斜纹夜蛾普通气味结合蛋白ⅠcDNA的克隆及在原核细胞中的表达

 【目的】克隆、序列分析和原核表达编码斜纹夜蛾（Spodoptera litura）GOBPⅠ（SlGOBPⅠ）的cDNA。【方法】采用同源克隆结合RACE的方法克隆SlGOBPⅠ基因的cDNA序列,并在 pET-32a/BL21（DE3）系统中进行原核表达。【结果】从斜纹夜蛾触角中克隆了GOBPⅠ的cDNA序列（GenBank登录号为EU086372）,序列分析表明,SlGOBPⅠ开放阅读框序列为495 bp,编码164个氨基酸,分子量为19.3 kD,等电点为5.54。SlGOBPⅠ具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即氨基酸序列中具有 6个半胱氨酸残基,呈酸性。SlGOBPⅠ氨基酸序列与鳞翅目昆虫的气味结合蛋白氨基酸序列具有较高的相似性,表明SlGOBPⅠ属于GOBP家族。将SlGOBPⅠ编码序列,克隆到表达载体pET-32 a上,构建原核表达载体pET-SlGOBPⅠ,在表达宿主菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导成功表达了相对分子质量为32.0 kD的可溶性融合蛋白,利用Ni2+-NTA亲和柱一步纯化了SlGOBPⅠ融合蛋白,以此融合蛋白免疫新西兰大白兔制备了SlGOBPⅠ的抗血清,ELISA滴度为1﹕5 000,Western印迹检测结果显示,SlGOBPⅠ抗血清与表达的融合蛋白质呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白保持原有的免疫原性。【结论】克隆、分析和表达了编码斜纹夜蛾气味结合蛋白GOBPⅠcDNA 序列,为今后深入研究斜纹夜蛾GOBPⅠ基因的结构和功能奠定了基础。     

中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2 cDNA的克隆及原核表达

 【目的】克隆、分析和原核表达编码中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2的cDNA。【方法】以13个不同日龄中华蜜蜂工蜂触角为材料,通过RT-PCR技术以获得编码中华蜜蜂Apis cerana cerana气味结合蛋白ASP2基因成熟蛋白开放阅读框序列,并在pET-30a（+）/BL21（DE3）系统中进行原核表达。【结果】克隆了命名为Acer-ASP2（GenBank登录号：DQ449667）的中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2基因,该序列全长429 bp,编码142个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为15.7 kD和4.36。预测蛋白具有昆虫气味结合蛋白典型的6个保守的半胱氨酸残基的特征,进一步分析表明Acer-ASP2极有可能属于GOBP家族。构建的原核表达载体pET/Acer-ASP2,在大肠杆菌BL21（DE3）中成功地表达出一个分子量约为21kD的融合蛋白,融合蛋白大部分以包涵体的形式存在于菌体沉淀中（约59.7%）,经洗涤和尿素梯度溶解对包涵体进行了纯化,经凝胶光密度扫描分析,约占最终产物的81.2％左右。【结论】克隆、分析和表达了一个新的编码中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2 cDNA序列,为进一步研究其分子结构和功能奠定了基础。     

棉铃虫信息素结合蛋白2 cDNA的克隆、表达与组织特异性表达

 【目的】克隆、分析和原核表达编码棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)信息素结合蛋白HarmPBP2的cDNA,并纯化得到HarmPBP2蛋白。【方法】以棉铃虫触角为材料,通过RT-PCR 技术以获得编码中棉铃虫信息素结合蛋白HarmPBP2 基因成熟蛋白开放阅读框序列,使用半定量RT- PCR对表达谱进行研究,并在使用pGEX-4T-1表达载体在BL21（DE3）系统中进行原核表达,使用GSTrap FF预装柱进行纯化并切去标签。【结果】克隆了命名为HarmPBP2（GenBank登录号：EU647241）的棉铃虫信息素结合蛋白基因,该序列全长457 bp,编码149 个氨基酸残基,前端是一段25个氨基酸长的信号肽,推测蛋白具有昆虫信息素结合蛋白典型的6 个保守的半胱氨酸残基的特征。棉铃虫HarmPBP2在雌雄成虫的触角、足和翅中都有表达,另外在雌虫下颚须也有表达。雌雄组织表达量顺序相同,触角中表达量最高,翅中次之,足中最少。雌虫组织中表达量高于雄虫。构建的原核表达载体pGEX/ HarmPBP2,在大肠杆菌BL21（DE3）中成功地表达出一个分子量约为40 kD的融合蛋白,经亲和层析纯化与酶切得到去标签的HarmPBP2蛋白。【结论】克隆、分析和表达了棉铃虫信息素结合蛋白HarmPBP2的cDNA序列,并对其进行纯化,为进一步研究其分子结构和功能奠定了基础,同时对其表达谱进行了研究。     

