转GFP基因核移植牛胚胎的研究

试验采用脂质体转染法与电穿孔法,以携带绿色荧光蛋白（GFP）-新霉抗性（neo-）双标记基因的pMSCV质粒转染胎牛耳成纤维细胞为供体与体外成熟的牛卵母细胞为受体构建克隆胚。研究了体外成熟培养液中添加EGF（表皮生长因子）对转基因胚的影响,不同转染方法构建供体细胞对重构胚发育的影响和在不同体外培养系统中的发育效果。结果显示,体外成熟培养液中添加EGF 30 ng/mL组的卵母细胞成熟率最高,但对后期转基因重构胚的囊胚发育率的影响,以添加EGF 20 ng/mL组的最高;以胎牛耳成纤维细胞为供体细胞,不同转染方法转染供体细胞构建重构胚,其囊胚发育率差异不显著（P>〖JP2〗0.05）;mSOFaa+颗粒细胞单层细胞共培养体系中的转基因囊胚发育率最好,该体系更适合体细胞核移植法生产转基因牛胚胎。     

体细胞核移植生产转基因牛胚胎的研究

为了优化利用体细胞核移植生产转基因牛早期胚胎的体系,以携带绿色荧光蛋白-新霉抗性双标记基因的pMSCV质粒转染的胎牛耳成纤维细胞为供体,以体外成熟的牛卵母细胞为受体构建克隆胚,研究供体细胞的传代次数对转基因胚的影响和重构胚在不同电场条件下（电场强度、直流电脉冲次数）融合效率及其在不同体外培养系统中的发育效果。结果表明：传代5次的细胞做核供体较有利于转基因胚的发育;在电场条件为电场强度1.6 kV/cm、直流脉冲1次的融合率最高;负压单层细胞共培养体系中的转基因囊胚发育率较好,与未转基因体细胞核移植胚的发育相比无显著差异（P〉0.05）。     

转sMTPPGH基因小鼠胚胎的体外培养

采用纯化的羊金属硫蛋白（sMT)启动子指导的猪生长激素（PGH)基因(sMTPGH)为显微注射片段，将其导入小鼠受精卵原核，比较了几种不同培养液对导入外源基因的小鼠胚胎体外发育的影响。结果表明，改进的M16培养液（用mM16表示）能有效克服2－细胞阻断现象，并使转基因胚胎发育到桑椹胚或囊胚阶段。在mM16培养液的基础上，再加入表皮生长因子（EGF），可使1－细胞胚胎发育到囊胚的比率进一步提高。在3和培养液（M16,mM16,mM16 EGF)中，转基因胚胎突破2－细胞阻断期的比率分别为12％，68％，90％，发育到囊胚期的比率分别是0％，20％，43％。采用PCR方法检测57枚经体外培养发育至囊胚的显微注射胚胎，4枚扩增出阳性条带，外源基因在囊胚期胚胎的滞留率为7％。     

牛胚胎体外生产技术的简化研究

利用屠宰牛卵巢分离的卵母细胞，以卵裂率和囊胚发育率为标准，对牛胚胎体外生产过程进行了简化试验。结果显示：不加卵丘细胞的高密度卵母细胞体外成熟（１００￣２００枚／平皿）可代替加卵丘细胞的标准密度（５０枚／平皿）培养，其卵裂率（５７．６％比６２．５％）和囊胚发育率（２３．７％比２９．１％）没有显著差异（Ｐ〉０．０５），体外授精时间可从成熟培养后２２ｈ延长至２７ｈ，卵裂率和囊胚发育率均没有显著变化，卵母     

牛体外受精胚胎培养技术研究

在COCs体外培养过程中添加共培养物质和采用不同体积的液滴进行培养,以探讨牛卵母细胞的体外培养效果。结果表明,卵丘细胞、卵丘细胞+bFF共培养系统对胚胎发育均有促进作用,其中以卵丘细胞+bFF共培养系统对桑椹胚和囊胚的发育最好,其囊胚率为10.63%,显著高于对照组的7.23%(P<0.05),高于卵丘细胞组的8.50%(P>0.05)。用培养皿微滴培养(50μL)和用4孔板大体积培养(500μL)的试验表明,大体积培养比微滴培养有优势,桑椹胚和囊胚率均较高,其中囊胚率为10.23%,显著高于培养皿微滴培养的9.07%(P<0.01)。     

牛体外受精胚胎的体外培养研究进展

家畜体外受精（IVF）技术自上世纪八十年代获得成功以来，发展十分迅速，九十年代已进入试管胚的开发应用阶段。目前，IVF胚胎的质量与体内胚相比仍有很大差距。在进行IVF胚胎体外培养时，常会出现“体外发育阻断”现象，主要表现为细胞数较少、卵裂球形状不规则、存在死亡的细胞和细胞质碎片、发育速率和抗冻性降低以及酶活性和营养物摄取的改变等方面。近年来，为了克服胚胎体外发育所存在的某些缺陷，国内、外对不同动物的胚胎体外培养体系和培养方法进行了系统研究，取得了长足进展。本文就牛IVF胚胎体外培养方面的研究进展综述如下。     

