基于卡那霉素浸种萌发的转基因棉花后代的快速筛选

为了对转基因棉花后代进行快速有效的筛选,本研究利用Kan溶液在培养皿上对转基因棉花后代种子进行浸种萌发以及幼苗培养后的鉴定研究。结果表明,经过80 mg/L的Kan溶液浸种萌发及幼苗培养后,与非转基因棉花种子相比阳性转基因棉花种子萌发后下胚轴伸长较快、幼苗子叶无黄色斑块,并且根系正常生长。该形态筛选结果与PCR鉴定基本一致,因此利用Kan溶液浸种萌发法能够简便、快速、大量地筛选出阳性转基因棉花植株。     

卡那霉素叶片涂抹法田间筛选转基因苜蓿的研究

以田间生长的苜蓿为材料进行Kan涂抹叶片筛选转基因植株最佳浓度和适宜观察时间的研究,并对筛选的抗性植株进行了PCR检测验证。结果表明,Kan叶片涂抹田间筛选的最佳浓度为1000mg/L,观察时间以12d为宜;经PCR检测验证,Kan筛选抗性苗的阳性检测率达到93.8%。研究建立了一种在田间对转基因苜蓿进行大量筛选的简便方法,对于转基因苜蓿材料的选育具有重要利用价值。     

高品质转野生荠菜凝集素基因棉花的获得

利用花粉管通道转基因技术,将DE35S启动子驱动的野生荠菜凝集素(WSA)基因导入10个高品质棉花品种(系)。所使用的转基因表达载体还含有选择标记基因NPTⅡ(卡那霉素抗性基因)和Ω序列,以利于转基因植株的筛选以及WSA基因的高效表达。对转化当代3197棵棉苗的检测结果表明,4.88%植株具有卡那霉素抗性(Kan )。根据野生荠菜凝集素基因序列设计一对特异性引物,对156个Kan 植株进行PCR检测,筛选出45个转WSA基因棉花工程植株。45个株系纤维品质测定结果表明,获得了9个高品质转WSA基因棉花株系。并对植物基因工程研究中以NPTⅡ作为标记基因的局限性以及一些转WSA基因棉花株系纤维强度变劣的原因进行了探讨。     

转基因抗虫棉种子室内筛选

为了对转基因抗虫棉后代进行简单、快速、准确地鉴定和筛选，利用 Bt-CryI Ab/Ac 试纸条法、硫酸卡那霉素浸种法对转基因和非转基因棉花种子进行鉴定和筛选。结果表明：3 种不同品牌的转基因试纸条检测结果完全一致，均能快速、准确地检测出转基因和非转基因棉花种子。利用 5000mg/L 的硫酸卡那霉素将棉花种子浸泡 48h 并持续培养 10d，通过观察棉花种子的发芽率及侧根生长情况也可有效筛选出转基因抗虫棉，但此种方法较试纸条法检测周期长，而且存在试验误差，影响试验准确率。因此，转基因试纸条法是一种更为快速、简单、准确的鉴定和筛选转基因抗虫棉植株的方法。     

转基因棉花的田间筛选技术研究

利用不同浓度的卡那霉素对棉花叶片进行处理,较为系统地研究了棉花不同品种、不同叶位、不同生育时期内叶片对卡那霉素处理的反应。在此基础上建立了一种在田间对转基因棉花进行筛选的简便方法。研究表明,在棉花花铃期以前,利用5000～7500mg,L-1卡那霉素对转基因棉花新展开的倒1叶和倒2叶进行检测,能够有效筛选出带有卡那霉素标记基因的转基因后代,这对于转基因棉花材料的选育有较大的利用价值。     

利用卡那霉素浸种法鉴定抗虫棉

卡那霉素浸种是一种简单、方便的转基因抗虫棉间接鉴定技术.本实验以不同浓度卡那霉素溶液、采用不同浸泡时间处理棉花种子,研究转基因抗虫棉与非转基因棉花在发芽率、根系生长、子叶颜色等生理指标方面的变化.结果表明,卡那霉素浓度为4000mg/kg时将棉花种子浸泡48h可有效筛选出转基因抗虫棉.     

