新城疫病毒(NDV)F基因的克隆及其真核表达重组质粒的构建

应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和一对自行设计的引物,从新城疫病毒(NDV)F48E9株扩增出长度为1664bp的DNA片段。与已报道的NDV-融合蛋白(F)基因比较,两者大小一致。经限制性内切酶反应,获得两个预期大小的片段。将克隆的F基因定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经酶切和测序鉴定,证明构建的重组质粒含有NDV-F基因。     

日本脑炎病毒E基因抗原域Ⅲ的克隆及高效表达

根据GenBank公布的日本脑炎病毒 (Japaneseencephalitisvirus ,JEV)SA14 14 2减毒株的核苷酸序列 ,设计并合成一对特异性引物 ,应用RT PCR方法扩增出编码JEV囊膜蛋白抗原域Ⅲ的基因 (EⅢ) ,将其连接入pMD18 T载体 ,经测序后克隆入原核表达载体pET 32a (+) ,构建原核表达载体pET EⅢ 。阳性质粒转化感受态大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导 ,JEV EⅢ 基因获得表达 ,经细胞定位分析 ,目的蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变IPTG的浓度和诱导时间 ,确定了表达EⅢ 蛋白的最佳诱导条件 :IPTG终浓度为 0 1mmol·L-1,诱导时间为 3h。在大肠杆菌中的最高表达量占菌体总蛋白的 5 4 9%。Western blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。利用纯化的表达产物作抗原包被酶标板 ,可以明显地区分JEV阴、阳性血清 ,并且不与猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒的阳性血清发生反应。结论 :重组JEVEⅢ 蛋白可以用于检测猪血清中JEV抗体水平。     

蜱传脑炎病毒的传播和防控

蜱传脑炎流行区域扩大,发病率不断上升,因其人畜共患性备受重视。主要宿主是蜱虫、啮齿动物和食虫动物,一些反刍动物也可能感染,如山羊和绵羊,犬和马属于易感动物。目前尚无有效的治疗方法,只能在蜱传脑炎流行地区推广疫苗接种和综合措施进行防控。该文对蜱传脑炎病毒的传播方式、临床症状、诊断方式及疫苗等综合防控措施进行简要概括,以期为相关研究提供参照。     

构建表达猪瘟病毒E0基因的重组杆状病毒

为了得到可溶性重组猪瘟病毒E0蛋白并便于观察重组蛋白的表达情况,将增强型水母绿色荧光蛋白基因(EGFP)与E0基因相连插入昆虫杆状病毒转移载体中,与线性杆状病毒DNA共转染Sf9细胞后通过噬斑纯化得到纯的重组杆状病毒,将其感染Sf9细胞制备P1种子液,同时用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况,剔除表达效果差的重组杆状病毒。再用P1种子液感染Sf9细胞制备高效价的P2种子液。通过病毒液的梯度稀释和噬斑测定,确定P2种子液的病毒滴度达1.14×107pfu/mL。将P2种子液以MOI 5~10接种指数期Sf9细胞,3 d后呈现出最强的荧光。重组杆状病毒在Sf9细胞中的初步成功表达为进一步制备重组E0糖蛋白,研究E0蛋白的结构与功能、免疫诊断新方法和猪瘟基因工程疫苗奠定基础。     

森林脑炎病毒E基因DomainⅢ段的克隆表达及鉴定

从森林脑炎病毒森张株的细胞培养液中提取总RNA,通过RT-PCR扩增E蛋白基因DomainⅢ段,克隆入原核表达载体GSTpET-30a(+)中,构建重组原核表达质粒,用IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化后,进行Western blot鉴定,并用针对不同病毒的兔免疫血清验证其检测特异性。重组原核表达质粒GSTpET-30a-ED3经酶切证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约为41 kD,主要以包涵体的形式表达,并可与TBE阳性兔免疫血清特异性反应。结果表明:成功克隆了森林脑炎病毒森张株E蛋白基因DomainⅢ段,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,获得的ED3蛋白质具有良好的特异性。     

新城疫病毒(NDV)HN基因真核表达重组质粒的构建

应用一对自行设计的引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得新城疫病毒(NDV)Lasota株的血凝素神经氨酸酶(HN)基因片段,其长度约为1.7 kb,与已报道的NDV-HN基因片段大小一致.再将该HN基因片段定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经酶切和测序鉴定,表明构建的重组质粒含有NDV-HN基因片段.     