梨小食心虫普通气味结合蛋白2（GmolGOBP2）cDNA的克隆与原核表达

【目的】克隆梨小食心虫(Grapholita molesta)普通气味结合蛋白2(GmolGOBP2)的全长cDNA序列并进行原核表达,为研究该蛋白在梨小食心虫化学感受系统中的作用奠定基础。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆GmolGOBP2的全长cDNA序列,并使用原核表达载体pET-32a在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,用SDSPAGE和Western blot检测其表达情况。【结果】GmolGOBP2的cDNA全长序列为637bp(GenBank登录号:JN857940),开放性阅读框长度为483bp,编码161个氨基酸残基,成熟蛋白分子质量为15.98ku,等电点为4.85。GmolGOBP2预测蛋白的N末端具20个氨基酸残基组成的信号肽序列,并且氨基酸序列中具有6个保守半胱氨酸的典型气味结合蛋白家族标志。将GmolGOBP2编码序列重组到表达载体pET-32a中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达,SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,梨小食心虫普通气味结合蛋白基因在大肠杆菌中成功地表达出分子质量约为32ku的融合蛋白,与预测的融合蛋白分子质量大小一致。【结论】克隆并原核表达了GmolGOBP2的cDNA序列,可用于研究该蛋白分子结构及其在化学感受系统中的功能。     

鸡PLA2基因的克隆与原核表达及PLA2蛋白卵黄抗体的制备

【目的】克隆并原核表达鸡PLA2基因,小量制备鸡PLA2卵黄抗体,为大规模制备PLA2卵黄抗体作为饲料添加剂提供参考。【方法】提取鸡胰脏总RNA,利用RT-PCR方法获得鸡PLA2基因,将其克隆至pGEX-4T-1原核表达载体中,构建表达载体pGEX-4T-1-PLA2,转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-PLA2融合蛋白。将GST-PLA2融合蛋白免疫青年蛋鸡,每次0.3mg/只,共免疫4次,收集鸡蛋,提取卵黄抗体,采用West-ern Blotting检测抗体的特异性。【结果】成功克隆出了鸡PLA2基因,构建了pGEX-4T-1-PLA2原核表达载体,并诱导表达了分子质量为44.59ku的GST-PLA2融合蛋白。GST-PLA2融合蛋白免疫蛋鸡后获得了卵黄抗体,经West-ern Blotting检查,制备的卵黄抗体具有很好的特异性。【结论】构建了表达鸡PLA2基因的表达系统,并成功的制备了抗鸡PLA2的卵黄抗体。     

鸡PLAM2基因的克隆与原核表达及PLA2蛋白卵黄抗体的制备

【目的】克隆并原核表达鸡PLA2基因,小量制备鸡PLA2卵黄抗体,为大规模制备PLA2卵黄抗体作为饲料添加剂提供参考。【方法】提取鸡胰脏总RNA,利用RT-PCR方法获得鸡PLA2基因,将其克隆至pGEX-4T-1原核表达载体中,构建表达载体pGEX-4T-1-PLA2,转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-PLA2融合蛋白。将GST-PLA2融合蛋白免疫青年蛋鸡,每次0.3mg/只,共免疫4次,收集鸡蛋,提取卵黄抗体,采用West-ern Blotting检测抗体的特异性。【结果】成功克隆出了鸡PLA2基因,构建了pGEX-4T-1-PLA2原核表达载体,并诱导表达了分子质量为44.59ku的GST-PLA2融合蛋白。GST-PLA2融合蛋白免疫蛋鸡后获得了卵黄抗体,经West-ern Blotting检查,制备的卵黄抗体具有很好的特异性。【结论】构建了表达鸡PLA2基因的表达系统,并成功的制备了抗鸡PLA2的卵黄抗体。     

