绵羊内皮生长因子siRNA载体构建及其在成纤维细胞中的表达

研究旨在构建绵羊血管内皮因子(VEGF)基因小干扰RNA(siRNA)载体并对其在成纤维细胞中的表达进行探索。实验构建了以VEGF基因片段为靶位点的3个siRNA质粒载体,即PGC-1、PGC-2、PGC-3,通过脂质体介导转染方法将干扰载体转入绵羊成纤维细胞中,利用ELISA测定3个干扰载体转染入成纤维细胞后细胞中VEGF的表达量。结果表明:各组转染后细胞中VEGF的表达量分别为47.78、24.45、8.36、13.99 pg/mL,转染载体PGC-2的成纤维细胞中VEGF表达量最少。上述结果说明,在绵羊成纤维细胞中可发生RNA干扰现象,且干扰载体PGC-2的干扰效率最高,RNA干扰技术有效改变了VEGF的基因表达。     

靶向akirin2基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效率的测定

为了抑制C2C12细胞中akirin2基因的表达,试验采用siRNA表达载体法构建了靶向akirin2基因的RNA干扰(RNAi)真核表达载体。首先针对akirin2基因设计并合成了相应的干扰序列,退火后将其与RNAi表达载体psiRNA-h7SKGFPzeo进行连接,构建成干扰载体akirin2-pshRNA0、akirin2-pshRNA1。将构建好的载体通过Turbofect转染试剂转染小鼠成肌细胞C2C12,通过荧光定量PCR检测其干扰效率,经酶切和测序鉴定所构建的akirin2基因RNA干扰载体与设计序列完全相符。结果表明:重组干扰载体akirin2-pshRNA0和akirin2-pshRNA1构建成功。将重组RNAi载体转染C2C12细胞,与正常对照组相比,转染akirin2-pshRNA1组的akirin2基因mRNA相对表达量显著降低,表达量下调了60.62%(P0.05)。说明试验构建的靶向akirin2基因的RNAi载体akirin2-pshRNA1可以有效地抑制C2C12细胞中akirin2基因的表达。     

基于CIRP基因有效干扰靶点的筛选

为了研究冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)更深入的功能及意义,试验通过Lipo FiterTM将黑龙江八一农垦大学动物生理生化实验室之前已构建好的5组RNA干扰重组载体及空载体分别瞬时转染到大鼠肝细胞中,提取细胞RNA经反转录后进行荧光定量PCR试验,获得各组干扰载体对CIRP基因干扰后CIRP基因mRNA的相对表达量,确定效果最佳的干扰靶点。结果表明:在5组干扰试验组CIRP基因mRNA的表达量中,264组与空白对照组的表达量差异显著(P0.05),并且干扰效率达到70%以上;阴性对照组(空载体组)与空白对照组的表达量基本相同,差异不显著(P0.05)。说明试验成功筛选出有效干扰靶点。     

猪skMLCK基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率测定

为了构建猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(sk MLCK)基因有效短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体,筛选出最佳干扰效率的序列,采用RNAi技术,设计并合成3条siRNA干扰序列,插入到慢病毒穿梭质粒(h U6-CMV-puror-Ploy A)上,与慢病毒包装系统共转染293T细胞,收集病毒上清并进行病毒滴度的测定,将其转染小鼠C2C12细胞,分别用实时定量PCR和Western blot方法检测细胞中sk MLCK基因mRNA和蛋白的表达。结果显示:PCR扩增和测序分析结果显示靶向sk MLCK RNAi慢病毒载体构建成功;转染小鼠C2C12细胞后,sk MLCK基因mRNA和蛋白均受到不同程度抑制,实时定量PCR显示,抑制率分别为(29.2±4.43)%、(76.4±7.33)%、(20.0±1.8)%;Western blot显示,抑制率分别为(29.6±5)%、(42.4±1.6)%、(34.3±1.2)%。结论:成功构建猪sk MLCK基因有效shRNA的慢病毒载体,确定干扰载体-2(sk MLCKRNAi-2)具有最佳干扰效果,证实sk MLCK基因RNAi慢病毒载体能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为进一步研究该基因与肌肉肉质性状的关系奠定了基础。     

