棉铃虫羧酸酯酶基因cDNA的克隆、表达及活性分析

 【目的】克隆棉铃虫中肠羧酸酯酶基因,了解该酶的分子特性,为研究棉铃虫抗药性机理奠定基础。【方法】制备抗血清,对棉铃虫(Helicoverpa armigera (Hübner))中肠cDNA表达文库进行免疫筛选,得到编码棉铃虫羧酸酯酶基因的cDNA克隆,利用生物信息学软件和网站进行序列分析,构建原核表达载体进行表达,并以α-醋酸萘酯溶液为底物进行活性测定。【结果】测序分析表明,羧酸酯酶基因hc3(GenBank登录号：GU119888)全长2 896 bp,编码795个氨基酸。羧酸酯酶HC3的等电点pI为3.94,活性中心包括3个氨基酸残基(催化三联体)：Ser204, Glu331, His444;第545—773位包含大量高度重复的Gly,Asp、Glu(GDE区域)构成亲水区。该基因在大肠杆菌BL21中成功表达约100 kD的HC3蛋白,检测表达的羧酸酯酶活性为0.32 mmol/100 μL酶液。【结论】成功克隆、表达了棉铃虫羧酸酯酶蛋白HC3,并发现GDE亲水结构域。为进一步了解羧酸酯酶的三维结构及其水解作用并设计新型杀虫剂提供了可能。     

杜仲Fls基因的克隆及原核表达

【目的】克隆杜仲黄酮醇合成酶基因(Fls)全长,对其开放阅读框(ORF)进行原核表达分析。【方法】以杜仲叶片为材料提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆杜仲Fls基因;Fls基因的ORF经限制性内切酶酶切,构建其原核表达载体pET-28a-Fls;最后利用IPTG诱导Fls基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。【结果】获得了黄酮醇合成酶基因全长序列,长度为1 220bp,ORF为1 011bp,编码336个氨基酸;成功构建了原核表达载体pET-28a-Fls;利用IPTG诱导Fls在BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约44ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】获得了杜仲Fls基因的全长和ORF,并成功对其进行了原核表达。     

家蚕溶茧酶基因的克隆、序列分析及原核表达

【目的】获得家蚕溶茧酶基因的全长序列,实现溶茧酶基因在大肠杆菌中的融合表达。【方法】利用cDNA末端扩增技术（RLM-RACE）克隆了家蚕溶茧酶基因cDNA序列（GenBank 登录号：EF428980）。【结果】家蚕溶茧酶基因cDNA序列全长1 047 bp,其中780 bp的蛋白质编码区可编码260个氨基酸,预测蛋白质分子量为27.6 kD,等电点（pI）为8.89。家蚕溶茧酶基因包含4个内含子。用Signal P 3.0 Server程序分析家蚕溶茧酶基因,预测其从第1～22位为信号肽序列。SMART分析结果预测其第34～254位氨基酸序列具有类胰蛋白的丝氨酸蛋白酶活性。重组质粒pET-32a-Cocoonase 转化E.coli BL21进行原核表达,SDS-PAGE分析结果表明,家蚕溶茧酶基因以融合蛋白形式表达,相对分子量为48 kD。【结论】本研究成功地克隆、表达了家蚕溶茧酶基因,分析和预测了它的结构和功能,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。     

新疆加工番茄上南方番茄病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆南方番茄病毒(STV)的外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体并进行诱导表达,为制备检测该病毒的高效价血清提供参考。【方法】利用一步法RT-PCR从新疆加工番茄上克隆STVCP基因,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET-28a-STV CP。将重组质粒转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。【结果】成功克隆了STVCP基因,其长度为1 134bp。构建了原核重组表达质粒pET-28a-STV CP,其在1mmol/L IPTG诱导下,成功表达出分子质量约47ku的蛋白。【结论】成功克隆了STV CP基因,并诱导了pET-28a-STV CP重组蛋白的原核表达。     

