多重聚合酶链反应快速检测鉴别鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株的研究

根据鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株基因组的结构特点，设计合成了二对引物XZ1，XZ2和XZ45、XZ46，建立了一种同时检测鉴别MG野毒株和弱毒疫苗株的多重PCR技术。试验结果表明，用这两对引物对MG强毒株和弱毒疫苗侏进行多重PCR，强毒株只扩增出732bp一条带，而弱毒疫苗株则可同时扩增出732bp、524bp二条带，而对其他种类鸡支原体和其它禽病病原的扩增不出现任何条带，结果均为阴性；敏感性测定结果表明，该多重PCR最低能检出1Pg的MG强毒株和弱毒疫苗株的DNA模板。     

用PCR技术鉴定犬细小病毒弱毒疫苗株

通过分析比较犬细小病毒(CPV)弱毒疫苗株和强毒株的基因序列，设计了3条引物并组成2对引物，对弱毒疫苗株和强毒株进行了半嵌套式PCR扩增。第1轮PCR扩增的结果为CPV弱毒疫苗株和强毒株有相同的目的片段(585bp)；第2轮PCR扩增的结果为CPV强毒株有375bp目的片段，而CPV弱毒疫苗株没有375bp目的片段。对PCR产物进行电泳和酶切分析，结果证明PCR产物片段大小和酶切位点与设计的产物完全一致。特异性和敏感性测定结果表明，该方法是高度特异和敏感的，可用于弱毒疫苗毒株与强毒株的鉴定。     

多重RT-PCR快速检测鉴别新城疫病毒强毒株和弱毒疫苗株方法的建立

根据新城疫病毒（NDV）基因结构的特点及强、弱毒株融合基因裂解位点的序列差异设计了4条引物，建立了一种可以快速鉴别NDV强毒株和弱毒疫苗株的多重PCR方法。检测结果显示，强毒株可以扩增出442bp的特异性片段和671bp的通用片段，弱毒疫苗株可以扩增出252bp的特异性片段和671bp的通用片段。该方法只需进行一次RT-PCR，整个过程可在数小时内完成。经敏感性测定，该方法最低能检测到100pg的NDV RNA。     

应用PCR-RFLP分析鉴别广西鸡毒霉形体

针对鸡毒霉形体(MG)16S和23SrRNA基因间的高变区序列设计合成了1对引物，对MG菌株进行了PCR扩增，获得了1条899bp的DNA片段，而其他禽病病原DNA无扩增。扩增产物经用限制性内切酶AfaⅠ和Dra Ⅰ进行酶切片段长度多态性分析，表明各MG菌株酶切图谱间均存在差异。     

鸡传染性支气管炎病毒强毒株和弱毒疫苗株的免疫磁珠-多重RT-PCR鉴别方法的建立

利用鸡传染性支气管炎病毒(IBV)多克隆抗体构建的免疫磁珠富集IBV,对Gen Bank中896株IBV S1基因序列及其多变区进行分析,根据IBV强毒株和弱毒疫苗株序列差异设计引物,建立了一种基于免疫磁珠富集IBV后检测S1基因多变区的多重RT-PCR方法。结果表明:该方法能扩增出强毒株约710 bp的通用片段和约350 bp的特异片段,弱毒疫苗株能扩增出约710 bp的通用片段和约210 bp的特异片段,能鉴别出强毒株和弱毒疫苗株。免疫磁珠富集IBV后比不富集病毒用RT-PCR方法检测敏感性提高100倍。该方法为IBV检测提供了新的技术支持。     

应用多重聚合酶链反应检测四种霉形体的研究

根据鸡毒霉形体(MG)、滑液囊霉形体(MS)、衣阿华霉形体(MI)和火鸡霉形体(MM)的基因文库，设计了4对分别与MG、MS、MI和MM某段基因序列互补的引物，用这4对引物对同一样品中的MG、MS、MI和MM的DNA模板进行多重PCR扩增。结果，均同时得到了4条特异性的大小与试验设计相符的732bp(MG)、207bp(MS)、299bp(MI)、850bp(MM)多重PCR扩增带，而对其他6种禽病病原体的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明，此多重PCR能同时检出1pg的MG、MS、MI和MM DNA模板。     