莫氏巴贝斯虫滑动体组件蛋白基因gap45、gap50、myo A 和mlc的克隆表达与多克隆抗体制备

【目的】克隆和表达莫氏巴贝斯虫滑动体组件蛋白GAP45(gliding associated protein 45, GAP45)、GAP50(gliding associated protein 50,GAP50)、肌球蛋白A（Myosin A, Myo A）和肌球蛋白轻链（myosin light chain, MLC）基因及制备兔源性多克隆抗体。【方法】利用末端快速扩增（rapid-amplification of cDNA ends, RACE）技术从莫氏巴贝斯虫裂殖子cDNA中扩增gap45、gap50、myo A及mlc基因,将获得的全长或基因的部分序列构建pGEX-4T-1原核表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）pLys中用IPTG诱导表达;融合蛋白经纯化后免疫家兔,制备多克隆抗体,并用ELISA测定抗体的效价及反应性。【结果】获得了gap45、gap50、myo A和mlc基因的全长分别为664、1391、773和2 538 bp,开放阅读框长度分别为567、1194、606和2 514 bp,制备的多克隆抗体具有较好的特异性,效价高于1:25 600。【结论】克隆了滑动体组件蛋白gap45、gap50、myo A和mlc基因的全长,并制备了多克隆抗体,为筛选巴贝斯虫疫苗和诊断用抗原和药物靶位、研究其生物学入侵机制奠定了基础。     

绿盲蝽化学感受蛋白基因AlucCSP1的克隆、表达谱分析及结合特征

 【目的】克隆、组织特异性表达以及荧光结合特征分析绿盲蝽 (Apolygus lucorum Meyer-Dür)化学感受蛋白（chemosensory protein,CSP）。【方法】设计特异性引物,用RT-PCR技术克隆绿盲蝽化学感受蛋白基因AlucCSP1,使用半定量RT-PCR和Real-time PCR技术对AlucCSP1组织特异性表达进行研究,在BL2（DE3）工程菌株中用pGEX-4T-1载体进行原核表达,并在GSTrap FF柱中纯化和去标签蛋白。使用bis-ANS作为荧光配基,研究AlucCSP1蛋白与58种气味标样和5种棉花次生代谢物质的结合特征。【结果】得到了绿盲蝽化学感受蛋白基因,命名为AlucCSP1（GenBank登录号：JN573217）。该序列阅读框全长393 bp,编码130个氨基酸残基,N端有一段长17个aa的信号肽,具有4个保守的半胱氨酸残基。绿盲蝽AlucCSP1几乎全部在雌虫触角中表达。构建pGEX/AlucCSP1原核表达载体,在BL21（DE3）工程菌株中表达出分子量约为39 kD的融合蛋白,用亲和层析法纯化、经凝血酶作用去除标签蛋白获得纯化的AlucCSP1蛋白,该蛋白与棉酚、单宁、槲皮素、芦丁水合物亲和力较强,结合常数分别为13.4、32.7、19.7、38.5 μmol•L-1。【结论】克隆得到绿盲蝽化学感受蛋白基因AlucCSP1,在雌性触角内特异表达,并进一步得到约13 kD的AlucCSP1纯蛋白。为研究AlucCSP1在绿盲蝽化学感器中的作用奠定了基础。     

短枝型苹果MdRGL基因的克隆及原核表达分析

【目的】克隆短枝型苹果（Malus domestica Borkh.）的MdRGL基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为明确短枝型苹果MdRGL基因与短枝芽变特性之间的关系奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以短枝型苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得短枝型苹果MdRGL的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。将克隆到的短枝型苹果MdRGL克隆到表达载体pGEX-4T-1上,构建融合表达载体pGEX-4T-MdRGL,转化到大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。【结果】从短枝型苹果中克隆到5条MdRGL基因：MdRGL1a/b、MdRGL2a/b和MdRGL3b。序列分析表明,除MdRGL3b外,另外4条序列都具有DELLA和VHYNP结构域。利用所构建的原核表达载体,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期蛋白大小一致。【结论】短枝型苹果中DELLA蛋白的克隆和原核表达的成功,为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定了试验基础。     

