤溶酶原分子量大小的蛋白条带,同时发色底物法检测出样品中含有纤溶活性,其水平达到90 U/mL。【结论】本文为后续进行大规模表达人微小纤溶酶原打下了基础。     

中药虻虫纤溶成分(TFC)及其性质

虻虫生药浸提液经７５％饱和度（ＮＨ４）２ＳＯ４沉淀、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５凝胶过滤层析得虻虫纤溶成分（ＴＦＣ）;ＴＦＣ的最适作用温度为５０℃,最适作用ｐＨ为７．５;０．５２ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＭＳＦ能完全抑制ＴＦＣ的纤溶活性。金属离子Ｃａ＾＋,Ｍｇ＾＋＋,Ｚｎ＾＋＋,Ｃｕ＾＋＋,Ｍｎ＾＋＋,Ｈｇ＾＋＋对ＴＦＣ活性有部分抑制作用,ＴＦＣ既上有纤溶酶活性,又具有激活纤溶酶原的活性,既可以降解纤维蛋白又     

豆豉纤溶酶研究进展

豆豉纤溶酶是从中国传统风味食品豆豉中分离得到的一种纤维蛋白酶,具有良好的溶解血栓作用。综述了豆豉纤溶酶产生菌的菌种,豆豉纤溶酶的理化性质、溶栓作用以及分子生物学研究现状。由于豆豉纤溶酶与传统的溶栓剂相比,具有活性高,安全无毒,分子量小,可以通过消化直接吸收等优点,因此具有广阔的应用前景。     

蚯蚓纤溶酶的研究进展

蚯蚓纤溶酶是近年发现的一种新型溶栓物质,该酶具有纤溶活性和溶栓活性,故其研究受到了极大的关注。文章概述了蚯蚓纤溶酶结构特点、药用价值、酶学活性、基因获取与表达、开发利用等方面近10年以来的研究进展。     

利用重叠延伸PCR技术进行定点突变研究(英文)

[目的]建立一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。[方法]以重组人组织型纤溶酶原激活剂rPA(Reteplase)基因为模板,采用重叠延伸PCR技术对3个位点进行定点突变,将突变基因片段克隆到克隆载体pEASY-Blunt上,并通过测序验证突变结果。[结果]测序结果表明3个位点的突变结果与预期完全一致,即第10位引入单个碱基A、第137位碱基C突变为G以及第686位碱基G突变为A,通过重叠延伸PCR技术一次引入3个突变碱基,100%的实现目的位点的定点突变。[结论]该研究成功实现目的位点的定点突变,为rPA基因的进一步克隆和功能研究奠定了基础。同时也表明重叠延伸PCR技术是一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。     

茶色素药理作用研究的国际动态(综述)

茶色素药理作用研究的国际动态（综述）湖南医科大学茶与健康研究室曹进，赵燕，刘箭卫自本世纪六十年代初，我国学者楼福庆等发现茶中儿茶素的氧化产物茶色素所具有的抗动脉粥样硬化与促纤溶作用后（１），这种红茶主要活性成分的药理作用研究较为冷落。然而，近年来茶色...     

地鳖虫纤溶酶的三维结构模拟与序列分析

为了研究地鳖虫(Eupolyphage sinensis Walker)纤溶酶的溶栓机理,根据地鳖虫纤溶酶成熟肽编码序列,利用生物信息学方法,对地鳖虫纤溶酶进行了结构分析,用Biosun软件的同源模建技术,模拟了其三维结构。利用GOLDKEY软件,对地鳖虫纤溶酶的氨基酸序列进行了分析,讨论了其等电点、亲水性、柔性与催化活性之间的关系。结果表明,地鳖虫纤溶酶的活性中心是组氨酸、丝氨酸和天冬氨酸3个氨基酸残基,位于球蛋白中心凹穴处,底物结合部位是丝氨酸、天冬氨酸和甘氨酸,该类酶水解纤维蛋白的机理是催化精氨酸-赖氨酸之间的肽键水解。     

微生物发酵制备纤溶因子的研究进展

血栓性疾病是目前危害人类健康的第一大健康杀手,微生物发酵制备纤溶因子安全性高,是国内外筛选特异性强的溶栓剂常用方法之一。综述了纤溶茵（或纤溶酶）来源、纤溶酶制备和溶栓发酵液的其他生物活性,并对微生物发酵制备纤溶因子的未来发展方向进行了展望。     

芽孢杆菌纤溶酶的纯化及其生物活性研究

芽孢杆菌2^#（Bs-2）的发酵液经过硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-75凝胶过滤层析、Q-Sepharose阴离子交换层析、电泳制备和电源洗脱。获得一种具有纤溶性的蛋白酶;该蛋白酶由3个亚基组成,分子量分别为23KD,SSKD,19KD,全酶分子量约为64KD;经纤维蛋白平板测定表明,该酶既具有纤溶酶作用,又具有激活纤溶酶原的作用。     

豆豉纤溶酶高产突变株的选育

[目的]从豆豉中筛选出高产纤溶酶的菌株,并通过平板筛选得到高产突变株。[方法]从6种不同豆豉样品中,筛选得到具有较高纤溶酶活性的菌株,采用物理化学诱变方法进行复合诱变,再利用纤维蛋白平板对诱变后菌株进行筛选。[结果]得到1株高纤溶酶活力菌株,命名为DC-YC41,酶活达到742 IU/ml。[结论]初步判断,得到的这株高纤溶酶活力菌株为枯草芽孢杆菌。     