农杆菌介导海岛棉转化体系优化的研究

为建立高效规模化棉花转基因技术体系,解决棉花转化率受基因型限制、转化效率低以及转化苗畸形率高等问题。以棉花胚性愈伤组织作为受体,用农杆菌介导法将Bt基因导入海岛棉棉花品种‘新海16号’,在提高海岛棉遗传转化效率的同时,建立了相对高效地转基因再生植株成苗技术体系。结果表明：分3次依次继代于具头孢霉素浓度梯度的抗性愈伤增殖培养基,较3次均继代于含500 mg/L头孢霉素(Cef)的抗性愈伤增殖培养基MS₂,抗性愈伤增殖速度较快。且60天添加1次50 mg/L Kan时,转化苗成苗率达到最大值。降低NH₄⁺/NO₃^-水平对提高体胚发生率具有有效促进作用。选择继代90天后的愈伤组织,胚状体诱导率可达到最大值;继代180天以上的愈伤组织可以摒弃。经转化后所获的子叶畸形胚,具有较强再生能力,其产生的次生胚经再次培育出正常转基因植株这一途径可有效缩短转化周期。     

转外源法呢基焦磷酸合酶基因烟草抗赤星病研究

将已克隆的薄荷（Mentha spicata L.）法呢基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase, fps）的cDNA插入载体,构建CaMV35S启动子驱动下的植物表达载体pBinARfps。用捕获该质粒的根癌农杆菌菌株LBA4404与烟草叶片外植体共培养,并在附加30 mg/L Kan的MS＋0.1 mg/L IAA＋1.5 mg/L BA培养基上诱导植株分化,再生芽在附加30 mg/L Kan的MS培养基上生根,再生植株。Kan阳性植株经PCR-Southern检测筛选,得到5株PCR阳性植株（K-4,K-6,K-17,K-19,K-35）,证明外源fps基因在烟草基因组中的整合;Northern blot检测证明外源fps基因在转录水平进行了表达;离体叶片接种实验表明,转基因植株（T₁代）对赤星病抗性明显提高。这表明fps基因在植物抗病基因工程中具有潜在应用价值。     

影响农杆菌介导的小麦遗传转化条件的研究

利用小麦成熟胚愈伤组织的高效再生体系,对影响农杆菌介导的小麦遗传转化条件:预培养时间、共培养时间、抗生素(Kan)筛选压、头抱霉素浓度、菌液浓度和侵染时间等进行了研究。最后确立的转化条件为:预培养时间为1～2d,共培养时间为3d,Kan筛选压为100mg/L,头孢霉素所用浓度500mg/L,当菌液浓度OD600=0.6浸染45min。并对得到的再生植株进行了PCR检测,初步证实了目的基因转到了小麦基因组中。     

抗除草剂转基因玉米快速有效鉴定方法的建立

以含草铵膦乙酰转移酶基因(phosphinothricin acetyl transferase gene,bar)为筛选标记的抗除草剂转基因玉米为研究材料,通过叶片喷雾法和叶片离体平板培养法试验,建立快速有效鉴定转基因玉米的方法,并探索可有效区分转化和非转化植株的筛选剂剂量。研究结果表明:这两种方法都能快速、有效、方便地鉴定抗除草剂转基因玉米;2000mg/L草铵膦叶片喷雾和培养基中含有5mg/L草铵膦叶片离体培养可快速有效区分是否转入bar基因。通过Bar试纸条分子检测法验证了该鉴定方法的准确性。该鉴定方法的建立为快速有效的筛选大量转基因材料节约大量时间和经费。本研究建立的鉴定方法在转基因材料鉴定和转基因安全评估中具有重要意义。     