Myo5a特异性片段原核表达重组质粒的构建

为了构建Myo5a特异性片段的原核表达重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a,采用PCR扩增出Myo5a基因特异性片段的蛋白编码序列,经BamH I和Xho I双酶切后,将片段插入原核表达载体pGEX-4T-3,构建重组子PGEX-4T-3/Myo5a。最后重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a经鉴定完全正确。     

乙型脑炎病毒E基因在杆状病毒中的表达

利用PCR方法扩增日本乙型脑炎病毒(JEV)E全长基因,然后将其克隆到杆状病毒转座载体pBac-SC中,筛选重组质粒pBacSC-E,再转化入含有穿梭载体的感受态细胞DH10Bac,经抗性及蓝白斑筛选得到含E基因的重组杆状病毒DNA,以脂质体介导法将此重组杆状病毒DNA转染Sf9昆虫细胞,从而获得重组杆状病毒。用此重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,经Western-blot检测表明,E基因在昆虫细胞中获得表达,表达蛋白的分子量约53 ku,与预期结果大小一致,且能与日本乙型脑炎阳性血清发生特异性反应,这为进一步研究JEV亚单位疫苗和诊断抗原奠定了基础。     

新城疫病毒HN基因片段原核表达重组质粒的构建

根据GenBank中发表的新城疫病毒F48E9基因序列设计引物,采用RT-PCR技术,成功获得了该病毒HN基因中两个不交叉的基因片段,长度分别为790bp和579bp.将这两段基因分别克隆到pGEM-T vector中,经酶切鉴定和测序后克隆到原核表达栽体pET-28a,PCR和酶切鉴定表明,克隆的两个新城疫病毒基因片段已经正确地插入到了原核表达载体pET-28a之中.     

猪瘟病毒E2基因的克隆表达

PCR扩增猪瘟病毒(CSFV)定点突变后的E2基因,克隆至原核表达载体质粒pET-28a中,重组质粒pET28a-E2转化BL21(DE3),IPTG诱导,高效表达了E2基因,表达量达菌体总蛋白的25.3%。免疫印迹表明,所表达的蛋白是CSFV特异性的。     

猪日本乙型脑炎病毒NS5原核表达和多克隆抗体制备

提取猪日本乙型脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,扩增JEV-NS5基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS5,转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组JEV-NS5蛋白,获得分子质量为103 ku的重组蛋白.该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的35%以上,His-band Ni+纯化后,获得高纯度重组蛋白占总蛋白的比例达75%以上.以纯化的蛋白免疫小鼠,制备小鼠抗JEV-NS5抗体,抗体效价达到3×104,并能与病毒感染的样本反应,证明该蛋白具有较好的特异性.     

猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。     

牛粘膜病病毒E1基因的克隆及原核表达

参考BVDVVEDEVAC株的基因组序列及E2基因的测序结果设计一对引物,扩增出预期585 bp的目的片段。扩增产物克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列VEDE-VAC株比较,二者的核苷酸同源性为100%,推导氨基酸同源性为100%。测序结果经同源性比较,克隆得到的基因与VEDEVAC株同源性最高。系统发生树分析推测E1基因与VEDEVAC株在进化上比较接近。将E1基因定向亚克隆到表达载体pGEX-6p-1中,对阳性重组质粒转化的大肠杆菌BL21进行诱导,E1基因获得了成功表达。     

基于Iclp的拟态弧菌OmpUAP真核表达重组质粒的构建及其免疫效果初步评价

为了探明鱼类恒定链类似蛋白(Iclp)能否作为免疫载体,提高基因疫苗的免疫效果,以拟态弧菌OmpU蛋白的黏附功能域(OmpU_(AP))为疫苗靶点,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-OmpU_(AP)和基于草鱼Iclp的pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)。用2种真核表达重组质粒分别免疫草金鱼,同时设置空质粒pcDNA3.1(+)对照组与PBS对照组。于免疫后不同时间(7、14、21、28和35 d)采用PCR和RT-PCR方法检测重组质粒在鱼体不同组织中的分布与转录水平的表达情况,使用双抗体夹心ELISA检测血清抗体水平,并于免疫后第35天进行攻毒保护性实验,检测其免疫保护率。结果显示,免疫后第7天在肌肉、鳃、头肾、肝脏和脾脏中均有重组质粒分布,并在35 d内持续表达。pcDNA-OmpU_(AP)免疫组草金鱼的血清抗体水平缓慢上升,除第21天外,其余检测时间点的抗体水平与空质粒对照组无显著差异。pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)免疫组草金鱼在免疫后7 d即有血清抗体产生,随着免疫时间延长,抗体水平不断上升,至28 d达到峰值,随后抗体水平开始下降;除第7天外,其余各检测时间点的血清抗体水平均显著或极显著高于pcDNA3.1-OmpU_(AP)免疫组与空质粒对照组。攻毒后pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)和pcDNA-OmpU_(AP)免疫组草金鱼的相对免疫保护率为别为46.7%和20%,而空质粒对照组和PBS对照组的实验鱼全部发生死亡。表明Iclp可以作为免疫载体,提高鱼类基因疫苗的免疫效果。     