体外生产的牛胚胎超微结构的研究

利用两种常规体外培养系统研究了体外培养及不同培养条件对牛体外受精胚胎早期发育各时期超微结构的影响。结果显示：体外发育的牛胚胎在发育的各个时期（从原核期到囊胚）胞质中均含有丰富的脂滴，胚胎中特别是在桑椹胚及囊胚阶段可见到一些异常细胞。两系统下发育的胚胎中脂滴形态不同，从桑椹胚阶段开始，胚胎线粒体的发育在M199-BOEC-FCS培养系统中明显滞后于其在SOFaa-BSA培养系统中的对照。     

牛早期胚胎体外发育条件的研究

本试验研究了精卵共育时间和培养液等因素对牛早期胚胎体外发育的影响。精卵共育6～12h能显著提高受精卵的囊胚发育率,受精卵的囊胚发育率为23．2％～25．3％,共育时间为24h时,囊胚发育率降低,但精卵共育6h时卵裂率较低;TCM199、mBECMaa、mSOFaa均能支持体外受精卵的发育,其囊胚发育率分别为18％、30．7％和29．2％。试验结果表明：精卵于BM受精液中共育9h后,将其置于添加5％OCS的mBECMaa或mSOFaa中培养,能得到较高的体外生产胚胎的囊胚发育率。     

转sMTPGH基因小鼠胚胎的体外培养

采用纯化的羊金属硫蛋白 (s MT)启动子指导的猪生长激素 (PGH )基因 (s MTPGH)为显微注射片段 ,将其导入小鼠受精卵原核 ,比较了几种不同培养液对导入外源基因的小鼠胚胎体外发育的影响。结果表明 ,改进的 M16培养液(用 m M16表示 )能有效克服 2 -细胞阻断现象 ,并使转基因胚胎发育到桑椹胚或囊胚阶段。在 m M16培养液的基础上 ,再加入表皮生长因子 (EGF) ,可使 1-细胞胚胎发育到囊胚的比率进一步提高。在 3种培养液 (M16、m M16、m M16 EGF)中 ,转基因胚胎突破 2 -细胞阻断期的比率分别为 12 %、6 8%、90 % ,发育到囊胚期的比率分别是 0 %、2 0 %、4 3%。采用 PCR方法检测 5 7枚经体外培养发育至囊胚的显微注射胚胎 ,4枚扩增出阳性条带 ,外源基因在囊胚期胚胎的滞留率为 7%。     

体细胞核移植技术生产猪植酸酶转基因胚胎的研究

为获得具有植酸酶腮腺特异性表达的猪转基因克隆胚胎,本研究使用植酸酶腮腺特异性表达的DNA质粒(包含腮腺分泌蛋白(parotid secretary protein,PSP)启动子与终止子序列、Neo筛选基因、绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因和高比活的植酸酶appA基因),采用脂质体转染和基因素418(G418)药物抗性筛选的方法获取稳转细胞系,并利用体细胞核移植技术获得植酸酶转基因胚胎。结果表明,本研究构建的DNA质粒可用于细胞筛选,且质粒越小,细胞的转染效率越高,14.89 kb的YM6552仅获得了7.1%的转染率,EGFP质粒则获得了43.4%的转染效率。在单克隆形成上,较小的pYN3600也获得了更高的单克隆形成数(25个),其中表达EGFP的单克隆有14个,植酸酶PCR阳性集落有11个,高于YM6552的单克隆数(19、8和6)。转基因细胞构建重构胚胎后,所有的胚胎均能表达绿色荧光蛋白,虽其体外发育能力有所下降,但差异不显著(P>0.05)。综上所述,本研究所采用的植酸酶质粒、细胞筛选方法和核移植技术可生产植酸酶重构胚。     

猪前脂肪细胞为核供体生产表达绿色荧光蛋白的转基因克隆胚胎

分离培养了成年猪前脂肪原代细胞，并对前脂肪细胞向成熟脂肪细胞进行诱导分化，油红O染色法鉴定了脂肪细胞。利用脂质体介导的方法将质粒pEGFP—N1转染前脂肪细胞，经过G418筛选获得了阳性细胞株。然后分别以前脂肪细胞、转绿色荧光蛋白（GFP）前脂肪细胞及胎儿成纤维细胞为核供体进行体细胞核移植，结果表明：前脂肪细胞（8．8％）和胎儿成纤维细胞（8．3％）的囊胚发育率无显差异著（P〉0．05）；与前脂肪细胞相比，转基因前脂肪细胞的囊胚发育率降低，但差异不显著（3．7％ vs．8．8％，P〉0．05）。前脂肪细胞为核供体生产转基因克隆胚胎，能够获得转基因囊胚。虽然囊胚发育率不高，但为生产脂肪细胞转基因克隆猪奠定了基础。     