转RRM2和ACO2-E6基因棉花冠层特征和光合特性与产量形成的关系

为探明转基因棉花产量形成关键期的生理机制,2014―2015年以转RRM2基因棉花及其亲本中棉所12(CK1)、转ACO2-E6基因棉花及其亲本中棉所24(CK2)为材料,研究冠层特征、光合特性等与转基因棉花产量形成的关系,分析比较转基因棉花与亲本的生长发育、产量及其构成的差异。结果表明:转RRM2基因棉花的铃重、籽棉产量、皮棉产量、纤维上半部平均长度和断裂比强度均高于或显著高于中棉所12。转ACO2-E6基因棉花的衣分、籽棉产量、皮棉产量、纤维上半部平均长度和断裂比强度均高于或显著高于中棉所24。转基因棉花的籽棉产量与盛铃期的叶面积指数、光系统Ⅱ光化学量子产量、光系统Ⅱ最大光化学效率和可溶性总糖含量等分别呈显著的线性相关。转基因棉花的叶面积指数和可溶性总糖含量于产量形成关键期均高于或显著高于各自对照,且表现出较优的冠层结构以及较合理的源库比。     

转Bt基因棉花各组织器官对棉铃虫抗性的研究

用４个国内转基因棉花品系（９５－１,２５２７,９５－６０,纯抗）和１个美国转基因棉花品种（ＤＨ３）进行抗虫性试验。结果表明,棉花不同组织的抗虫性不同,花瓣,苞叶和顶端叶抗虫性最强;国内转基因棉花的４个品系和美国ＤＨ３的抗虫性强弱没有显著差异;转基因棉花的蛋白毒性在棉铃虫体内具有一定的残效。     

转新型抗草甘膦基因棉花的转化效率及相关分子特征分析

培育抗草甘膦除草剂棉花品种对棉花生产具有重要意义。利用农杆菌介导法获得了大量抗除草剂草甘膦棉花的再生植株,对其进行阳性检测。通过确定PCR检测目标条带大小、蛋白杂交条带大小分子特征,对65个独立转化事件在DNA水平、蛋白水平进行分析和筛选。结果表明,经PCR检测再生植株DNA得到的阳性率平均值为81.5%,经过蛋白检测后阳性率确定为55.4%,该类阳性植株即为外源基因正常表达的转基因植株。在此基础上,结合田间抗性检测,对其中9个株系进行了不同世代的选择,经过综合鉴定筛选,发现2个抗性优良的转基因株系具有极高的利用价值,其余还需进一步筛选鉴定。     

外源基因对棉花光合生产和分配的影响

对转双价基因(Cry1Ac CpTI)、转单价基因(Cry1Ac)抗虫棉以及常规棉3种基因型棉花光合产物生产和积累分配规律研究表明,3种基因型棉花光合速率峰值均出现在蕾期和花期,但峰值差异不显著。转基因棉花(单价和双价)花前光合产物积累量降低是生物学产量降低的主要原因;花后光合产物输出率提高是转基因棉花维持产量的主要因素。转基因棉花大量花后光合产物束缚在铃壳中导致转基因棉花铃重较低。在转基因棉花育种中,应加强花前光合产物积累量和花后光合产物棉铃有效利用率的选择。     

基因型差异对棉花光合产物生产和分配的影响及遗传改良研究

通过研究转双价基因(Cry1Ac CpTI)、转单价基因(Cry1Ac)抗虫棉以及常规棉三种基因型棉花光合产物生产和积累分配规律表明,三种基因型棉花光合速率峰值均出现在蕾期和花期,但峰值差异不显著。转基因棉花(单价和双价)花前光合产物积累量降低是生物学产量降低的主要原因;花后光合产物输出率提高是转基因棉花维持产量的主要因素。转基因棉花大量花后光合产物束缚在铃壳中导致转基因棉花铃重较低。在转基因棉花育种中应加强花前光合产物积累量和花后光合产物棉铃有效利用率的选择。     