MEF2C基因RNA干扰质粒的构建及干扰效率测定

为了构建猪MEF2C基因的RNA干扰重组质粒,并筛选出最佳干扰效率的序列,本试验采用RNAi技术,设计并合成了3条针对猪MEF2C基因的RNA干扰序列,构建了RNA干扰重组质粒(命名为siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3),将其转染到小鼠C2C12细胞,并用实时定量PCR检测细胞中MEF2C基因mRNA的表达,Western blot测定细胞中MEF2C基因蛋白的表达。结果表明:重组质粒经PCR扩增后显示产物大小与预期一致,产物经双酶切及测序鉴定该序列与NCBI提供的序列一致。重组质粒转染C2C12细胞后,MEF2C基因mRNA表达受到不同程度抑制,抑制率分别为(33.67±2.51)%、(21.00±3.60)%、(71.67±4.04)%。Western blot结果表明MEF2C基因蛋白表达受到不同程度抑制,抑制率分别为(47.33±0.05)%、(38.25±0.16)%、(67.27±0.12)%。本试验成功构建猪MEF2C基因干扰重组质粒,最终确定干扰质粒(siRNA-3)具有最佳干扰效果,证实MEF2C基因的干扰质粒能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为探讨该基因与肌肉肉质性状的关系提供理论基础。     

RNA结合蛋白QKI抑制ST细胞凋亡的研究

QKI是信号转导与RNA激活家族(STAR)成员之一,是进化保守的调控蛋白。其KH结构域能与RNA上的quaking反应元件(QRE)结合,参与调控RNA的运输、翻译、剪切、稳定等过程,从而影响细胞增殖、分化、凋亡等。本试验探究QKI是否对猪睾丸成纤维细胞(ST细胞)凋亡存在影响。构建pEF1α-QKI过表达载体,采用qRTPCR、Western blot方法检测QKI及目的基因BCLAF1的mRNA和蛋白的表达量,用流式细胞术检测过表达QKI对ST细胞凋亡的影响。结果显示:转染pEF1α-QKI质粒在ST细胞中可显著提高QKI mRNA的表达量(P<0.01),并且与对照组相比能显著降低BCLAF1mRNA和蛋白的表达量(P<0.05);流式细胞术检测细胞凋亡率证明过表达QKI具有抑制ST细胞凋亡的作用(P<0.05)。结果表明:在ST细胞中过表达QKI能够抑制BCLAF1基因的表达,并且降低ST细胞凋亡率。     

RNAi表达载体对avUCP基因表达的抑制作用

研究RNA干扰（RNA interference,RNAi）表达载体对UCP基因的抑制作用。针对鸡解耦联蛋白（avianuncoupling protein,av UCP）基因,构建4种RNAi质粒表达载体（分别称为A、B、C和D号载体）。再经过脂质体法转染成肌纤维细胞,应用荧光定量PCR及流式细胞术检测其对av UCP mRNA及蛋白表达的影响。构建的4种表达载体均抑制了av UCP的mRNA及蛋白的表达,其中转染C号载体的成肌纤维细胞av UCPmRNA表达相当于空白对照组的14.6%,蛋白抑制率达93.7%。RNAi表达载体可以有效的抑制avUCP基因的表达。     

牛HSL基因shRNA干扰载体的构建及筛选

HSL基因所编码的激素敏感性脂酶对脂质代谢具有重要的调控作用,不仅能催化水解脂肪组织中的甘油三酯,还能水解不同组织的胆固醇酯,在机体能量供应和类固醇生成中发挥重要作用。为进一步研究HSL基因功能,本试验设计并构建4个HSL基因shRNA干扰载体,并将干扰载体转染到牛胎儿成纤维细胞中以及和设计构建过表达载体共转染到293T细胞中,转染48 h后,分别检测细胞内牛HSL基因的mRNA和蛋白质表达水平,筛选出具有较高干扰效率的shRNA表达载体。结果表明,在牛胎儿成纤维细胞中,4个shRNA载体在转染48 h后,shRNA-731组细胞中HSL基因的mRNA表达量显著低于shRNA NC对照组(P0.05),且干扰效率最佳;同时,在shRNA载体与过表达载体共转染293T细胞中,HSL基因的mRNA和蛋白表达水平显著低于shRNA NC对照组(P0.05)。本研究为进一步探讨HSL基因功能提供了有效工具,也为研究其与牛脂肪代谢相关关系奠定了理论基础。     