玉木耳漆酶基因Aclac的克隆及原核表达

【目的】对玉木耳漆酶基因Aclac进行克隆及原核表达分析,为深入研究漆酶基因在玉木耳子实体发育中的生物学功能提供理论依据。【方法】克隆Aclac基因的cDNA和DNA全长序列,对其进行生物信息学分析,并将目的基因连接至pET-28a质粒上以构建原核表达载体pET28a-Aclac,将其转化大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。【结果】克隆获得的Aclac基因cDNA序列长度为1734 bp,编码577个氨基酸残基;Aclac基因DNA序列长度为2521 bp,含14个内含子。AcLAC蛋白理论分子量为64.75 kD,理论等电点为5.70,不稳定指数为34.01,无跨膜区域,存在1个信号肽,在4个铜离子结合区高度保守,且含有Cupredoxin超家族蛋白保守功能域。AcLAC蛋白与真菌的漆酶蛋白聚为一支,其中,AcLAC蛋白与木耳属真菌的漆酶蛋白亲缘关系最近。AcLAC融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）表达宿主中成功表达,分子量为67 kD。【结论】克隆获得的Aclac基因属于Cupredoxin超家族基因,可在原核表达系统中异源表达,推测其与其他真菌漆酶基因在生物学功能上具有一致性,丰富了真菌漆酶资源。     

中国水仙锌指蛋白NtPLATZ1的克隆与表达分析

【目的】克隆中国水仙植物AT富集序列锌结合蛋白基因(NtPLATZ1),为研究该基因的生物学功能奠定基础。【方法】利用RACE技术克隆了NtPLATZ1cDNA全长,利用生物信息学方法分析其核苷酸及氨基酸序列,将NtPLATZ1与原核表达载体pGEX-4T-3连接,转化BL21并进行诱导表达,通过半定量PCR分析用多效唑处理后该基因在中国水仙不同生长时期叶片中的表达情况。【结果】NtPLATZ1的cDNA全长1 024bp,包含1个642bp的完整阅读框架,编码213个氨基酸;编码蛋白具有PLATZ superfamily蛋白保守区,与大豆(Glycine max,AII19314.1)PLATZ蛋白序列的同源性最高,为81%。原核表达结果表明,NtPLATZ1在大肠杆菌中能有效表达。半定量RT-PCR分析表明,喷雾多效唑后,NtPLATZ1基因在中国水仙不同生长时期叶片中的表达量先上升后下降,抽葶期叶片的表达量最高;喷雾清水后NtPLATZ1基因表达量先下降后又有所回升,抽葶期和始花期的表达量低于长叶期和盛花期。【结论】成功克隆了中国水仙NtPLATZ1基因,多效唑处理能明显诱导该基因的表达。     

草鱼Pim-1基因克隆、组织表达及多克隆抗体的制备

【目的】旨在进一步研究草鱼（Ctenopharygodon idella）莫洛尼鼠白血病病毒前病毒整合基因1(Proviral integration of moloney murineleukemia virus, Pim-1)的功能。【方法】采用RACE法克隆草鱼Pim-1(CiPim-1)的全长cDNA序列,并对其全长序列进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CiPim-1在健康草鱼肝脏、肾脏、头肾、脾脏、肠、心脏、鳃、皮肤、肌肉及血液中的相对表达量,同时将CiPim-1基因（246～318 aa）片段克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1中,转入E. coli Rosetta菌株,经IPTG诱导后成功表达重组蛋白pGEX-4T-1-Pim1,随后采用纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔获得抗血清,并通过ELISA测定抗血清效价,最后采用免疫印迹（Western Blotting）分析抗体的特异性。【结果】CiPim-1基因序列全长1 082 bp,编码318个氨基酸,分子量为36.14 ku,具有1个蛋白激酶结构域（Protein kinase domain...     

