半滑舌鳎生长相关的微卫星标记及优势基因型

本研究利用SPSS 19.0的GLM模型分析28个微卫星标记与半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis生长性状的相关性,结果获得14个与半滑舌鳎体质量(BWe)、体长(BL)或体宽(BWi)显著相关的微卫星标记。与雄性个体生长性状显著相关的7个标记中,cse56与体质量、体长和体宽3个性状均显著相关(P0.05);csou24、hncyse68、hncyse147和hncyse148与体质量和体宽显著相关(P0.05)。与雌性个体生长性状显著相关的10个标记中,cse151和csou56与3个性状均显著相关(P0.05);csou33、csou39和hncyse108等5个标记与其中2个性状显著相关(P0.05)。csou24、hncyse147和hncyse148在雄、雌群体中均表现出与生长性状的相关性。本研究共筛选出17个对雄性个体生长具有显著正面影响的优势基因型,29个雌性个体的优势基因型。     

半滑舌鳎微卫星标记遗传连锁图谱的构建

利用全基因组测序方法筛选出微卫星标记,以渤海近海野生个体和人工养殖的半滑舌鳎(Cynoglossus semi-laevis)为亲本交配产生的F1全同胞家系为作图群体,构建了半滑舌鳎雌、雄微卫星标记遗传连锁图谱。用320对引物对父母本和92个F1个体进行遗传分析,共得到288个分离标记,其中包含112个偏分离标记(P<0.05)。其中雌性框架图包含242个标记,分布在21个连锁群上,总长度1 311.9 cM,标记间平均距离为4.9 cM,图谱覆盖率为83.3%;雄性框架图定位标记218个,21个连锁群,总长度1 316.2 cM,标记间平均距离为5.5 cM,覆盖率为82%。半滑舌鳎遗传连锁图谱的构建为半滑舌鳎重要经济性状QTL定位、分子标记辅助育种和性别控制奠定了重要基础。     

半滑舌鳎生长相关基因的微卫星及其在种群遗传结构分析中的应用

利用在生长激素(GH)、生长激素释放激素(GHRH)和垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)基因中发现的7个微卫星位点,分析了半滑舌鳎两个野生群体(渤海群体和黄海群体)和1个养殖群体间以及各群体内雌雄个体间的遗传多态性差异。结果表明,7个位点中有4个位点表现出多态性,在3个群体中的等位基因数的分布范围为2～37,平均为9.5;有效等位基因数分布范围为2～28.9,平均为8.4。各位点的平均观测杂合度、平均期望杂合度和平均多态信息含量分布范围分别为0.5145～0.7738、0.5690～0.8671和0.4829～0.8314。群体间的成对FST值及个体分配分析的结果表明,半滑舌鳎野生群体和养殖群体之间存在显著性遗传差异,而在两个野生群体之间差异不显著。此外,等位基因分布和双倍体基因型分布的差异性检测结果表明,这4个多态性位点在3个群体的雌、雄性别间均不存在显著性差异。     

半滑舌鳎的耗氧率与盐度和体重的关系

就盐度和体重对半滑舌鳎耗氧率的影响进行了初步研究。结果表明,在各个试验盐度梯度下,半滑舌鳎的耗氧量和耗氧率与体重(W)之间的关系可用幂函数Q=aW~b表示,其中,耗氧量与体重呈正相关,耗氧率与体重呈负相关。方差分析表明,盐度和体重对半滑舌鳎的耗氧量和耗氧率均有极显著的影响(P<0.01);不同规格半滑舌鳎耗氧率的最高值均出现在同一盐度组,最低值则因体重不同而出现在不同的盐度组。     

半滑舌鳎抗哈维氏弧菌病相关微卫星标记筛选及QTL定位

为了筛选出与抗哈维氏弧菌病相关的微卫星标记并进行QTL定位,以2014年感染实验中存活率为52.22%的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)家系F1412(Family+年份+家系号)为材料,采用混合分离子分析法(bulked segregant analysis,BSA)对169个微卫星标记(SSR)进行筛选,得到1个可能与哈维氏弧菌病相关的微卫星标记scaffold479_23523。用scaffold479_23523所在的连锁群LG18上的37个SSR对94尾抗病、感病个体进行基因分型,得到3个图谱:整合图谱(LG18)、雌性图谱(LG18F)和雄性图谱(LG18M),并用两种不同的模式进行单标记分析和QTL定位。模式一得到3个显著性相关标记(P0.05)和1个极显著性相关标记(P0.01),图谱LG18F定位出一个区间qE-F1;模式二得到4个显著相关标记(P0.05)和1个极显著相关标记(P0.01),图谱LG18M定位出两个区间qE-M1、qE-M2。在全基因组序列的分布范围上,区间qE-F1包含了qE-M1及qE-M2,因此qE-F1更可能与抗病性状相关。本研究开发出了抗哈维氏弧菌病性状相关微卫星标记及QTL区间,为抗病新品种的培育奠定了基础。     