牛PSMA5基因RNA干扰载体的构建与筛选及在奶牛乳腺上皮细胞中的表达

设计4条待选的shRNA序列以及1条阴性对照序列,构建RNA干扰载体,然后转染到奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)中,最后利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术分别检测蛋白酶体α5亚基(PSMA5)在奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)中mRNA和蛋白水平的表达。结果显示:转染shRNA-1组,shRNA-3组和shRNA-4组的PSMA5基因相对表达量显著低于阴性对照组(P0.05),且shRNA-4组的PSMA5基因相对表达量最低。结果表明:本试验成功构建并筛选出了PSMA5基因RNA干扰载体,并在奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)中成功表达。     

小鼠IGFBP-6基因shRNA的设计与筛选

胰岛素样生长因子结合蛋白6(IGFBP-6)是胰岛素样生长因子结合蛋白家族(IGFBPs)的一员,IGFBP 6不同于IGFBP1 5,其与IGF-2的亲和力显著的优先于IGF-1,受到研究者的广泛关注.本研究在小鼠IGFBP-6基因mRNA的806、760和908 bp处找到潜在靶位点,设计3条shRNA干扰载体,并合成DNA Oligo,体外退火成双链DNA,插入pGU6/GFP/Neo载体,获得3条针对目的基因不同靶序列的干扰载体,瞬时转染NIH-3T3小鼠胚胎成纤维细胞48 h后,利用流式细胞技术分选收集转染重组载体的细胞,提取细胞总RNA和蛋白质,实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附法分别检测目的基因mRNA水平,蛋白水平对IGFBP-6的表达.结果表明,IGFBP-6(IGFBP-6,806-826)表现出了最高的干扰效率,转染效率为(79.2±2.3)％时,mRNA水平的沉默效率达(68.9±12.2)％,(P＜0.05);蛋白质水平的沉默效率达(46.7±11.3)％,(P＜0.05).本试验为研究IGFBP-6基因对细胞增殖的作用和体内生物学功能奠定了基础.     

乳腺癌细胞(MCF-7)内参基因的选择

将稳定转染了真核表达载体pcDNA V5 HisB-rib-esp的乳腺癌细胞(MCF-7)和正常传代细胞分别于10%和20%胎牛血清(FBS)的DMEM条件下培养,连续传代3次以上。运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测上述4种细胞样品中5种常用看家基因3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、肌动蛋白(β-actin)RNA聚合酶Ⅱ(RPⅡ)、β2微球蛋白(β2-M)、18S核糖体RNA(18SrRNA)的mRNA稳定表达情况,并使用geNorm程序对其稳定性进行评价确定需要的内参基因数目,以选择转染过程中表达最稳定的内参基因。结果表明,5种看家基因表达稳定度M值的排序为:RPⅡ=18SrRNA>β2-M>β-actin>GAPDH,需要2个内参基因(RPⅡ和18SrRNA)共同校正目的基因的表达。RPⅡ和β2-M分别是不同血清下和转染前后表达最稳定的内参。     

