麻竹营养规律的研究

通过对儋州地区正常麻竹园叶片营养状况进行调查分析,研究正常麻竹的营养特性和营养诊断方法。其结果表明：(1)麻竹叶片大中量元素养分含量都存在月份间的不同变化和差异;(2)麻竹叶片养分含量和竹笋的养分含量存在差异,叶片中各养分含量从大到小排列为：N>K>Ca>S>P>Mg>Fe>Mn>Zn>B>Cu;笋中各养分含量顺序为：K>N>P>Ca>Mg>S>Fe>Zn>Mn>Cu>B。(3)初步确定麻竹叶片诊断的适宜采样时间为4月份。     

小麦puroindoline基因高效植物表达载体的构建

籽粒硬度是决定小麦品质优劣的重要性状,控制硬度的主效基因为pinA和pinB(统称为puroindoline基因)。本研究利用含有能促进外源基因高效表达的Ω序列、Kozak序列和poly(A)序列的pG4AB及含有Ubi启动子和筛选基因bar的pAHC25,成功构建了含有puroindoline基因的单子叶植物高效表达载体pUBPa和pUBPb。目的是将来通过转基因植物研究,进一步明确pinA和pinB的功能,为通过基因工程方法快速改良我国现有小麦优良品种的籽粒硬度奠定基础。     

pCB-zeolin-GFP表达载体的构建及瞬时表达

为利用荧光蛋白基因GFP检测外源基因在转基因植株中的表达和定位,构建含有GFP基因的植物表达载体pCB-zeolin-GFP。在目的基因的开放阅读框（ORF）两端设计引物,并引入酶切位点和保护碱基,用PCR方法从pDHA扩增得到zeolin基因的全长,克隆到中间载体pMD18-T,分别用NcoⅠ和BglⅡ2种限制性内切酶酶切重组质粒和经过改良的pCAMBIAI1302植物表达载体,经回收、连接、转化、鉴定后,利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞,通过共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白在洋葱表皮细胞中的瞬时表达。构建了zeolin基因与绿色荧光蛋白（GFP）融合的植物表达载体pCB-zeolin-GFP,并在洋葱中得到了表达。构建的融合植物表达载体pCB-zeolin-GFP正确,该载体的成功构建为今后进行基因转移、基因功能研究及培育新品种奠定了基础。     

氮磷营养高效型小麦品种鉴定

为了快速筛选氮素和磷素营养高效型小麦品种,以山东省近年来育成的25个小麦品种(系)为材料,通过大田试验,对不同品种的子粒氮素和磷素利用效率及产量性状进行统计分析。结果表明,在正常氮肥和磷肥水平下,以济麦22为对照,氮素利用效率、磷素利用效率和产量高出10%以上的品种(系)分别有13个、9个和11个;其中山农24、泰农18、山农32(SH5099)和山农29(LS6109)在这3个指标上均比对照高出10%,是营养高效型小麦品种,在生产上具有较高的推广价值。     

小麦花粉管途径转化及高效筛选体系的建立

本文报道了一种从大量花粉管途径转化处理后代中快速有效地筛选到转基因植株的方法。转化质粒为含bar筛选标记基因的天麻抗真菌蛋白(GAFP)与兔防御素(NP-1)双价抗病基因植物表达载体(pBI35S-gafp-NP1-bar),受体小麦品种为扬麦158和Alondra。对花粉管途径转化处理获得的种子分3步进行筛选鉴定：首先,转化处理种子密播于塑料盘中,待小苗长到3叶期时,用浓度为120mg／L的Basta除草剂弥雾喷施筛选,约10d后绝大部分小苗变黄枯死,只有约1％的高抗Basta除草剂的T0小苗存活;然后对其Basta抗性植株用gafp基因引物进行PCR检测,其中62．5％的Basta抗性植株为PCR阳性;最后将T0代PCR阳性植株后代种子(T1)分别发芽并按株系混合取样提取DNA,分别用gafp和bar基因引物进行PCR检测验证,结果均为阳性。表明外源基因已整合入小麦基因组并由T0代植株稳定遗传到T1代,同时证明该筛选方法是可靠有效的。     