鼠源eIF4A1基因克隆及其原核/真核表达鉴定

【目的】克隆昆明小鼠真核生物翻译起始因子4A1基因（eIF4A1）并构建其原核/真核表达载体,探究其结构和生物学特性,为在体内外鉴定e IF4A1互作蛋白网络打下基础。【方法】以昆明小鼠脑组织总RNA反转录合成的cDNA为模板,PCR扩增鼠源e IF4A1基因编码区（CDS）序列,然后克隆到pGEX-4T-1和pcDNA3.0载体上分别构建原核/真核表达载体;利用大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞对原核表达载体进行诱导表达、纯化及鉴定;同时以真核表达载体转染HEK-293T细胞,通过Western blotting和间接免疫荧光（IFA）检测eIF4A1蛋白在HEK-293T细胞内的表达及分布情况;并以ProtParam、ProtScale、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件对鼠源eIF4A1蛋白进行生物学信息分析。【结果】鼠源eIF4A1基因CDS序列长1221 bp,克隆到pGEX-4T-1载体能成功构建原核表达载体pGEX-4T-eIF4A1-Flag,在25和30℃下经0.5 mmol/L IPTG诱导均能大量表达出融合蛋...     

弓形虫棒状体蛋白15的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

【目的】克隆弓形虫（Toxoplasma gondii）RH虫株速殖子的棒状体蛋白15(ROP15)基因,原核表达、纯化重组蛋白,并制备多克隆抗体。【方法】根据GenBank登录的弓形虫RH株ROP15(DQ096561.1)基因序列设计了1对引物,以提取的弓形虫RH虫株速殖子RNA为模板,通过RT-PCR获得该虫株的ROP15基因,将该基因连接至原核表达载体pGEX-4T-1上,获得重组质粒pGEX-4T-ROP15,测序结果与预期结果一致;转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导获得重组融合蛋白,运用亲和层析法纯化可溶性ROP15重组蛋白,SDS-PAGE对表达和纯化的目的蛋白进行分析。用纯化的ROP15重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,运用Western blot分析特异性。【结果】成功克隆了弓形虫RH虫株速殖子ROP15基因,大小为924 bp;菌液PCR和酶切鉴定表明重组质粒pGEX-4T-ROP15构建成功,获得了约59 ku的可溶性融合蛋白表达产物;以纯化的可溶性ROP15重组表达蛋白为抗原制备兔源性抗血清,Western blot显示该多克隆抗体与ROP...     

‘红肉脐橙’八氢番茄红素合成酶基因的克隆与原核表达

【目的】克隆、分析‘红肉脐橙’（Citrus sinensis Osbeck cv. Cara Cara）八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并进行原核表达。【方法】以‘红肉脐橙’果实中分离的mRNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA片段,并分析其序列;利用PCR技术获得‘红肉脐橙’PSY cDNA的编码区全长,并将其克隆到原核表达载体pET28a(+),获得重组质粒pET-CitPSY转化大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。【结果】‘红肉脐橙’PSY cDNA长1 520 bp,最大开放读码框为1 308 bp,可编码436个氨基酸,核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在75%和70%以上,并且发现‘红肉脐橙’PSY的N末端存在转运肽信号序列,成熟的PSY包含1个跨膜结构域。原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,Western-blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应,分子量约为52 kD。【结论】该研究为进一步开展柑橘果实色泽分子改良奠定了基础。     

薤白EPSP合成酶基因cDNA的克隆与原核表达分析

 【目的】揭示棉田杂草薤白（Allium macrostemon Bunge）抗草甘膦的分子机理,开发利用其草甘膦抗性特性。【方法】运用RT-PCR结合RACE技术,分离克隆了薤白中草甘膦作用的靶酶EPSP合成酶（EPSPs）基因cDNA,并将其构建成原核表达载体在大肠杆菌中诱导表达和鉴定其抗性。【结果】薤白EPSP合成酶基因cDNA序列全长1 821 bp,编码一段522个氨基酸的推导蛋白质。经BLAST及蛋白质结构预测,蛋白具有EPSPs的特征序列,并与已报道的EPSPs序列有高同源性,确认克隆的cDNA序列即是薤白EPSPs基因序列,命名为EPSPsA。将该cDNA与原核表达载体pRSET-A重组后,构建成重组表达质粒pRSET-A-EPSPsA,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导了目标蛋白的高效表达。经SDS-PAGE电泳分析显示,该蛋白的分子量约为55 kD,与预期大小一致。通过草甘膦对表达细菌处理,表达菌对草甘膦的抗性显著提高。【结论】薤白EPSPs对草甘膦具有一定抗性。     