从江香猪PHKG2基因超表达载体和RNA干扰载体的构建及其表达

旨在克隆从江香猪磷酸化酶激酶γ2(phosphorylase kinase gamma 2,PHKG2)基因编码区,并对PHKG2基因功能进行初步探究。本研究利用RT-PCR法扩增从江香猪PHKG2基因完整CDS区。通过构建pEGFP-N3-PHKG2超表达载体,设计并合成4对针对从江香猪PHKG2基因的RNAi表达载体,瞬时转染至C2C12细胞株和从江香猪肾细胞中,以正常生长的细胞为空白对照,24h后检测各个重组载体的绿色荧光蛋白的表达情况。48h后提取细胞总RNA,利用qRT-PCR方法检测目的基因PHKG2和糖原代谢相关基因糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase,muscle form,PYGM)、肌肉糖原合成酶(glycogen synthase 1(muscle),GYS1)、磷酸甘油酸变位酶(Phosphoglyce rate mutase,PGAM2)基因mRNA的表达情况,并且测定各组细胞中的糖原含量。结果表明,经过双酶切、测序检测以及脂质体瞬时转染至C2C12细胞中,验证超表达载体pEGFP-N3-PHKG2和4对RNAi表达载体均构建成功。转染至从江香猪肾细胞后,相对于空白对照(Blank)和阴性对照(pEGFP-N3),超表达载体pEGFP-N3-PHKG2能极显著提高PHKG2基因的表达量(P0.01),同时显著上调PGAM2、PYGM基因的表达量(P0.05),并且显著降低细胞中糖原的含量(P0.05)。各RNAi载体中,相对于空白对照(Blank)和阴性对照(NC),shRNA-1的干扰效率较高,极显著下调PHKG2基因的表达量(P0.01),显著下调PGAM2、PYGM、GYS1基因的表达量(P0.05),并且显著升高细胞中糖原含量(P0.05)。shRNA-2极显著下调PHKG2基因的表达量(P0.01);shRNA-3对PHKG2基因的表达也能起到显著的干扰作用(P0.05);shRNA-4对于所检测的4个基因干扰效果不明显;shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4转染细胞后,细胞中糖原含量升高水平不明显。PHKG2基因超表达和RNAi后可分别明显上调和抑制PHKG2、PYGM、PGAM2、GYS1基因的表达,并且分别降低和提高糖原含量,可能是影响从江香猪猪肉品质的重要候选基因,为进一步研究PHKG2基因在细胞糖原代谢通路中的作用机制奠定基础。     

RNA干扰DGAT1和DGAT2在猪肝细胞和肌内前体脂肪细胞中表达的研究

本研究旨在探索DGAT1和DGAT2基因表达对猪脂肪沉积效率的影响。以3日龄宗地花猪为实验动物,针对DGAT1和DGAT2基因m RNA序列设计6对sh RNA序列,构建RNA干扰表达载体,将DGAT1和DGAT2的sh RNA干扰载体分别转染至猪的肝细胞和肌内前体脂肪细胞中,采用RT-q PCR筛选出肝细胞和肌内前体脂肪细胞中的最佳sh RNA干扰载体,将最佳干扰载体再次转染肝细胞和肌内前体脂肪细胞,测定细胞代谢液中甘油三酯和总胆固醇含量变化。结果表明:所构建的干扰载体对肝细胞中DGAT1和DGAT2基因的最高抑制效率分别为78.45%和87.52%,对肌内前体脂肪细胞中DGAT1和DGAT2基因的最高抑制效率分别为82.24%和89.82%;肝细胞和肌内前体脂肪细胞培养液中甘油三酯和总胆固醇的含量均降低,其中转染p GPU6/GFP/Neo-DGAT2-1实验组的肝细胞培养液中甘油三酯含量显著低于空白组(P0.05)。结果提示,抑制DGAT1和DGAT2基因的表达,可降低猪肝细胞和肌内前体脂肪细胞代谢液中甘油三酯和总胆固醇的含量。     

过表达和干扰GDF9基因对番鸭颗粒细胞凋亡和周期的影响

实验旨在探究生长分化因子9(Growth Differentiation Factor,GDF9)基因对番鸭颗粒细胞的影响，本研究构建了GDF9过表达载体（pEX-2-GDF9）以及干扰GDF9小RNA (siRNA-GDF9-530、siRNAGDF9-978、siRNA-GDF9-1320)，分别转染至原代番鸭颗粒细胞内，通过流式细胞术检测GDF9基因对细胞周期和凋亡的影响；荧光定量PCR技术检测转染后颗粒细胞周期和凋亡相关基因的表达量。结果显示，过表达GDF9基因将番鸭颗粒细胞阻滞在G0/G1期，S期细胞极显著减少，且Bax基因和Caspase-3基因表达量极显著（或显著）上调，说明过表达GDF9促进了颗粒细胞凋亡；干扰GDF9基因表达后，G0/G1期细胞极显著减少，S期细胞极显著增加，且CDK-2、Bcl-2、CCND1 mRNA极显著上调，CCNE1 mRNA显著上调。综上可知，GDF9基因表达促进颗粒细胞凋亡、抑制细胞周期进程。该结果可为番鸭的卵泡发育机制研究提供理论基础。     