烟草环斑病毒外壳蛋白基因片段原核表达载体的构建及表达

根据烟草环斑病毒外壳蛋白(TRSV-CP)基因的保守序列设计引物,采用RT-PCR方法,获得烟草环斑病毒基因组中编码外壳蛋白部分基因片段,将其插入原核表达载体pET28a中,获得重组表达质粒pET-CP,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导蛋白大量表达.重组蛋白经过Ni -NTA纯化后,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,TRSV-CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,产生的融合蛋白分子质量约为34ku,并具有免疫学活性.以纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,多抗血清效价达1:409600,可以与重组蛋白发生抗原抗体反应.     

大肠杆菌VT噬菌体受体基因重组质粒的构建

取含有卡那霉素抗性（Kan^R)基因的自杀性质粒pJP55603和含vpr全长基因的pUC19phiΦRID质粒，分别采用粘性末端及平末端两种连接法，2种质粒Hinc II单酶切后进行平末端连接，经鉴定未得到重组质粒，pJP5603用Hinc II和Xma I消化，回收3kb的载体质粒，pUC19ΦRID用Hinc Ⅱ和Age I消化，回收778bp vpr目的基因，通过粘性末端连接，转化到感受态细菌CC118λpir，利用Kan^R进行筛选，获得的克隆经Acc I酶切鉴定和PCR检测，确定得到重质粒，即pYYvpr，将重组质粒的DNA转化到含有全长vpr基因的感受态细胞MC1061，筛选到的克隆经PCR检测，得到一株克隆既扩增出vpr基因，又扩增出Kan^R基因，初步鉴定该克隆为MC1061的vpr同源基因突变株，暂定名为MC1061Δvpr，从而为研究vpr基因的功能提供了重要的试验材料。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因杆状病毒/昆虫细胞表达系统重组质粒的构建

用限制性内切酶从克隆质粒pUC—s中回收猪传染性胃肠炎病毒中国分离株,TH-98株完整的病毒保护性抗原基因,即S基因。按照预定的阅读框架,将S基因克隆于供体质粒pFASTBACHTb的EcoRI、PstI多克隆位点上,并进行酶切鉴定,得到阳性重组质粒BAC—S。用DH10BAC对BAC—S进行转位,获得重组质粒pBAC—S。根据S基因酶切位点分析结果及杆状病毒(Bac-ulovirus)转位区结构特点,用相应的限制性内切酶进行酶切鉴定,并用特异性和通用引物进行PCR分析,证明该重组质粒为含有TH-98株完整S基因的可直接在昆虫细胞进行表达的感染性重组质粒。     

水疱性口炎病毒N基因原核表达载体的构建及表达

针对水疱性口炎病毒(VSV)N基因设计特异性引物,在引物中分别加入EcoR 和Xho 酶切位点。RT-PCR扩增后得到目的基因,将其克隆到表达载体pET30c,连接产物转化于DH5α菌株,在含Kan+的平板上37℃培养24h,然后挑取白色菌落,鉴定为阳性者,转化于BL21菌株,再经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导获得高效表达。表达融合蛋白分子质量为53ku(目的蛋白大约47ku),同预期蛋白大小相近。Westernblot检测表明,其能与本病毒阳性血清发生特异性反应,表达蛋白有望成为有价值的VSV诊断抗原。     

禽流感病毒PA基因的原核表达载体的构建及鉴定

以重组质粒pcDNA-PA为模板扩增PA全基因,并构建原核表达载体pGEX-6p-1-PA。根据GenBank公开发表的禽流感病毒PA基因的序列设计引物,用PCR方法从重组质粒pcDNA-PA中扩增禽流感病毒的PA基因,将该基因定向插入到原核表达载体pGEX-6p-1中,然后将连接产物转化宿主菌DH5α,挑取阳性克隆进行PCR和BamHⅠ、NotⅠ双酶切鉴定并测序。测序结果表明,禽流感病毒PA基因全长2151 bp,编码717个氨基酸,原核表达载体pGEX-6p-1-PA已构建成功。从而为禽流感蛋白PA的表达及其多克隆抗体的制备奠定了基础。