茶树类黄酮O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达分析

【目的】克隆茶树（Camellia sinensis） 的一个类黄酮O-甲基转移酶基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究其酶学特性和调控茶树中甲基化类黄酮物质的代谢机理奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以从茶树叶片中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR与RACE克隆技术获得该基因cDNA全长,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。【结果】该基因cDNA全长为1 246 bp,其开放阅读框为1 077 bp,编码358个氨基酸,推测的蛋白分子量为40.2 kD,理论等电点为5.62;其核苷酸编码序列与葡萄和毛果杨的类黄酮O-甲基转移酶基因相似性分别为80%和81%;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。【结论】利用RT-PCR与RACE克隆技术从茶树叶片中克隆得到了一个类黄酮O-甲基转移酶基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。     

棉铃虫α-微管蛋白基因的克隆、序列分析及表达模式检测

【目的】克隆及序列分析棉铃虫（Helicoverpa armigera）α-微管蛋白基因的cDNA序列,并检测棉铃虫α、β两种微管蛋白基因的表达情况。【方法】以棉铃虫3龄幼虫为试验材料,采用RT-PCR及RACE技术克隆棉铃虫α-微管蛋白基因（HeTubA）,采用荧光定量PCR（QRT-PCR）技术分析棉铃虫α、β-微管蛋白基因在不同生长发育阶段及成虫器官中的表达模式。【结果】克隆得到棉铃虫α-微管蛋白基因（GenBank登录号为JQ069957）。序列分析表明,HeTubA开放阅读框1 353 bp,编码450个氨基酸组成的多肽,氨基酸序列包含多个α-微管蛋白保守区。与其它一些昆虫的一致性分析表明,HeTubA与八字地老虎（Xestia c-nigrum）、柑橘凤蝶（Papilio xuthus）及家蚕（Bombyx mori）的α-微管蛋白氨基酸序列同源性最高,α-微管蛋白基因在长期进化中非常保守。荧光定量PCR表明,棉铃虫α、β-微管蛋白基因不具有生长发育阶段及成虫器官特异性,且二者均在复眼表达高,腹部表达低;HeTubA在末龄幼虫期和蛹期高水平表达,HeTubB在末龄幼虫期和成虫期高水平表达。【结论】成功克隆了棉铃虫α-微管蛋白基因,对2种微管蛋白基因的表达模式进行了检测,进一步进行了蛋白质3D结构的构建,可用于深入研究2种微管蛋白基因的功能及开发新型杀虫剂。     

传染性造血器官坏死病病毒CJ-13株糖蛋白的原核表达及免疫原性

【目的】克隆传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)CJ-13株糖蛋白(G蛋白)基因,构建原核表达载体,并检测其在大肠杆菌BL21中的表达情况,为IHNV诊断试剂盒和疫苗的研制奠定基础。【方法】设计1对G基因特异引物对G基因进行RT-PCR扩增,将扩增产物克隆到pGEM-T Easy载体上,构建重组质粒pGEM-T Easy-G,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将G基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,构建传染性造血器官坏死病病毒G基因原核表达质粒pET-32a-G,转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法对表达产物进行分析。【结果】成功克隆了IHNV G蛋白基因,该基因长度为1 527bp。成功构建了原核表达质粒pET-32a-G,诱导表达出约76ku的产物,与预期分子质量大小相符。Western blot分析结果显示,所表达的G蛋白能够被小鼠抗IHNV血清识别。间接ELISA结果显示,小鼠抗G蛋白血清能够识别IHNV全病毒。【结论】成功构建了IHNV G蛋白原核表达系统,重组G蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。     