半滑舌鳎养殖群体和减数分裂雌核发育群体的微卫星标记遗传多样性分析

利用24对微卫星分子标记对半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis的养殖群体和减数分裂雌核发育群体进行遗传多样性分析。结果表明,两个半滑舌鳎群体平均等位基因数分别为7.0和4.8,平均有效等位基因数分别为3.935和2.411,平均观测杂合度(HO)分别为0.713 5和0.586 5,养殖群体的遗传多样性明显高于减数分裂雌核发育群体。有1个位点在养殖群体中偏离哈代-温伯格平衡,13个位点在减数分裂雌核发育群体中偏离哈代-温伯格平衡。群体间基因分化系数(GST)为0.093 6,遗传距离为0.420 0,表明两群体间遗传分化显著。     

半滑舌鳎精子冷冻保存

半滑舌鳎精子冷冻保存对于人工繁殖育苗、杂交育种、雌核发育及其性别控制研究具有重要的意义,为此,本文对半滑舌鳎精子冷冻保存方法进行了研究。分别利用2．8mol／L的二甲基亚砜（DMSO）、甘油（Gly）和1,2-丙二醇（PG）冷冻保存该鱼精子。结果显示,DMSO冷冻保存精子的活力较高。利用MPRS＋2．8mol／L DMSO以1：0．5、1：1、1：1．5和1：2的比例稀释并冷冻精子,1：1比例在冻前能够抑制精子的运动,冻后活力可达82．50±3．54％,显著高于其他稀释比例（P〈0．05）。分别利用冷冻保存液A（MPRS＋2．8mol／L DMSO）和B（TS-2＋2．8mol／LDMSO）稀释平衡精子,精子在A中的冻前快速运动时间、寿命分别为37．75±6．45S和145．00±78．98S,与鲜精无显著差异（P〉0．05）。利用以上两种冷冻稀释液冷冻保存精子,精子在A液中的冻后活力和寿命分别可达53．50±6．69％和98．00±13．51s,冷冻效果优于B液（P〈0．05）。冷冻后精子的受精率和孵化率分别为55．00±5．00％和35．00±13．23％,受精率与鲜精无显著性差异（P〉0．05）,因此认为MPRS＋2．8mol／L DMSO可用于半滑舌鳎精子的冷冻保存。     

半滑舌鳎土池养殖试验

2006年6月,从山东引进半滑舌鳎鱼苗950尾于面积0.2 hm2的单养池塘进行试养.经过8个月的养殖,至2007年2月,共捕获半滑舌鳎810尾,起捕率85%,最大舌鳎鱼体长达到36 cm,体质量405 g,平均体长30.5 cm,体质量340 g.试验过程中发现在33 ℃高温和10 ℃的低温季节,半滑舌鳎均可生长,月平均增长率甚至高达28%,在此温度范围内,半滑舌鳎的生长与温度的相关关系不显著;但对温度快速下降的耐受性较差,易钻泥导致窒息死亡.     

半滑舌鳎微卫星标记的开发及其在F1家系中分离方式分析

利用富集文库-菌落原位杂交的方法筛选半滑舌鳎( Cynoglossus semilaevis)微卫星标记,构建富含(AC)和(AG)序列重复的半滑舌鳎微卫星富集文库,随机从文库中挑选1060个克隆,筛选得到883个(83.3％)阳性信号,菌落PCR检测742个阳性克隆片段的长度在500～1 200 bp范围内,随机挑选其中50个克隆进行测序,共设计引物33对,进行退火温度优化、多态性检测后,共得到20个多态的半滑舌鳎微卫星标记.对其进行分离方式分析,其中有17个位点符合孟德尔分离定律,共表现5种分离方式,可用于半滑舌鳎遗传连锁图谱的构建;另外有3个位点偏离孟德尔分离定律(P＜0.05).结果同时证明富集文库-菌落原位杂交是半滑舌鳎微卫星标记大量筛选和高密度遗传连锁图谱构建的一种行之有效的方法.     