欧李八氢番茄红素合成酶cDNA克隆、序列分析及在大肠杆菌中的功能表达

 【目的】克隆、分析欧李[Cerasus humilis（Bge）Sok]八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并利用大肠杆菌异源表达体系验证其功能。【方法】以欧李果实中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA中间片段,再利用RACE技术获得该基因cDNA全长并分析其序列;然后利用PCR技术获得欧李PSY cDNA编码区全长,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),获得重组质粒pET-ChPSY,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并利用工程菌株验证融合蛋白6×His-PSY的催化活性。【结果】欧李PSY cDNA全长1 559 bp,最大开放读码框为1 194 bp,可编码398个氨基酸,命名为ChPSY。核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在70%和65%以上,并且发现欧李PSY的N末端存在1—55个氨基酸残基组成的转运肽信号序列,在37—58和219—240氨基酸区域包含2个跨膜结构域。SDS-PAGE分析表明,原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,相对分子量约为45.8 kD。通过大肠杆菌异源表达证实ChPSY可编码一个功能蛋白,促进工程菌株中β-胡萝卜素含量增加。【结论】该研究成功地克隆了欧李PSY cDNA全长并在大肠杆菌中功能表达,为进一步研究该酶蛋白特性和欧李果实类胡萝卜素的合成机制奠定了基础。     

板栗过氧化氢酶基因CmCAT的克隆与原核表达

【目的】旨在克隆板栗CmCAT基因全长cDNA序列,分析其编码蛋白相关信息并进行原核表达研究。【方法】采用RT-PCR技术从板栗品种"石丰"中克隆获得CmCAT基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定的氨基酸序列进行分析。构建原核表达载体pET28a-CmCAT,经PCR和酶切鉴定后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。【结果】板栗CmCAT基因开放阅读框(ORF)为1 479 bp,共编码492个氨基酸,推测蛋白分子质量为56.883 kDa,理论等电点pI为5.83,GenBank登录号为KY312851。其核苷酸序列与核桃(Juglans regia)CAT基因序列相似性最高,为85%。遗传进化分析表明,板栗CmCAT与核桃的亲缘关系最近。SDS-PAGE电泳分析表明,在30℃条件下,0.2 mmol/L IPTG诱导6 h表达量最佳,诱导的目的蛋白分子量约为60 kDa,其主要以包涵体的形式存在。【结论】成功克隆了板栗CmCAT基因,并对其编码蛋白的理化性质进行了预测分析,在大肠杆菌中获得了大量的表达,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SotSPSB的克隆及原核表达

【目的】克隆甘蔗B家族s0心PsB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础。【方法】在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列。扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue－2上导入大肠杆菌BL21（DE3）中表达。【结果】通过比对B家族中进化关系很近的玉米（Zeamays）ZmSPS1和水稻（Oryzasativa）OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因（SolSPSB）2330bp序列。结合5’－RACE和3’－RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225bp的开放阅读框（0I江）;起始密码子（ATG）位于转录起始位点后56bp处,终止密码子（TGA）后有一段201bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm—SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94．7％和81．3％,氨基酸序列同源性分别为96．0％和83．9％;其理论分子量Mw=118．96kDa,等电点pI=6．30。经原核表达后纯化获得带6xHis标签的融合蛋白。【结论】克隆获得甘蔗B家族Sol-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SoPSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。     

杜仲Fls基因的克隆及原核表达

【目的】克隆杜仲黄酮醇合成酶基因(Fls)全长,对其开放阅读框(ORF)进行原核表达分析。【方法】以杜仲叶片为材料提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆杜仲Fls基因;Fls基因的ORF经限制性内切酶酶切,构建其原核表达载体pET-28a-Fls;最后利用IPTG诱导Fls基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。【结果】获得了黄酮醇合成酶基因全长序列,长度为1 220bp,ORF为1 011bp,编码336个氨基酸;成功构建了原核表达载体pET-28a-Fls;利用IPTG诱导Fls在BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约44ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】获得了杜仲Fls基因的全长和ORF,并成功对其进行了原核表达。