玉木耳漆酶基因Aclac的克隆及原核表达

【目的】对玉木耳漆酶基因Aclac进行克隆及原核表达分析,为深入研究漆酶基因在玉木耳子实体发育中的生物学功能提供理论依据。【方法】克隆Aclac基因的cDNA和DNA全长序列,对其进行生物信息学分析,并将目的基因连接至pET-28a质粒上以构建原核表达载体pET28a-Aclac,将其转化大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。【结果】克隆获得的Aclac基因cDNA序列长度为1734 bp,编码577个氨基酸残基;Aclac基因DNA序列长度为2521 bp,含14个内含子。AcLAC蛋白理论分子量为64.75 kD,理论等电点为5.70,不稳定指数为34.01,无跨膜区域,存在1个信号肽,在4个铜离子结合区高度保守,且含有Cupredoxin超家族蛋白保守功能域。AcLAC蛋白与真菌的漆酶蛋白聚为一支,其中,AcLAC蛋白与木耳属真菌的漆酶蛋白亲缘关系最近。AcLAC融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）表达宿主中成功表达,分子量为67 kD。【结论】克隆获得的Aclac基因属于Cupredoxin超家族基因,可在原核表达系统中异源表达,推测其与其他真菌漆酶基因在生物学功能上具有一致性,丰富了真菌漆酶资源。     

黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌外膜蛋白 A 的原核表达与纯化

【目的】克隆黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌外膜蛋白A(KpOmpA)基因,构建重组质粒并诱导其表达,纯化获取重组蛋白KpOmpA,为黄喉拟水龟抗肺炎克雷伯菌的相关疫苗研究奠定基础。【方法】以黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌DNA为模板,克隆获得KpOmpA基因后与pET-32a表达载体连接;将构建的重组质粒pET-32aKpOmpA转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,通过SDSPAGE电泳检测KpOmpA重组蛋白的表达情况,并对重组蛋白进行可溶性分析;经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化KpOmpA重组蛋白,应用Western blot方法鉴定纯化蛋白。【结果】KpOmpA基因CDS序列全长为1 071 bp,推定编码356个氨基酸,与其他肺炎克雷伯菌的OmpA氨基酸序列同源性超过99%,高度保守。重组质粒pET-32a-KpOmpA经双酶切、测序确认基因序列无移码或突变,表明重组质粒成功构建。转化后的BL21感受态细胞经终浓度为1 mmol/L IPTG在37℃下诱导4 h后进行SDS-PAGE检测,结果表明,KpOmpA重组蛋白大量表达,以包涵体形...     

华山新麦草α-醇溶蛋白基因的克隆及原核表达分析

 【研究目的】克隆华山新麦草（Psathyrostachys huashanica）的α-醇溶蛋白基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。【方法】采用同源克隆法从华山新麦草基因组DNA中分离克隆出α-醇溶蛋白基因并进行序列分析,将克隆的华山新麦草α-醇溶蛋白基因Gli-Ns-5克隆到表达载体pET-28a (+)上,获得重组质粒pET28a-Gli-Ns转化大肠杆菌BL21 (DE3)并诱导表达。【结果】从华山新麦草基因组DNA中克隆了4个α-醇溶蛋白基因：Gli-Ns-2 (FJ713595)、Gli-Ns-3 (GQ139525)、Gli-Ns-4 (GQ139526)和Gli-Ns-5 (GQ139527)。序列分析表明,4条序列具有α-醇溶蛋白基因的典型结构特征,含有8个或9个半胱氨酸残基,序列FJ713595为假基因。利用所构建的大肠杆菌表达载体,经IPTG诱导,华山新麦草α-醇溶蛋白基因Gli-Ns-5(GQ139527)可在原核系统中特异性表达。Western-blot证实融合蛋白可成功表达。【结论】克隆了4个华山新麦草的α-醇溶蛋白基因序列,基因Gli-Ns-5(GQ139527)可在原核表达系统中成功表达,为小麦品质改良提供了新的候选基因。     