适于植物转基因体系优化的绿色荧光蛋白表达载体构建及其瞬时表达验证

在建立和优化植物的转基因体系时,通常期望转化载体同时具有适用植株范围广、尺寸较小、具有多重选择标记或报告基因等优点。为此,通过Gateway技术,构建了含有绿色荧光蛋白基因GFP的植物表达载体pGWB14-GFP,并经PCR鉴定和测序验证了序列的准确性。利用基因枪转化法,将该载体转入洋葱表皮和小麦叶片中,通过荧光显微镜检测,发现绿色荧光蛋白在洋葱表皮细胞和小麦叶片表皮细胞中均能瞬时表达,表明pGWB14-GFP在双子叶和单子叶植物中都能正常发挥功能。本载体在双子叶和单子叶植物植物中都可使用,大小低于17 kb,含有GFP报告基因,具有两套卡那霉素和潮霉素选择标记基因,用于在细菌和植物中筛选,为植物转基因体系的构建和优化提供了功能强大的转化载体。     

梨树叶片营养状况的诊断与评价

研究湖北省利川市‘长十郎’梨树叶片营养状况,为科学施肥提供依据。采用叶片营养诊断和主成分分析的方法,2017—2018年对利川市‘长十郎’梨9个梨园的叶片营养状况进行营养诊断和评价。结果表明,‘长十郎’梨树叶片的Ca、K、Cu、Zn含量基本适宜,Mg、B、P含量偏低,Mn含量高;部分梨园叶片Fe含量缺乏,2017年梨园叶片整体N含量偏低。土壤酸化是造成利川市梨园叶片营养失衡的主要原因。在生产中应通过施用酸性土壤调理剂如生石灰、硼泥类等碱性肥料提高土壤pH,增施有机肥提高土壤有机质含量,并重视补充Mg、B、Fe等中微量元素,实现‘长十郎’梨的提质增效。主成分分析可将10个叶片营养指标简化为4个主成分,代表了82.512%的原始信息量。基于主成分分析建立了‘长十郎’梨叶片营养综合评价模型Z=0.278N+0.030P+0.250K-0.042Ca-0.133Mg+0.193Fe+0.193Mn+0.174Cu+0.177Zn-0.106B,可较好地应用于梨树叶片营养的综合评价。     

杨树RAPD标记技术体系的建立与优化

本研究主要对杨树RAPD体系进行优化,以银白杨为试材,利用L₁₆(4⁵)正交试验设计和2个单因素试验,研究各主要参数的适宜浓度。结果表明,杨树RAPD优化后的反应体系：20μL反应体系中,含Mg²⁺ 1.5 mmol/L、Taq酶2.0 U、引物0.2μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、模板DNA 50 ng。扩增程序为：94℃预变性3 min、94℃变性40 s、38℃退火60 s、72℃延伸90 s,共38个循环;最后在72℃延伸7 min后4℃保温。通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测其扩增产物,证明该体系稳定可靠,可以用于杨树的遗传学分析。     

PEG介导番木瓜叶肉原生质体瞬时表达体系的建立

本研究对聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)的分子量、浓度及处理时间等三个影响番木瓜叶肉原生质体转化效率的主要因素进行了优化,同时利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达体系进行了转化表达分析。结果表明:经40%PEG8000溶液处理10 min,可使GFP在原生质体中的平均转化率达到45.26%;沉默抑制载体p Green-Hcpro和GFP瞬时表达载体共转化番木瓜叶肉原生质体,可使GFP在原生质体中的平均转化率进一步提高到68.75%,相比单独转化瞬时表达载体p RNAi-GFP增长了51.90%。PEG介导番木瓜叶肉原生质体瞬时表达体系的建立为番木瓜功能基因组和基因功能研究奠定了基础,可为热带作物的研究提供又一模式作物,推动热带作物在分子及细胞生物学领域的发展。     

辽宁杨叶片高频植株再生体系的建立

为了提高辽宁杨的抗逆性及扩大它的适生区域,本研究以辽宁杨叶片为外植体材料,通过对附加不同浓度BA和NAA的MS培养基的筛选,建立了辽宁杨叶片高频植株再生体系,其不定芽诱导率及生根率都达到100%,辽宁杨最佳不定芽分化培养基配方为MS+BA 0.3 mg/L+NAA 0.05 mg/L,生根培养基配方为1/2MS+IBA 0.3 mg/L,为辽宁杨的抗性改良及分子育种实践奠定了基础。     