不同规格半滑舌鳎的生长比较

将330日龄的大规格[平均体长(24.4±2.1) cm、平均体质量(93±5.3) g]、小规格[平均体长(18.2±1.1) cm、平均体质量(34±2.5) g]半滑舌鳎分别饲养在2个4 m^3水槽中;550日龄后,置于4个4 m^3水槽内培育,密度为15～30尾/m^2;900日龄后置于4个30 m^3水泥池内培育,密度为3～8尾/m^2。每2～3个月测量1次体长和体质量,研究不同规格半滑舌鳎在工厂化养殖条件下的生长。3年的养殖试验表明,随着养殖时间的延长,两个群体的生长差异变大,大、小规格群体的平均体长比值由1.3增至1.6,平均体质量比值由2.7增至5.3,大规格群体(全长51.3～66.4 cm)中95%以上为雌性;半滑舌鳎的快速生长期为698～1081日龄阶段,适宜生长水温为14.6～26.9℃。本试验结果将为半滑舌鳎的工厂化养殖提供参考。     

半滑舌鳎颗粒酶B基因的克隆和表达分析

颗粒酶(granzyme, Gzm) B是免疫炎症反应必不可少的介质,可激活半胱天冬酶3,进而诱导靶细胞的凋亡。本研究通过PCR扩增和RACE技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)颗粒酶B基因(CsGzmBl)的全长cDNA序列,并对其序列特征和表达水平进行了分析。结果显示,CsGzmBl cDNA全长为923 bp,开放阅读框长度为780 bp,编码259个氨基酸(前19个氨基酸残基为信号肽序列),5′非编码区为49 bp,3′非编码区为94 bp。CsGzmBl的基因组结构比较保守,由5个外显子和4个内含子组成。CsGzmBl蛋白包含2个N端糖基化位点、1个催化三联体“His63Asp112Ser207”、1个“PHSRPYMA”结构域及6个保守的半胱氨酸。荧光定量PCR结果显示,CsGzmBl在半滑舌鳎健康成鱼不同组织中均有表达,其中,在脾脏中表达量最高,头肾、中肾、肝脏和鳃中表达量次之,在肌肉中表达量最低。与对照组0 h相比,CsGzmBl在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染后的不同时间点的脾脏、肠、肝脏、皮肤、鳃和肾脏中的表达水平均有不同程度的上调。研究表明,CsGzmBl基因在半滑舌鳎抵御哈维氏弧菌感染过程中发挥重要作用。     

半滑舌鳎Dmrt4基因DNA全序列的克隆与表达分析

克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Dmrt4基因DNA全序列,得到的序列长度为2271 bp,包含1个内含子,2个外显子,与其他鱼类的同源性在90%以上.Dmrt4基因在雌性和雄性半滑舌鳎的7个组织中都有表达,有差异表达的组织是脑、垂体和性腺,雄性的表达显著高于雌性(P<0.05).高温处理组的伪雄鱼中Dmrt4基因的表达与对照组的雌鱼没有显著差异(P>0.05),但是甲基睾酮处理组的雄鱼和伪雄鱼的表达显著高于对照组的雌鱼和雄鱼(P<0.05).Dmrt4基因的表达在胚胎发育过程中呈现先升高后降低的趋势,在原肠期表达量最高,显著高于其他几个时期(P<0.05),从尾芽形成期开始恢复到多细胞期的表达水平,之后几个时期 Dmrt4基因的表达无显著变化(P>0.05),一直到出膜前保持恒定.研究表明, Dmrt4基因是雄性中优势表达的基因,并且受雄性基激素调节,但并不是性反转的必要因素.这一研究为半滑舌鳎全雌群体的建立提供了分子水平的研究基础.     

Artificial gynogenesis in Cynoglossus semilaevis with homologous sperm and its verification using microsatellite markers

Effective methods for induction of gynogenetic diploids in Cynoglossus semilaevis are needed to initiate monosex culture. An effective protocol to induce half‐smooth tongue sole gynogenesis using homologous sperm was developed in this study. A UV dose of 50 mJ cm^?2 was found to be the most effective for genetic inactivation of tongue sole sperm. Treatment optima for cold shocks were 5 °C for 20–23 min at 5 min after fertilization and the hatching rate of gynogenetic diploids was 10.0%. Microsatellite analysis at locus Csou 6 revealed that there was no genetic contribution from the paternal genome in 24 progenies of a meiotic gynogenetic family. Polymerase chain reaction demonstrated that only four individuals of 24 meiotic gynogenetic diploids produced the female‐specific band of about 205 bp. The female/male ratio of gynogenetic diploids was significantly different from the theoretical ratio of 1:1. It is possible that there are some recessive lethal genes in W chromosome.     