单精注射法生产转GFP基因猪胚胎的研究

卵胞质内单精子注射(ICSI)的出现为治疗人类男性不育提供了新的途径。作为一种家畜胚胎工程新技术，ICSI可以解决猪的多精子受精问题。本研究用冷冻/解冻的猪精子与GFP基因孵育后对猪IVM卵母细胞进行ICSI，通过对猪ICSI卵母细胞发育能力和基因表达效率的分析，初步研究以精子为载体的转基因与卵细胞质内单精注射相结合的技术(SMGT-ICSI)生产转基因猪胚胎的技术路线的可行性。用GFP基因转染的精子注射后化学激活的ICSI卵母细胞基因表达率显著高于电激活处理的ICSI卵母细胞的基因表达率。用精子头部注射的猪卵母细胞和用完整精子注射的猪卵母细胞总基因表达效率无显著差异(P>0.05)。结果表明，用冷冻/解冻后的猪精子或精子头部与外源DNA孵育后通过ICSI方法生产转基因胚胎是可行的。     

蛋白酶抑制剂MG-132对牛核移植重构胚重编程的影响

旨在探讨MG-132对牛体细胞核移植重构胚重编程的影响。将牛卵母细胞体外培养至MI期,添加不同浓度的MG-132(0、3、5、7、10μmol·mL-1),至成熟后进行激活,通过胚胎的发育情况得出MG-132的合适浓度,并用此浓度的MG-132作用于核移植全过程,来研究MG-132的作用,用免疫组化的方法进一步验证结果。结果,5、7μmol·mL-1MG-132组卵裂率和囊胚率均显著低于对照组和2μmol·mL-1组(P0.05),但这2组间无显著差异(P0.05),而10μmol·mL-1组卵裂率只有23.44%,低于其他各组(P0.05);成熟卵母细胞在5μmol·mL-1MG-132中分别作用0、2、4h激活后,卵裂率、囊胚率均无显著差异(P0.05),而6h组激活后卵裂率、囊胚率均明显降低(P0.05);核移植操作过程中添加MG-132组的卵裂率与对照组相比无显著差异(P0.05),而桑葚胚和囊胚率都较对照组显著升高(P0.05);未添加MG-132组,融合后1h供体细胞几乎无变化,4h后核纤层蛋白(lamin)着色显著,说明染色体凝集不完全;添加组融合4h后,核膜不完全着色,明显发生了染色体凝集。上述结果说明5μmol·mL-1MG-132能够促进重构胚的重编程,但对重构胚移植后的附植和妊娠作用还有待进一步研究。     

Different Culture Media Requirements of IVF and Nuclear Transfer Bovine Embryos

Important differences exist between in vitro fertilized (IVF) and nuclear transfer (NT) bovine embryos. Studies have shown that although in vitro development is comparable, post-implantation survival is greatly reduced in NT embryos. In this study, we compare serum and bovine serum albumin (BSA) supplementation during oocyte maturation and embryo culture of IVF and NT embryos. In experiment 1, oocytes and embryos were randomly distributed into different treatment groups consisting of synthetic oviductal fluid (SOF) medium supplemented with either serum, fatty acid-free BSA (FAF) or fraction V BSA during maturation and/or culture to assess IVF embryo development. In experiment 2, oocytes were matured in SOF + serum or SOF + FAF and reconstructed embryos were cultured in SOF + FAF to assess NT embryo development. Among the IVF treatment groups, a greater number of blastocysts were observed in the steer serum (SER) group (IVM and IVC in SOF + serum) on day 6; however, no significant differences were seen in blastocyst development from day 8 onwards. Hatching frequencies on days 8 and 9 were significantly greater in groups with serum, with the exception of FAF (IVM and IVC in SOF + FAF) on day 9. For the NT treatment groups, the presence of serum during IVM resulted in a higher proportion of MII oocytes and increased blastocyst development and hatching rates were compared with supplementation of FAF. These results indicate that both serum and FAF provide comparable embryo development for IVF but not for NT bovine embryos.     