尿激酶的制作方法

一、产品概述尿激酶是从新鲜人尿里提取的一种溶血栓药物。它能激活纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶,纤溶酶能使不溶性的纤维蛋白转变为可溶性的肽,从而使血栓溶解。因此,临床上多用于治疗血栓形成、血栓栓塞等症。     

豆豉纤溶酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

[目的]为豆豉纤溶酶的进一步研究与应用奠定基础。[方法]以从芽孢杆菌中提取的总DNA为模板,根据GenBank的豆豉纤溶酶基因(AY720895.2)DNA序列设计1对引物,克隆豆豉纤溶酶基因并进行序列测定。构建毕赤酵母表达载体pL3,在毕赤酵母中表达豆豉纤溶酶基因。[结果]经PCR扩增可获得约1.1 kb的DNA片段。序列分析表明所克隆DNA片段包含1个1089 bp的开放阅读框,编码363个氨基酸。该克隆基因与所发表的豆豉纤溶酶基因序列的核苷酸序列同源性为98%,而氨基酸序列同源性达100%。[结论]所克隆的豆豉溶纤酶基因在毕赤酵母中成功表达,且表达产物具有正常的生物学活性。     

豆豉纤溶酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据已发表的豆豉纤溶酶基因DNA序列(GeneBank AY720895.2),设计并合成了一对引物,应用PCR技术以筛选的来自豆豉的产纤溶酶的芽孢杆菌的总DNA为模板,扩增出了豆豉纤溶酶基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,进行了序列测定,测序结果经Genetool序列分析表明该基因长1 089 bp,编码363个氨基酸,与已发表Brevibacillus laterosporus豆豉纤溶酶基因序列在核苷酸水平上与所发表的序列有98%的同源性;在氨基酸水平上与已发表的芽孢杆菌豆豉纤溶酶同源性为100%。并将该基因克隆到大肠杆菌表达载体pET22b上,在大肠杆菌中实现了高效表达。     

信号肽对鸡Igλ轻链绿色荧光蛋白重组分子在COS7细胞上分泌表达的影响

分别将鸡Igλ轻链信号肽、小鼠纤溶酶原信号肽与pEGFP-C1载体的绿色荧光蛋白N端融合,产生带有信号肽的中间载体pEGFP-SPc和pEGFP-SPm。对鸡Igλ轻链基因的定向克隆,构建了带有纯化标签的鸡Igλ轻链绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-SPc-λ和pEGFP-SPm-λ。转染COS7细胞后,荧光显微镜观察及Western blotting检测融合蛋白的分泌表达,结果显示,鸡Igλ轻链信号肽能引导鸡Igλ轻链绿色荧光蛋白融合分子的分泌表达;而小鼠纤溶酶原信号肽不具备引导该重组蛋白分泌表达的功能。表明信号肽在蛋白分泌表达中的关键作用,重组蛋白的分泌表达要选择合适的信号肽。     

纳豆激酶纤溶活性研究

通过制备纳豆提取激酶、纳豆激酶粗酶,对纳豆激酶纤溶性质进行研究,结果表明:纳豆激酶纤溶活性最适pH为8.0,pH6～10溶液中40℃以下基本稳定,pH<5失去纤溶活性;模拟胃环境的酸性条件下,粗酶失去纤溶活性,而纳豆浸提液纤溶活性保持25%;SDS-PAGE电泳显示,胰蛋白酶对纳豆激酶成分没有降解作用;体外溶栓作用表明,纳豆激酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原。     

长白山道地药材接骨木、苦碟子纤溶酶分离及活性检测

从具有活血化瘀功能的长白山道地药材接骨木、苦碟子中分离纤溶酶,并利用纤维平板法对分离的纤溶酶进行活性鉴定。结果表明:从接骨木和苦碟子中可以分离到具有溶栓活性的纤溶酶,其含量分别为1 842μg/g及1 976μg/g。尿激酶法测定其比活力分别为0.795 U及0.837 U,SDS-PAGE电泳检测其大小约为36 ku,该酶在高温下失活,在70%~90%硫酸铵饱和溶液中活性最高。     

高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达

本研究以本实验室曾在酒曲、酒糟、窖泥等样品中分离的具有酱香味的13株菌株作为出发菌株,经脱脂奶粉平板、纤维蛋白双层平板筛选出纤溶酶活性最高的菌株GZHZ_(V-8),结合形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析,GZHZ_(V-8)菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。以GZHZ_(V-8)菌株总DNA为模板扩增出纤溶酶基因的编码区,与pMD18-T载体连接、转化至大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α,分析表明纤溶酶基因开放阅读框包含1092 bp碱基,编码363个氨基酸。纤溶酶基因与表达载体pET-22b(+)连接转化至E.coli BL21中表达,表达菌株经IPTG诱导表达分泌活性纤溶酶,培养后测得发酵上清液、菌体细胞破碎上清液和菌体细胞破碎沉淀的纤溶酶活力分别为613.26 IU/mL、407.38 IU/mL、993.12 IU/mL。