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP鉴别检测方法的建立

本研究旨在建立猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP鉴别检测方法。根据Shimen株设计1对特异性引物,建立猪瘟病毒RT-PCR-RFLP检测方法;对20份疑似猪瘟临床样品进行检测,并对检出的山东8株流行野毒株和2株疫苗株PCR产物进行克隆与序列分析,验证上述方法。结果RT-PCR扩增片段为825bp,产物经RFLP分析,野毒株的PCR产物能被ApaⅠ酶切为322bp和503bp 2个片段,兔化弱毒疫苗株则不能被酶切,检测出RNA的最低浓度为0.028 6μg.mL-1;8株流行野毒株都含GGGCCC序列(ApaⅠ酶切位点),2株疫苗株相应序列为GAGCCC,不能被ApaⅠ酶切;8株流行野毒株属于基因2群,2株疫苗株与HCLV遗传关系近,为基因1群。建立了可鉴别猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP检测方法,为猪瘟的防控提供有效手段。     

新型反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗方法的建立

对GenBank中登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,在其高度保守区设计1对通用引物,扩增片段为609bp,并在该对引物扩增区域内设计针对疫苗弱毒的特异引物,扩增片段为237bp,建立一种能够区分猪瘟病毒强毒和疫苗弱毒的敏感、特异、重复性好的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)鉴别诊断方法。该方法能将我国大陆地区流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒与疫苗弱毒完全区分开来,且不与牛病毒性腹泻病毒及其他猪源病毒发生非特异反应。应用本试验建立的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)方法可以及早对猪瘟作出准确诊断,并可将强毒感染猪迅速从弱毒疫苗免疫猪群中筛选出来,减少了未感染免疫猪被误杀的可能性。     

广西鸡毒支原体的分子流行病学研究的概述

研究分别建立了鸡毒支原体（MG）、滑液霉形体（MS）、禽衣阿华支原体（MI）、火鸡支原体（MM）及鉴别MG强毒株和弱毒疫苗株单一PCR和多重PCR检测鉴定技术,以及核酸探针检测MG的技术。应用多种分子生物学技术即SDS—PAGE、PCR—RFLP、RAPD和29KD多肽基因序列分析等方法对广西MG流行株的分子病原学进行研究,摸清了广西MG流行野毒株之问以及与现用疫苗株和国际参考株之间的差异和遗传相关性;在此基础上制定的综合防制措施经生产的实施与应用,取得了显著的效果。     

PCR检测鸡毒霉形体和鸡滑液囊霉形体的研究

根据禽霉形体16S rRNA的基因序列设计，合成了1对引物，用这对引物对鸡霉素形体（Mycoplasma gallisepticum,MG)和鸡滑液囊霉形体（Mycoplasma synoviae,MS)菌株DNA进行PCR扩增，得到了与预期大小相一致的580bp的PCR产物，而这对引物对其他畜病病原DNA或RNA模板的扩增结果为阴性，PCR方法对MG和MS的最小检出量分别为2pg和3pg，应用已建立的PCR方法检测MG人工感染样品和临床样品，从人工感染样品中均检测到MG，临床样品的MG阳性检出率为10．25％，高于常规分离培养的阳性检出率。     

鸡毒支原体弱毒F株与强毒株二重荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

研究根据基因库中鸡毒支原体(MG)S6毒株和F株的基因保守序列,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能鉴别鸡毒支原体(MG)强、弱毒株的二重荧光定量PCR检测方法,与其它禽类呼吸道病原体无交叉反应,对MG模板的灵敏度检测限为10拷贝/μL,对MG强弱毒模板以不同的浓度进行组合,仍可有效地检测到毒株,批内和批间重复变异系数小,特异性强、灵敏度高、稳定性好。研究建立的二重荧光定量PCR方法可用于MG强、弱毒株的鉴别检测,为该病的防控与净化提供良好工具。     