施钾对不同转基因棉花品种光合特性及产量和品质的影响

 在田间试验条件下,研究了施钾对转Bt+CpTI基因抗虫棉中棉所41、转Bt基因抗虫棉国抗1号和常规棉泗棉3号光合特性和产量及品质的影响。结果表明,施用钾肥能不同程度地提高不同转基因棉花品种的叶绿素含量、叶面积指数(LAI)、叶片净光合速率(P_n)、气孔导度(G_s)、叶绿素荧光动力学参数PSⅡ、最大光化学量子效率(F_v/F_m)、PSⅡ潜在光化学活性(F_v/F_o),从而提高棉花叶片的光合性能。施钾还提高了转基因棉花干物质量及分配到生殖器官的比例,增加了棉花总成铃数、铃重和衣分;施钾处理的中棉所41、国抗1号和泗棉3号的皮棉产量较未施钾处理分别增加5.8%,11.8%和7.0%,棉纤维的主要品质指标也得到改善。转Bt基因抗虫棉国抗1号比转Bt+CpTI基因抗虫棉中棉所41和泗棉3号对钾肥更为敏感。     

转基因棉对棉蚜生长发育及其主要代谢物质含量的影响

近年来,转基因棉田非靶标害虫种群数量呈明显的上升趋势,棉蚜是转Bt(Bacillus thuringiensis)基因棉田发生危害较严重的非靶标刺吸性害虫之一.在实验室内,棉蚜分别用转Bt基因棉和亲本常规棉饲养40代以上,采用酶联免疫法( ELISA)检测转Bt基因棉SGK321上棉蚜体内的Bt蛋白含量,研究转Bt基因...     

南疆高产杂交棉生长性状及氮磷钾吸收模拟[

 依系统研究法研究高中低三种产量水平杂交棉生长和氮磷钾吸收。结果表明,高产棉的株高与中低产棉差别不大,但主茎增长比中低产棉提前结束,高产棉总铃数明显高于中低产棉,特别在铃位空间分布上更合理;高产棉花的氮磷钾吸收可用Logistic曲线方程表达,拟合良好,快增期、持续时间与中低产棉相比有明显差异,高产棉吸收的N、P₂O₅、K₂O总量为515.3、126.4和591.9 kg·hm^-2,大于中低产棉吸收总量;高产棉较中低产棉生长协调性更好,吸收养分总量多。说明南疆棉区在目前生产条件下,应用合理的管理技术措施,能够更有效协调棉花生长和养分分配,实现棉花大面积高产。     

3种转非抗虫基因棉花田间节肢动物群落的多样性和食物网结构

以转基因耐盐碱棉花、转基因抗病棉花和转基因抗旱棉花3种转非抗虫基因棉花为材料,研究不同表达性状的转基因棉花种植对棉田节肢动物群落结构、多样性及食物网结构的影响。结果表明,3种转基因棉花在节肢动物群落Shannon-Wiener多样性指数、Pielou均匀度和优势集中性指数上与其对照受体棉花无显著差异(P0.05)。转基因棉花与其对应受体间的群落相似性指数均较高(73.18%~77.65%),食物网结构参数上也无显著性差异(P0.05)。表明3种转非抗虫基因棉花对棉田节肢动物多样性及食物网结构无显著影响。     

人工模拟“庇护所”和“非庇护所”条件下棉铃虫对Bt棉的抗性演变

 人工饲料中添加转Bt基因杂交棉品种中棉所29棉仁粉,建立杂交和自交品系分别模拟“庇护所”和“非庇护所”条件,连续多代进行棉铃虫对Bt棉的抗性筛选。结果表明：经11代筛选,棉铃虫自交品系和杂交品系的幼虫死亡率下降,体重和体长增加,幼虫历期缩短,化蛹率和羽化率增加。依据幼虫死亡率、体重、体长、幼虫历期以及化蛹率、羽化率等生命参数的演变,相较杂交品系,自交品系对Bt棉能更快地产生适应性。11代筛选后,利用不同抗性品系棉铃虫进行转基因棉抗虫性评估,结果表明：相比敏感品系,杂交品系测定4个转基因棉品种的抗虫性等级未发生变化,而中棉所29等3个转基因棉品种对棉铃虫自交品系的抗性下降了1个等级。对Bt制剂的抗性测定结果表明,杂交品系的抗性倍数为2.5215,自交品系的抗性倍数为9.3876。据本研究初步结果,利用“庇护所”策略延缓棉铃虫对转Bt基因棉的抗性产生是可行的。