chTERT基因小干扰RNA对马立克氏病MDCC-MSB1细胞端粒酶活性的影响

本研究利用小干扰RNA技术探讨端粒酶催化亚单位对鸡马立克氏病MDCC-MSB1细胞端粒酶活性的影响。构建以chTERT基因为靶点的3个RNA干扰载体pRNAT-chTERT-siRNA,筛选并鉴定。利用脂质体转染MDCC-MSB1细胞48 h后,TRAP-PCR-ELISA法定量检测细胞端粒酶活性,并进一步筛选出最有效的小干扰RNA载体。结果显示:转染干扰载体的MDCC-MSB1细胞端粒酶活性逐渐降低,其中干扰载体pRNAT-chTERT-II转染后抑制效果最明显(0.01)。     

质粒介导的siRNA对犬细小病毒复制的影响

RNA干扰(RNAi)是指短的双链RNA能降解与其互补mRNA,特异性诱发转录后基因沉默的现象,近年来成为抗病毒研究的新途径。为了探索siRNA对单链DNA病毒复制的影响,根据犬细小病毒(CPV)基因组序列选择4段21nt的保守序列设计4对SiRNA寡聚核苷酸,插入psiSTRIKE系列的U6发卡结构载体,构建了小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的psiSTRIKE表达载体,转染FK81细胞,筛选稳定的转染细胞,通过病毒感染检测、细胞活度测定和TCID50测定,研究质粒介导的siRNA对CPV复制的影响。结果表明,构建的4个psiSTRIKE表达载体转染细胞后,能够不同程度地抑制病毒在宿主细胞内的复制。因此质粒介导的shRNA能抑制CPV在细胞内的复制和感染,具有抗病毒作用,从而为进一步通过siRNA途径控制病毒奠定基础。     

RNA聚合酶Ⅱ启动子驱动的长双链RNA干扰载体的构建与验证

为了探索构建由RNA聚合酶Ⅱ型启动子驱动、能有效避免干扰素反应的表达长双链RNA的RNA干扰载体,试验在转录单元两端各添加了一个自剪切核酶序列,在转录后切成RNA出核所必要的5’帽子和3’polyA尾,以绿色荧光蛋白(EGFP)基因为报告基因插入2个核酶之间作为试验载体,以表达红色荧光蛋白基因的载体作转染效率校准,通过瞬间转染对荧光蛋白的表达情况进行观察和RT-PCR分析。结果表明:在转染效率基本一致的情况下,试验组未观察到绿色荧光;2个核酶能够完全自剪切,试验组细胞质中有EGFP mRNA的存在,但与正常对照组相比下降了46.1%。说明研究设计的载体达到了延迟表达RNA出核的目的,为用该载体表达长双链RNA时在其出核之前被Dicer酶有效切割成小双链RNA从而避免其出核引起干扰素反应提供了时间保障。     