精子载体法获得转人her2基因猪

将带有外源基因的载体酶切纯化后与去精清的猪新鲜精液按比例混合，17℃静置处理使外源DNA进入精子头部，通过人工授精使受体母猪怀孕后产下20头仔猪，经PCR特异性片段扩增，特异片段序列测定和比对，共4头PCR结果为阳性。初步证明人her2基因已在猪染色体上整合，其整合率约为20％。本研究利用精子载体法成功获得了转基因阳性猪，为大动物的转基因研究提供了理论与实践的参考。     

Production of Transgenic Farm Animals by Viral Vector-Mediated Gene Transfer

Transgenic technology holds considerable promise to advance understanding in biomedical and agricultural systems with some believing that one day transgenic animals may directly contribute to farming and breeding practice. Nevertheless, applications in livestock have been restricted in part by the inefficiency of the technology. The recent development of lentivirus vectors for transgene delivery may overcome some of this limitation. This presentation describes these vectors, their advantages and limitations.     

牛胚胎玻璃化超快速冷冻一步法移植试验

应用 30 %乙二醇 0 .3mol/ L 蔗糖 - m- PBS液 (VS1)、30 %乙二醇 0 .3m ol/ L 蔗糖 5 %葡聚糖 (T- 5 0 0 ) - m-PBS液 (VS2 )、30 %乙二醇 0 .3mol/ L蔗糖 10 %葡聚糖 (T- 5 0 0 ) - m- PBS液 (VS3)玻璃化超快速冷冻奶牛胚胎 ,一步法移植。结果显示 ,VS1、VS2、VS3组玻璃化超快速冷冻奶牛胚胎解冻后的形态正常率分别为 10 0 % (2 0 / 2 0 )、95 %(19/ 2 0 )和 5 5 .6 % (5 / 9) ;培养存活率分别为 70 % (14 / 2 0 )、75 % (15 / 2 0 )和 2 2 .2 % (2 / 9) ;囊胚孵化率分别为 0、2 0 % (4/2 0 )和 0。VS1、VS2组玻璃化冷冻奶牛胚胎解冻后的形态正常率极显著地高于 VS3组 (P<0 .0 1) ;VS1、VS2组玻璃化冷冻奶牛胚胎解冻后的培养存活率分别显著 (P<0 .0 5 )和极显著 (P<0 .0 1)地高于 VS3组。 VS1组冷冻的胚胎经一步法移植了 5头 (1枚 /头 ) ,未获得妊娠 (0 / 5 ) ;VS2组冷冻的胚胎用一步法移植了 10头 (1枚 /头 ) ,结果获得 2头妊娠(2 / 10 ) ,并产下 2头正常犊牛。     

牛体外受精胚胎细胞核移植的实验研究

将采自肉联厂屠宰车间的牛卵巢中的卵母细胞置于ＴＣＭ－１９９＋１０％ＥＣＳ（０ｄ）＋ＦＳＨ（１万ＩＵ／Ｌ）＋ＬＨ（５ｍｇ／Ｌ）中培养成熟，用含０．３％透明质酸酶的消化液将卵母细胞周围的卵丘细胞去掉，并以７．５ｍｇ／Ｌ的ＣＢ液处理后，用微吸管吸去透明带内的第一极体及极体下面的部分卵母细胞质，然后将经体外受精并发育至８～１６细胞期胚胎的卵裂球注入去核卵母细胞的卵周隙中，再将移核胚置于电融合槽内进行融合（电场强度为１２００Ｖ／ｃｍ，持续时间为８０μｓ，１次脉冲刺激）。将融合的胚胎移入生长有单层贴壁颗粒细胞的发育培养液（ＴＣＭ－１９９＋１０％牛血清）中培养，观察移核胚的融合率及发育率，部分去核卵母细胞经染色后观察去核率。结果表明：（１）移核胚的融合率为８６．９％（５３／６１）；（２）发育至２～８细胞期的胚胎占培养的移核胚胎总数的２１．３％（１０／４７）；（３）卵母细胞的去核率为６８．２％（４５／６６）。     

供体细胞的不同处理方法对牛核移植重构胚发育能力的影响

为了研究供体细胞不同的处理方法对核移植重构胚的作用，比较了用于保种的冻存和新鲜的成纤维细胞做供体细胞、供体细胞不同的离心转数、供体细胞不同的血清饥饿时间及用本实验室冻存的成纤维细胞，解冻复苏后，不同传代次数对重构胚的影响。结果表明分别用冷冻保存的和新鲜的成纤维细胞作为核供体，所得重构胚卵裂率、囊胚率无显著差（P>0.05）；供体细胞离心800 r/min时所得重构胚效果较好，离心1500 r/min所得重构胚的卵裂率、囊胚率与其他3组相比较低；血清饥饿3～5 d组所得重构胚比其他3组好；用解冻复苏后再传2、5代的细胞进行核移植，所得重构胚的卵裂率、囊胚率无明显差异(P>0.05)，显著高于传8代的细胞所得重构胚。说明供体细胞的不同处理方法对核移植重构胚发育有很重要的影响。