Rubisco小亚基基因片段的亚克隆及其瞬时表达载体的构建

1,5一二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶位于植物叶绿体中,是绿色植物中含量最丰富的蛋白,它催化CO2固定和光呼吸作用的第一步。从含Rubisco小亚基基因片段的pGR107-rbcS质粒中亚克隆出Rubisco小亚基基因片段,将PCR产物与pGEM-T：Easy载体连接,用EcoRI酶切鉴定酶切重组载体,利用低溶点胶回收大约300bp大小的Rubisco小亚基基因片段,将其回收片段与pSLJ75515瞬时表达载体连接,用EcoRI酶切鉴定,筛选出阳性重组体,即为pSLJ75515-rbcS瞬时表达载体。本实验为进一步研究Rubisco小亚基基因功能和基因沉默机制奠定了基础。     

小麦脱植基相关基因在春性小麦叶片叶绿素降解过程中的作用分析

小麦叶片的衰老会导致产量的损失,而叶绿素降解是小麦叶片衰老的明显特征,分析小麦叶绿素降解过程中脱植基反应的相关基因叶绿素酶（TaCLH）和脱镁叶绿素水解酶（TaPPH）在春性小麦叶片衰老过程中的作用,为解析小麦叶绿素降解的分子机制提供参考。以10个春性小麦品种为参试材料,对衰老过程中TaCLH和TaPPH的相对表达量进行测定,结合不同品种在开花后不同时期的相对叶绿素含量（SPAD）、功能绿叶面积（GLAD）和叶绿素荧光参数的变化规律,研究叶片衰老过程中TaCLH和TaPPH与SPAD、GLAD和叶绿素荧光参数的相关关系。结果表明,TaPPH的相对表达量与GLAD、SPAD及叶绿素荧光参数[ETR、F_v/F_m、Y(Ⅱ)]等生理指标之间存在极显著负相关关系,与TaCLH相对表达量存在极显著正相关关系,表明TaPPH在春小麦叶绿素降解过程的脱植基反应中起主要作用。     

植物病原菌诱导表达载体构建及在烟草中的瞬时表达研究

根据GenBank中植物病原物诱导型启动子碱基序列设计引物,以烟草基因组DNA为模板,扩增PPP3启动子。用PPP3替换pCAMBIA1301中与gus基因相连的35S启动子,构建重组质粒pCOMBIA ＋PPP3＋gus后导入农杆菌GV3101。通过农杆菌介导的瞬时表达技术将受PPPs控制的gus基因导入烟草。分别接种青枯菌和水杨酸24 h后,烟草叶片中检测到gus基因转录效率分别提高了27．94,17．69倍。表明PPP3启动子具有本底表达水平低、诱导表达活性强的特点。     

小麦转录因子TaMyb2s的克隆及表达

利用小麦TaMyb2基因特异引物, 克隆了3种类型TaMyb2的cDNA序列, 分别命名为TaMyb2-I、TaMyb2-II和TaMyb2-III。氨基酸序列比对结果表明, TaMyb2s的序列高度相似。系统进化树分析显示, TaMyb2s与来自大麦、水稻等的直系同源基因编码蛋白的亲缘关系较近; TaMyb2s的3种类型与小麦基因组没有明显的对应关系。实时定量PCR检测结果表明, 小麦幼苗中的TaMyb2s均参与对渗透胁迫的应答反应, 但表达模式不尽相同, TaMyb2-III对渗透胁迫的应答最迅速, TaMyb2-I次之, TaMyb2-II最迟缓。从小麦不同发育时期幼嫩组织中TaMyb2s的表达情况推测, TaMyb2-I和TaMyb2-III可能主要在生长发育的前期调控下游基因, 而TaMyb2-II主要在发育后期发挥作用。     

小麦幼苗水分胁迫应答基因表达谱分析

利用抑制差减杂交技术,分别构建小麦幼苗在水分胁迫1 h、6 h、12 h、24 h和48 h条件下的cDNA文库,得到6 733条EST序列。通过对这些序列的组装、比对、注释和分类,初步构建了小麦不同水分胁迫条件下的应答基因表达谱,发现水分胁迫应答基因表达的时间特性及4种表达模式。在648个已知功能注释的uni-gene中,6.17%属转录因子类基因,2.16%为蛋白磷酸酶类基因,4.01%是蛋白激酶类基因,19.90%为避免损伤和修复蛋白类基因,2.0%为大分子保护因子类基因,9.11%为膜蛋白类基因,这些基因可能是抗旱相关的重要基因。     