FDFT1基因shRNA和过表达载体的构建及在牛胎儿成纤维细胞中的验证

构建了带有绿色荧光标记的法尼基二磷酸法尼基转移酶1(farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1,FDFT1)基因shRNA干扰载体以及过表达载体,将其转染牛胎儿成纤维细胞(bovine fetal fibroblasts,BFF),采用荧光定量PCR和Western blot的方法,检测FDFT1基因mRNA和蛋白的表达水平,在细胞水平验证了shRNA干扰载体的干扰效率和过表达载体的有效性。结果显示:shRNA组FDFT1-Bos-520的FDFT1基因mRNA表达水平降低至shRNA NC组的40.7%(P0.01),蛋白质表达水平降低至shRNA NC组的39.61%(P0.01);而FDFT1基因pBI-CMV3-FDFT1过表达组FDFT1基因mRNA的表达水平为pBI-CMV3空载体组的137.9倍(P0.01),蛋白表达水平升高至空载体组的2.34倍(P0.01)。本试验通过荧光定量PCR和Western blot的检测方法验证了FDFT1基因过表达载体及干扰载体转染BFF后,FDFT1基因表达量的变化,为进一步研究FDFT1基因对胆固醇代谢和脂质代谢的影响和作用机制提供了实验材料及分子依据。     

靶向抑制MAP3K1对小鼠乳腺癌细胞生物学行为的影响

为了在细胞学水平研究靶向抑制MAP3K1(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1)基因对小鼠乳腺癌4T1细胞黏附、运动及侵袭能力等生物学行为的影响,试验用体外构建靶向"沉默"MAP3K1基因的amiRNA(artificial microRNA)干扰载体,以X-treme GENE HP转染4T1细胞(干扰组转染amiRNA干扰载体,对照组转染空载体,空白组未转染质粒)对MAP3K1基因mRNA及蛋白表达水平进行检测,以测定干扰效率;分别以黏附试验检测小鼠乳腺癌4T1细胞的黏附能力,用划痕-愈合试验与Transwell侵袭试验测定小鼠乳腺癌4T1细胞的运动与侵袭能力。结果表明:小鼠乳腺癌4T1细胞转染MAP3K1 amiRNA-3干扰载体与空载体后,干扰4T1细胞MAP3K1 mRNA水平及蛋白水平均被有效抑制,干扰效率高达70%(P0.01)。试验组4T1细胞黏附能力极显著低于对照组(P0.01);干扰组4T1细胞的运动与侵袭能力均显著低于对照组(P0.05)。说明构建的amiRNA干扰载体能够有效抑制靶基因MAP3K1的表达,并能够显著抑制小鼠乳腺癌4T1细胞的黏附、运动与侵袭能力;靶向抑制MAP3K1基因能够广泛地影响小鼠乳腺癌4T1细胞的生物学行为。     

腺病毒介导shRNA干扰绵羊MSTN基因效果及对生肌调节因子和干扰素反应基因表达的影响

旨在进一步揭示MSTN在绵羊成肌细胞中的调控机制,制备可有效失活MSTN基因的工具,为通过RNA干扰技术提高绵羊产肉量提供方法和理论依据。本研究以绵羊成肌细胞为试验材料,构建特异靶向绵羊MSTN基因的shRNA干扰质粒载体,将干扰效果好的质粒进一步包装为重组腺病毒,转染细胞后采用qRT-PCR和Western blot检测MSTN基因以及生肌调节因子和干扰素反应基因的表达。结果表明,质粒ShR218和ShR511干扰MSTN基因效率分别达到35%和48%,双元干扰质粒ShR3+4干扰效率最高达到85%。成功包装shRNA重组腺病毒载体Sh511和Sh3+4,病毒滴度达到1×10~8 pfu·mL~(-1),对成肌细胞的感染效率达到90%以上。Sh511和Sh3+4对MSTN基因mRNA的表达抑制分别达到53%和76%,对蛋白表达抑制分别达到55%和64%。MSTN基因沉默后,伴随着Myf5、MyoD、MyoG、Myf6基因mRNA水平的极显著性下调(P0.01),但只引起MyoG蛋白水平极显著升高(P0.01),未引起Myf5、MyoD、Myf6蛋白水平的显著变化;腺病毒感染成肌细胞未引起OAS1基因mRNA水平的显著变化,但引起IFNGR1基因mRNA水平的极显著升高(P0.01),对二者蛋白水平均无显著影响。本研究成功构建靶向MSTN基因的shRNA腺病毒载体,能有效抑制成肌细胞MSTN的mRNA和蛋白表达,并影响生肌调节因子Myf5、MyoD、MyoG、Myf6基因和干扰素受体基因IFNGR1表达。