有PCR技术鉴定犬传染性肝炎病毒强、弱毒株的研究

根据Genebank中发表的犬传染性肝炎病毒（ICHV）标准强毒株Glaxo和人工驯化的弱毒疫苗株CLL的保守序列间大小不同，按照引物设计的原则，设计合成了一对通用引物，该对引物可由于ICHV强毒株扩增出569bp的片段，而弱毒株可扩增出244bp的片段，对PCR产物分别进行电泳，酶切和测序，证明PCR产物片段大小，酶切位点和苷酸序列与设计的产物完全一致。正常DK细胞上清和犬传染性喉气管炎病毒（CAV－2）强、弱毒株细胞培养物均不能被该引物扩增，说明具有良好的特异性，共检测到的病毒量分别为15TCID50、31TCID50，说明该技术具很高的敏感性，可用于ICHV强，弱毒株的鉴定和ICH的诊断。     

鸭瘟病毒强弱毒株PCR检测方法的建立

根据基因库中鸭瘟病毒强毒株和弱毒株UL2基因保守区设计特异性引物,优化PCR反应的引物浓度和退火温度等,初步建立了可同时鉴别鸭瘟病毒强毒株和弱毒株的PCR检测方法,并对建立的方法进行了敏感性、特异性验证和临床样品检测。该PCR检测方法最低能检出1pg的鸭瘟病毒强毒和弱毒DNA模板。对鸭瘟病毒强毒和弱毒模板的检测,得到了与试验设计相符的827bp(强毒)和299bp(弱毒)的扩增条带,而对鸭副黏病毒、鸭坦布苏病毒、鸭圆环病毒、番鸭细小病毒、鸭Ⅰ型肝炎病毒、禽流感病毒和小鹅瘟病毒等病原体的检测均为阴性。说明建立了一种敏感性高、特异性好的鉴别鸭瘟病毒强毒和弱毒的PCR检测方法。     

用PCR技术鉴定犬传染性肝炎病毒强、弱毒株的研究

根据Genebank中发表的犬传染性肝炎病毒 (ICHV)标准强毒株Glaxo和人工驯化的弱毒疫苗株CLL的保守序列间大小不同 ,按照引物设计的原则 ,设计合成了一对通用引物。该对引物可由ICHV强毒株扩增出 569bp的片段 ,而弱毒株可扩增出 2 4 4bp的片段。对PCR产物分别进行电泳、酶切和测序 ,证明PCR产物片段大小、酶切位点和核苷酸序列与设计的产物完全一致。正常DK细胞上清和犬传染性喉气管炎病毒 (CAV 2 )强、弱毒株细胞培养物均不能被该引物扩增 ,说明具有良好的特异性。其检测到的病毒量分别为 1 5TCID50 、 31TCID50 、说明该技术具有很高的敏感性。可用于ICHV强、弱毒株的鉴定和ICH的诊断     

鸡马立克病病毒强毒与疫苗毒PCR鉴别检测方法的建立

在Ⅰ型马立克病病毒(MDV)基因组中针对132 bp串联重复序列的两侧合成一对引物,应用PCR技术对临床病例采集的疑似马立克病肿瘤病变鸡肝组织和1日龄接种CVI988弱毒疫苗的健康雏鸡羽髓样本进行检测。结果表明,从临床病例采集的10份肝脏组织,7份扩增出一条314 bp的条带,相当于2个拷贝数的132 bp串联重复序列;在接种疫苗健康雏鸡的羽髓样本中,扩增出与CVI988弱毒一致的PCR图谱,相当于6个~8个或更多拷贝数的132 bp串联重复序列。根据PCR图谱的差异即可鉴别MDV强毒株与CVI988疫苗弱毒株。     