半滑舌鳎不同家系肌肉中脂肪酸含量的分析

为了研究半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)不同家系肌肉中脂肪酸的组成与含量,并选育出高营养品系的半滑舌鳎家系,用气相色谱法对同一养殖环境中的半滑舌鳎15个不同家系(164个样本)肌肉中的脂肪酸的组成和含量进行了检测和比较分析,同时对高EPA、DHA、EPA+DHA含量的家系进行筛选,并研究了半滑舌鳎性别与EPA、DHA含量的关系。结果表明:(1)15个家系肌肉中脂肪酸种类没有区别,但脂肪酸的组成和含量存在若干差异。其特征均为多不饱和脂肪酸(PUFA)饱和脂肪酸(SFA)单不饱和脂肪酸(MUFA)。PUFA以ω-3系脂肪酸为主,且ω-3系脂肪酸与ω-6系脂肪酸比值达到4.16~5.03,其中的2种重要ω-3系脂肪酸EPA和DHA在15个家系中均具有显著性差异,且DHA含量远大于EPA含量;筛选出了3个高EPA、DHA、EPA+DHA含量家系,分别为F13012、F13023及F13031。(2)EPA的含量与半滑舌鳎性别不具有显著性相关关系。本研究对于选育半滑舌鳎优良品种家系具有重要意义。     

镜鲤微卫星标记与体形性状的关联分析

应用荧光标记的通用引物法,利用100对微卫星标记对高背镜鲤(Cyprinus carpio L.)和低背镜鲤杂交所得F1190个个体的基因组DNA进行分型。利用SPSS软件对100个微卫星标记与鲤的体长、体高、体厚、头长、尾柄长及尾柄高等体形性状进行相关性分析,结果显示有22个微卫星座位与体长、体高、体厚等体形性状显著性相关(P<0.05)。其中CAFS110、CAFS159、CAFS624、CAFS907、CAFS2320、CAFS2321、HLJE319与体长,CAFS254、CAFS1119、HLJE310与体高,CAFS159、CAFS907、CAFS1119、CAFS1737、CAFS2137、CAFS2317与体厚,CAFS100、CAFS679、CAFS907、CAFS1119、HLJE319与头长,CAFS165、CAFS175、CAFS907、CAFS1127、CAFS1491、CAFS2322、HLJE284与尾柄长,CAFS907、CAFS1119、CAFS2137、CAFS2317、HLJE141与尾柄高的相关性达到显著水平(P<0.05)。这些标记将有助于镜鲤分子辅助育种的研究。     

半滑舌鳎生物钟相关基因克隆及在卵巢发育成熟过程中表达特征分析

为阐明生物钟相关基因在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵巢成熟过程中的作用及机制,采集性成熟半滑舌鳎不同发育期的卵巢组织提取总RNA,通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对5个核心生物钟基因Clock1a、Bmal1a、Cry1a、Cry2和Per2的编码区(CDS)序列进行克隆和序列分析。结果显示,Clock1a的CDS序列编码712个氨基酸,序列中有功能性结构域PASD1和PAS11。Bmal1a的CDS序列编码626个氨基酸,序列中有功能性结构域PASD3和PAS11。Cry1a和Cry2的CDS序列分别编码631个、669个氨基酸,序列中均有功能性结构域FAD7。Per2的CDS序列编码1 415个氨基酸,序列中有功能性结构域PeriodC和PAS11。通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析5个生物钟基因mRNA在性成熟半滑舌鳎卵巢不同发育期的表达特性,发现5个生物钟基因存在性腺发育周年表达规律,且在卵巢Ⅱ期和Ⅲ期相对高表达(P<0.05),在卵巢Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ期相对低表达,这说明生物钟基因对半滑舌鳎的卵巢发育成熟起到重要的调节作用。研究结果为进一步探究生物钟基因调控半滑舌鳎卵巢发育成熟的机制提供了重要参考,为提高半滑舌鳎的繁育效率提供了理论基础。     

半滑舌鳎CD40基因克隆及其免疫功能分析

本研究通过RACE技术在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中克隆得到1个CD40同源基因。该基因c DNA全长为2098 bp,开放阅读框为1011 bp,可编码由336个氨基酸组成的蛋白质。推导得到的CD40氨基酸序列包含1个信号肽、1个跨膜结构区、2个N-糖基化位点以及含4个富含半胱氨酸的保守结构区。不同物种氨基酸序列同源分析结果显示,该基因与哺乳类、两栖类以及硬骨鱼类相似性为28%~47%,其中与硬骨鱼类相似性较高。系统进化分析结果显示,半滑舌鳎CD40与其他硬骨鱼类CD40聚类为一支,哺乳类与两栖类CD40聚类为另一支。荧光定量PCR结果显示,CD40在健康半滑舌鳎不同组织中均有表达,其中在鳃、肝和脾等组织中表达量较高,在肠、肌肉和皮肤中表达量较低,在脑和肾中微量表达。经哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染刺激后,与PBS处理的对照组相比,该基因m RNA在半滑舌鳎3个主要免疫组织(肝、脾和肾)中表达量均呈显著性升高,在肝中12 h到达峰值,在脾和肾中6 h达到峰值。上述结果表明CD40基因参与了半滑舌鳎抵抗哈维氏弧菌的免疫应答反应。