斜纹夜蛾受翻译控制肿瘤蛋白基因的克隆及表达

【目的】克隆斜纹夜蛾受翻译控制肿瘤蛋白（TCTP）基因,分析其序列特征,为深入研究该基因奠定基础。【方法】利用RACE末端快速扩增技术,在斜纹夜蛾卵巢细胞中克隆TCTP基因的全长。根据不同物种间TCTP基因的同源性来构建进化树,并在原核细胞中对斜纹夜蛾TCTP进行表达。【结果】克隆得到斜纹夜蛾TCTP基因全长cDNA,登录号为HQ896486.1。序列分析表明,该基因cDNA全长829 bp,开放阅读框长519 bp,编码含172个氨基酸的蛋白,蛋白分子质量19.67 kD。生物信息学分析表明,斜纹夜蛾TCTP基因属于受翻译控制肿瘤蛋白家族,与其它物种TCTP基因有很高相似性。构建重组质粒 pET32a(+)-TCTP,在大肠杆菌中表达重组蛋白,确定了1 mmol•L-1 IPTG诱导4 h为重组蛋白表达的最佳条件,在短期内能得到大量稳定性好的TCTP蛋白。【结论】从斜纹夜蛾卵巢细胞中克隆得到斜纹夜蛾TCTP基因全长cDNA,并且成功在原核细胞中进行表达。本研究为深入研究斜纹夜蛾TCTP的功能以及针对斜纹夜蛾TCTP基因RNAi干扰的生物防控提供了理论依据和技术支持。     

大豆孢囊线虫果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5的克隆与分析

【目的】克隆和分析与大豆孢囊线虫寄生密切相关的果胶酸裂解酶新基因,为研究大豆孢囊线虫寄生和致病的分子机理提供依据,并为探讨大豆孢囊线虫的防控新途径提供理论基础。【方法】通过EST分析结合RACE-PCR扩增方法,从大豆孢囊线虫中克隆出1个果胶酸裂解酶新基因;通过原位杂交和半定量PCR的方法确定基因的表达部位和分析不同发育阶段的基因表达;采用Southern杂交方法分析基因的拷贝数。【结果】 从大豆孢囊线虫中克隆出1个全长为957个碱基编码227个氨基酸残基的新果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5（GenBank 登录号HQ123259）。Hg-pel-5 基因组由2个外显子和1个内含子组成。预测蛋白含有20个氨基酸残基的信号肽和4段细菌结构的果胶酸裂解酶第三家族的保守位点。原位杂交确定Hg-pel-5在大豆孢囊线虫亚腹食道腺中表达。半定量RT-PCR结果表明Hg-pel-5在寄生前和寄生过程早期的2龄幼虫大量表达。Southern杂交结果显示Hg-pel-5存在于大豆孢囊线虫基因组中并以多拷贝形式存在。【结论】对大豆孢囊线虫中1个新的果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5进行克隆和分析,表明该基因在大豆孢囊线虫早期寄生过程中发挥重要作用。     

鸭β-防御素9基因的克隆、组织分布及其原核表达

 【目的】从鸭组织中克隆鸭β-防御素9（AvBD9）基因,在原核表达重组鸭AvBD9蛋白;研究重组鸭AvBD9蛋白的体外抗菌活性与理化特性。【方法】采用RT-PCR法,从鸭肝脏组织中扩增鸭AvBD9基因,测定该基因在鸭各组织器官中的分布;将鸭AvBD9基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒pGEX-duck AvBD9,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达;亲和层析纯化蛋白,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定重组鸭AvBD9蛋白的体外抗菌活性与理化特性。【结果】从鸭肝脏组织中克隆得到鸭AvBD9基因,序列分析表明该基因大小为204 bp,前体肽包括67个氨基酸残基。AvBD9基因在鸭体内广泛分布。SDS-PAGE电泳表明鸭AvBD9基因在大肠杆菌中高效表达,表达的重组鸭AvBD9融合蛋白以包涵体的形式存在,分子量约31 kD。重组鸭AvBD9蛋白对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌有抗菌活性,在-70～100℃或pH 3～10处理30 min后仍有抗多杀性巴氏杆菌作用。【结论】鸭AvBD9基因为204 bp,编码67个氨基酸残基,在鸭组织中广泛分布。重组鸭AvBD9蛋白基因在大肠杆菌中高效表达,该重组蛋白具有广谱的抗菌活性,对温度和酸碱性有较高的稳定性。     