鉴别新城疫强、弱毒一步RT-PCR方法的建立及应用

设计2对引物分别用于新城疫强、弱毒的检测。使用强毒引物F1、R1可从NDV强毒株中特异性扩增出349bp的目的片段,使用弱毒引物F2、R2可从NDV弱毒株中特异性扩增出255bp目的片段,该方法对H9亚型禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)的检测结果均为阴性。灵敏性试验结果显示,该方法对NDV强、弱毒株的最小检出量分别为1pg和10pg。利用该方法对7份临床样品进行检测,结果与测序结果一致,说明该方法可用于新城疫强、弱毒的快速鉴别诊断。     

区分马立克氏病病毒疫苗株CVI988与其他毒株的PCR方法的建立及应用

利用马立克氏病病毒(MDV)疫苗毒CVI988株pp38基因上游启动子区域连续5个碱基的缺失(5′-AGCCG-3′),设计2对特异性引物,建立了能区分MDVCVI988株和MDV其他毒株的PCR诊断方法。该方法对8株MDV毒株(弱毒疫苗株CVI988和814,强毒参考株GA,超强毒参考株RB1B、Md5和Md11,特超强毒参考株648A及1个中国野毒株J-E)的PCR鉴定结果均与预期吻合。以16只疑为MDV感染鸡的脏器组织核酸提取物为模板,用所建立的PCR方法,能从其中7只鸡样品中扩增出特异性条带,其检测结果与细胞分离培养和单克隆抗体的检测结果一致。试验证实,本研究所建立的PCR诊断方法具有良好的特异性和敏感性。     

9株鸡毒支原体29 Ku多肽基因的克隆与序列分析

根据已发表的鸡毒支原体(MG)S6株29Ku多肽基因序列设计了1对引物,以9株(广西分离株5株、标准株4株)DNA为模板进行PCR扩增,均得到802bp的特异性片段,将9株MG PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体上,得到重组质粒.重组质粒经PCR法和EcorⅠ、SalⅠ双酶切等方法鉴定后,测定了9株29 Ku多肽基因序列,并在基因库中S6标准株的29 Ku多肽基因序列进行分析比较.结果表明,5株分离株与5株标准株29Ku多肽基因核苷酸序列同源性分别为94.4%～99.9%,推导的氨基酸同源性分别为89.7%～99.2%.从各毒株的进化分析表明,5个分离株与标准强毒株S6、A5969、K1501和PG31强毒株间遗传距离较近,而5个分离株与标准株F疫苗株间遗传距离则较远.     

鸡毒支原体与鸡滑液囊支原体双重PCR检测方法的建立

为建立能同时检测鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum, MG)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的双重PCR诊断方法,该研究根据GenBank中登录的MG gapA基因序列和MS heat shock ATP-dependent protease基因序列,设计2对特异性引物,通过对PCR扩增条件的优化,建立了能够同时检测MG和MS的双重PCR诊断方法。特异性检测结果显示,该方法能够扩增出729 bp的MG和309 bp的MS特异性片段,对禽巴氏杆菌、大肠杆菌、鸡白痢沙门菌、副鸡禽杆菌核酸扩增均为阴性;敏感性检测结果显示,对MG和MS DNA的最低检出量均为5×10^-2 ng/μL;临床样品的检测结果显示,所建立的双重PCR方法可同时有效地检测出MG、MS混合感染和单独感染。该研究建立的鸡毒支原体与鸡滑液囊支原体双重PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效检测MG和MS提供了技术支持。     

鸡毒支原体强弱毒株荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

为建立一种能鉴别鸡毒支原体(MG)强、弱毒株的快速检测方法,本研究根据GenBank中MG强毒株和弱毒株的基因组序列,选取特异性保守区序列设计了2对引物和2奈探针,分别用于强弱毒株和弱毒株的检测,优化反应条件,建立了能区分MG强、弱毒株的荧光定量PCR检测方法.该法特异性强,对鸡常见呼吸道病原体的反应均为阴性;灵敏度高,可检测到100拷贝/μL的模板;稳定性好,批内和批间试验Ct值的变异系数小.本研究建立的MG强、弱毒鉴别检测方法简便、快捷,为该病的防控与净化提供新方法、新思路.