四环素阻遏-蛋白与热激因子融合转录激活子的构建

为构建一新型低毒且受四环素负调控的基因表达调控系统,克隆了大肠杆菌XL1-BLUE四环素阻遏蛋白基因TetR和拟南芥热激因子基因Athsf1a缺失片段AtHSFC157,将两基因融合获得TetR:AtHSFC157融合片段作为四环素调控系统转录激活子,将其克隆入表达载体pXNSC2020中,成功构建了四环素负调控系统p35SC157-Om35Sgus。采用冻融法将其导入根癌农杆菌EHA105中,并通过农杆菌介导烟草叶片瞬间表达,以组织化学法检测GUS基因表达活性;结果在不加四环素处理条件下组织化学法检测到很强的GUS活性,而在含有1mg/L四环素的培养基中培养却没有检测到GUS活性;结论表明该技术所构建的新型四环素调控系统具有典型的受四环素负调控功能。     

农杆菌渗入法介导的基因瞬时表达技术及应用

农杆菌渗入法是在植物中瞬时表达外源基因的一种方法,该方法通过在植物叶片上注射农杆菌,使目的基因转入植物细胞中进行快速表达。本文综述了农杆菌渗入法的原理、技术流程、影响因素及其应用,其应用主要涉及外源基因的表达、检测转基因的表达、启动子分析、转录后基因沉默、抑制子功能鉴定、细胞定位以及基因相互作用等方面。随着技术的进一步完善,我们相信该技术将成为转基因育种领域的重要的手段。     

棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立

以棉花幼嫩子叶为外植体材料,分析影响棉花叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素,以棉花叶肉原生质体为受体,建立稳定、高效的目标基因瞬时表达与鉴定体系。技术体系包括,选择自然生长12 d的棉花幼嫩子叶为外植体材料,混合1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、0.5 mol L^–1甘露醇、20 mmol L^–1 KCl、20 mmol L^–1 MES、0.1 mol L^–1 CaCl₂和1.0 g L^–1 BSA等酶液,在28℃黑暗条件下振荡酶解8 h,可游离出浓度达1.0×10⁶ m L^–1以上的纯净棉花叶肉原生质体。利用该方法将棉花锌指蛋白基因GhZFP2整合到pJIT166-GFP质粒载体,构建了GhZFP2:GFP融合载体,采用40% PEG(4000)介导转化,获得高转化率的棉花叶肉原生质体。对目标基因瞬时表达产物检测表明,GhZFP2蛋白清晰定位在细胞核上。     

含CBS结构域的小麦TaCDCP1基因的克隆及其表达分析

利用电子克隆和RT-PCR技术,在本实验室前期构建的非亲和互作的SSH文库基础上,从条锈菌侵染的小麦水原11叶片中首次分离出一个含CBS结构域蛋白的基因,暂命名为TaCDCP1(Triticum aestivum CBS domain containing protein 1)。TaCDCP1包含一个完整的654 bp的开放阅读框,编码217个氨基酸。推测该基因拟编码的蛋白具有2个CBS保守结构域,不含跨膜区且无信号肽,定位在叶绿体基质内;经过同源比对,小麦TaCDCP1氨基酸序列与大麦、水稻和玉米等的同源序列的相似性较高;该基因表达量在小麦叶中显著高于在根和茎中;在小麦与条锈菌的非亲和、亲和组合中,TaCDCP1基因均受到条锈菌诱导,分别在接种后18 h和96 h达到表达高峰,非亲和组合表达量在侵染前期(接种后18~48 h)高于亲和组合,而在侵染后期(接种后96~120 h)低于亲和组合;外源植物激素脱落酸诱导该基因上调表达,苄基腺嘌呤,乙烯,赤霉素,茉莉酸甲酯和水杨酸处理后其表达量在不同程度上受到抑制;TaCDCP1在低温和干旱条件下表达量上升,在机械伤害和高盐处理下表达量无明显差异。表明TaCDCP1可能通过脱落酸等信号途径参与小麦对条锈菌的防御反应,同时参与低温和干旱环境下的信号转导途径。这些结果对于明确CBS结构域的功能以及CBS结构域蛋白尤其是TaCDCP1在小麦与条锈菌互作中的作用奠定了基础。