捻转血矛线虫Hc38重组蛋白的表达纯化及抗原性鉴定

[目的]通过表达和纯化捻转血矛线虫新功能基因He38最大开放阅读框ORF1,确定完整的Hc38蛋白天然表达形式、分子量大小和免疫学活性鉴定,为研究该基因功能和基因工程应用奠定基础.[方法]参照本实验室在GenBank上登录的捻转血矛线虫ZJ株的He38基因序列(AY594263)设计引物,PCR扩增目的基因并克隆到表达载体中,重组表达载体转化大肠杆菌后IPTG诱导表达,SDS-PAGE和薄层扫描检测分析表达产物,通过亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western bloting和ELISA方法检测其抗原性.[结果]Hc38基因在大肠杆菌中高效表达,表达的融合蛋白相对分子量约为68 KD,表达量占菌体蛋白总量的30;,亲和层析柱纯化出目的蛋白,并能被捻转血矛线虫病绵羊阳性血清和重组表达产物免疫小鼠血清识别,具有反应原性.[结论]实现了Hc38基因的原核表达和纯化,验证了Hc38基因在虫体内的表达形式和抗原性.     

米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因并检测其在大肠杆菌中的表达。【方法】以自行分离筛选出的天然米曲霉giF-10的基因组DNA为模板,PCR高保真扩增,扩增产物连接到pMD19-T克隆载体上,并构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)。【结果】序列分析表明,其长度为1 251bp,编码417个氨基酸,序列比对发现与内切葡聚糖酶基因CelB序列相似性高达100%,将此基因注册GenBank(HQ739052)。刚果红水解圈筛选结果表明已成功表达。【结论】克隆了米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因,并在大肠杆菌成功表达,为纤维素酶工业化生产奠定基础。     

米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因并检测其在大肠杆菌中的表达。【方法】以自行分离筛选出的天然米曲霉giF-10的基因组DNA为模板,PCR高保真扩增,扩增产物连接到pMD19-T克隆载体上,并构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)。【结果】序列分析表明,其长度为1 251bp,编码417个氨基酸,序列比对发现与内切葡聚糖酶基因CelB序列相似性高达100%,将此基因注册GenBank(HQ739052)。刚果红水解圈筛选结果表明已成功表达。【结论】克隆了米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因,并在大肠杆菌成功表达,为纤维素酶工业化生产奠定基础。     

鲤鱼春季病毒血症病毒磷蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆鲤鱼春季病毒血症病毒（SVCV）的磷蛋白（P蛋白）基因,并对其进行原核表达,为进一步制备SVCV-P蛋白单克隆抗体及建立新的SVCV诊断方法奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增SVCV P蛋白基因,将其克隆入pET-28a(＋)载体中,获得原核重组表达质粒pET28-P,进行原核表达。将该重组原核表达质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中,用0.4 mmol/L IPTG进行诱导表达,用镍亲和层析试剂盒对表达产物进行纯化,分别用SDS-PAGE和Western Blotting方法对表达产物进行鉴定。【结果】成功克隆了SVCV-P蛋白基因,该基因长度为933 bp。成功构建了原核重组表达质粒pET28-P,其诱导表达产物分子质量约为37 ku;表达的重组P蛋白可被SVCV阳性血清所识别。【结论】成功克隆了SVCV P蛋白基因,获得了分子质量约为37 ku的重组P蛋白。     

鹅β-防御素10基因的分离、鉴定与表达

【目的】从鹅的组织中克隆鹅β-防御素10（avian β-defensin 10,AvBD10）基因,通过大肠杆菌进行原核表达,检测重组鹅AvBD10蛋白的生物学特性。【方法】采用RT-PCR方法,从鹅的肾脏组织中扩增鹅AvBD10基因。根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建系统进化树,进行遗传进化分析;并应用荧光定量的方法对该基因的组织表达水平进行鉴定。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1 上进行原核表达,并对该重组蛋白进行纯化,测定体外生物学活性。【结果】从鹅肾脏组织中克隆出了鹅AvBD10基因,该基因的cDNA大小为207 bp,编码68个氨基酸。经遗传进化分析表明,该基因推导的氨基酸序列与鸭AvBD10的同源性最高,达92.7%。通过对重组蛋白抗菌活性的检测发现,该蛋白对12种致病性细菌均具有较强抑菌作用,但在高盐离子浓度下活性减弱。并且重组蛋白不具有溶血的特性。【结论】成功克隆并表达了鹅AvBD10基因,原核表达产物具有广谱的抗菌活性且不具有溶血特性。